李夢君，喬戰(zhàn)科，劉向哲，孫永康，冉春龍，白 琛，方曉艷

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病一區(qū)，河南 鄭州 450000；3.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046)

缺血性卒中(ischemic stroke，IS)是由高血壓、糖尿病、高脂血癥及體內(nèi)高凝狀態(tài)等多種危險因素導(dǎo)致腦血流量降低、腦部缺血缺氧引發(fā)神經(jīng)功能缺損的一種疾病[1,2]。根據(jù)中國2019年流行病學(xué)調(diào)查顯示，缺血性卒中的發(fā)病率、患病率、復(fù)發(fā)率、死亡率逐年攀升，總體發(fā)病風(fēng)險仍位居世界首位[3]，這種持續(xù)上升的形勢依然嚴(yán)峻。健脾補腎活血方(Jianpi Bushen Huoxue Prescription，JPBSHXP)由河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病專家團隊擬定，已在臨床應(yīng)用十余年。該方針對缺血性卒中本虛標(biāo)實的基本病機，以健脾補腎，活血通絡(luò)為治療原則。方中黃芪、黨參、白術(shù)健脾益氣；牛膝、杜仲、桑寄生、肉蓯蓉補腎固本；丹參，川芎活血通絡(luò)；石菖蒲化痰開竅；炙甘草調(diào)和諸藥。前期研究表明，JPBSHXP可提高缺血性卒中患者腦缺血區(qū)灌注水平，減輕神經(jīng)功能缺損，改善中醫(yī)證候、臨床癥狀和體征，提高日常生活能力[4]，但其作用機制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是從分子層次闡釋中藥方劑作用原理的有效方法，本文旨在應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析方法，通過靶點的篩選、通路分析以及分子對接技術(shù)，為驗證該方治療IS的有效性提供合理依據(jù)，同時為此方進一步研究提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料本文所需數(shù)據(jù)庫及相關(guān)應(yīng)用程序，如Tab 1。

Tab 1 Related databases and application software

1.2 方法

1.2.1健脾補腎活血方化學(xué)成分及靶點的獲取 利用TCMSP中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫及分析平臺檢索健脾補腎活血方11味中藥的有效活性成分及對應(yīng)靶點信息，根據(jù)藥代動力學(xué)參數(shù)吸收、分布、代謝和排泄(ADME)的原則，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，類藥性(Drug-like，DL)≥0.18為條件篩選潛在化合物，OB、DL越高，說明藥物在體內(nèi)發(fā)揮效能的作用越強[5]。使用Perl語言將11味中藥整理合并，得到健脾補腎活血方的中藥-活性成分-靶點的總體信息表。

1.2.2收集疾病靶點及預(yù)測藥物作用靶點 通過Genecards、OMIM、DrugBank、TTD、PharmGkb五種疾病數(shù)據(jù)庫，以“Ischemic stroke”為關(guān)鍵詞，查找IS的疾病基因靶點，用R語言程序?qū)⑵浜喜?；Genecards數(shù)據(jù)庫獲取基因分值越高與疾病相關(guān)性越強，選擇分值大于1與IS相關(guān)性高的靶點進行研究；在Uniprot平臺將所有關(guān)于人的及被證實的基因下載，并通過perl語言將藥物靶點轉(zhuǎn)換為基因ID編碼的形式；取藥物和疾病的共同靶點并繪制venn圖，預(yù)測藥物靶點。

1.2.3中藥復(fù)方網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 設(shè)計perl語言程序?qū)∑⒀a腎活血方與缺血性卒中相同靶點進行整理，應(yīng)用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建JPBSHXP-活性成分-靶點和IS相互作用的調(diào)控信息網(wǎng)絡(luò)圖，應(yīng)用拓撲插件計算介數(shù)中心性(betweenness centrality，BC)，緊密中心性(closeness centrality，CC)，度值(degree centrality，DC )，特征向量中心性(eigenvector centrality，EC)，局部平均連通度中心性(local average connectivity centrality，LAC)，通過DC、BC篩選該方核心活性成分。

1.2.4蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過String平臺構(gòu)建PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，將藥物與疾病交集所得到的190個基因?qū)隠ist Of Names，設(shè)置highest confidence為0.9，去除游離靶點后得到170個靶點，應(yīng)用Cytoscape3.8.0進行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，拓撲參數(shù)取大于BC、CC、DC、EC、LAC的中位值得到核心靶點。

1.2.5GO 功能分析和KEGG信號通路富集分析 應(yīng)用David數(shù)據(jù)庫進行GO分析及KEGG信號通路富集分析，根據(jù)P值提取前20名的生物學(xué)過程(biological process，BP)、細胞組成(cellular components，CC)、分子功能(molecular function，MF)及信號通路的數(shù)據(jù)，運用微生信在線制圖進行氣泡圖的繪制。

1.2.6分子對接 使用分子對接技術(shù)研究JPBSHXP的活性成分與治療IS的相關(guān)靶點。首先，從pubchem數(shù)據(jù)庫下載化合物結(jié)構(gòu)，保存為SDF格式，并通過Chem 3D軟件將SDF格式轉(zhuǎn)化為mol2格式，從RCSB數(shù)據(jù)庫下載相關(guān)蛋白，使用Pymol軟件去除溶劑分子與配體，使用AutoDock Tools 1.5.6軟件計算電荷、加氫等。最后運行Autodock vina 1.1.2進行分子對接, 采用Discovery Studio 2020可視化分析對接構(gòu)象。

2 結(jié)果

2.1 成分及靶點的篩選根據(jù)TCMSP得到JPBSHXP中藥-活性成分-靶點(單位：個)，其中黃芪-17個-462個、黨參-17個-214個、白術(shù)-4個-23個、杜仲-26個-519個、桑寄生-2個-157個、懷牛膝-17個-444個、肉蓯蓉-6個-223個、丹參-59個-932個、川芎-6個-42個、石菖蒲-4個-103個、甘草87個-1 761個。共有活性成分245個，靶點4 880個，剔重后取得該方有效成分201個，靶點263個。

2.2 疾病靶點及預(yù)測藥物作用靶點通過R語言設(shè)計程序?qū)⒓膊』蚝喜?、剔除重?fù)項并取唯一值，得到2 808個疾病靶點。藥物靶點與疾病靶點相交集得到共同基因190個。(詳見Fig 1)。

Fig 1 Venn diagram of drug-disease target intersection

2.3 健脾補腎活血方網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及拓撲分析通過Sytoscape 3.8.0構(gòu)建中藥-活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖。Network Analyzer計算分析得到398個節(jié)點，2 118條邊。拓撲研究顯示健脾類藥物主要化學(xué)成分槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、木犀草素(luteolin)等。其中槲皮素、山柰酚、豆甾醇為健脾類、補腎類共有活性成分，其余補腎類藥物顯著化學(xué)成分有漢黃芩素(wogonin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)等?；钛愃幬餅榈?、川芎，研究顯示發(fā)揮活血作用的藥物為丹參，主要有丹參酮IIA(tanshinone iia)、隱丹參酮(cryptotanshinone)等化合物(Tab 2)。

Tab 2 Potential active ingredients of JPBSHXP

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析將190個交集基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫，置信度設(shè)置為0.9，并剔除游離靶點，共得到170個基因，將170個基因通過sytoscape 3.8.0進行網(wǎng)絡(luò)可視化分析和拓撲分析。根據(jù)拓撲分析結(jié)果，取BC>58.4、DC>7、CC>0.11、EC>0.03、LAC>3(中位值)的靶點作為該方的核心基因。STAT3、Tp53、MAPK1、MAPK3、JUN、APP、MAPK14、MAPK8、AKT1、EGFR、VEGFA等基因可能是該方防治缺血性卒中的潛在靶點(Fig 2)。

Fig 2 Network diagram of potential targets

2.5 GO富集分析和KEGG通路富集分析GO分析共得到880個分析條目，其中生物學(xué)過程有662條，最多對應(yīng)交集基因有40個，最少2個；細胞組成有82條，最多對應(yīng)交集基因有87個，最少2個；分子功能有136條；最多對應(yīng)交集基因有150個，最少2個。根據(jù)排名前20的GO條目分析顯示，健脾補腎活血方治療缺血性卒中可能與對藥物的反應(yīng)、對缺氧的反應(yīng)、對乙醇的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)、對雌二醇的反應(yīng)、老化等生物學(xué)過程密切相關(guān)，分子生物學(xué)功能集中在酶結(jié)合、蛋白質(zhì)均二聚活性、血紅素結(jié)合、類固醇結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、多巴胺結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合、多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)受體活性等方面，細胞組分主要有細胞外空間、膜筏、質(zhì)膜等。

KEGG富集分析共得到125條通路，主要與癌癥通路、乙型肝炎、弓形蟲病、大腸癌、TNF信號通路、膀胱癌、胰腺癌、蛋白聚糖在癌癥中、HIF-1信號通路、前列腺癌、局灶性粘連、丙型肝炎、PI3K-Akt信號通路、細胞凋亡、Toll樣受體信號通路等密切相關(guān)(Fig 3)。

Fig 3 Visual analysis diagram of biological process, cell composition, molecular function and KEGG

2.6 分子對接Quercetin、Tanshinone IIa、Luteolin、Kaempferol與STAT3、Tp53、MAPK3、MAPK1、JUN、APP、AKT1關(guān)鍵靶蛋白進行28次對接，結(jié)果顯示靶點與化合物均有較強的結(jié)合能(Tab 3)。Quercetin主要是健脾補腎藥物共有活性成分，β淀粉樣前體蛋白(APP)與Quercetin結(jié)合較強，Tanshinone IIa為活血藥物主要成分，主要與轉(zhuǎn)錄因子AP-1(JUN)、絲裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)等化合物結(jié)合具有較好的穩(wěn)定性(Fig 4)。另外，氫鍵使結(jié)構(gòu)更具穩(wěn)定性。例如，APP與Quercetin的a環(huán)Arg381、Pro385形成氫鍵作用；b環(huán)與Arg500、Tyr369形成氫鍵作用；c環(huán)與Ala334、Glu362、Tyr501形成氫鍵作用。

Tab 3 Molecular docking results

3 討論

課題組成員前期多角度、多層次闡釋健脾補腎活血方治療缺血性卒中的藥理機制。實驗研究表明,該方通過抑制CD3+、CD8+和調(diào)節(jié)CD4+淋巴細胞在缺血/再灌注損傷后腦組織內(nèi)的浸潤，減少免疫應(yīng)答所介導(dǎo)的神經(jīng)細胞凋亡，增加大鼠外周血中內(nèi)皮組細胞(EPCs)的含量，增強腦組織CD31抗原的表達，促進大鼠腦組織新生血管的形成、有效建立側(cè)支循環(huán)，從而減輕腦損傷。臨床試驗也顯示，該方明顯增加患者外周血EPCs含量，提高缺血區(qū)血液灌注水平、改善細胞免疫、拮抗炎癥反應(yīng)，減少卒中后氧化應(yīng)激反應(yīng)，增強機體抗氧化應(yīng)激能力，同時修復(fù)受損的血管內(nèi)皮細胞[4,6-8]。

Fig 4 Molecular docking diagram

Tab 4 Signaling pathway of JPBSHXP in treating IS

拓撲分析得出槲皮素、木犀草素、山柰酚、丹參酮IIA可能是JPBSHXP治療IS的關(guān)鍵化學(xué)成分。Oh等[9]將槲皮素應(yīng)用于缺血/再灌注誘導(dǎo)小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，抑制在細胞活化期間由糖蛋白VI介導(dǎo)的血小板信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，明顯破壞膠原相關(guān)肽誘導(dǎo)的血小板聚集，減少顆粒分泌及活性氧生成，降低細胞內(nèi)鈣動員水平，抑制動脈血栓形成。木犀草素通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)9和激活PI3K/Akt信號通路增強細胞活力，并下調(diào)細胞凋亡，減少了腦梗塞體積[10]。山柰酚促進血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2)磷酸化、內(nèi)皮一氧化氮合酶(eNOS)和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Erk)表達，從而促使內(nèi)皮細胞增殖、遷移和血管新生[11]。徐璇實驗得出丹參酮IIA可使腦缺血大鼠的PTEN表達增強，降低自噬通路PI3K/AKT/mTOR的表達水平，減輕腦缺血后炎癥反應(yīng)，保護大鼠的腦組織[12]。該方治療IS的核心靶點有STAT3、TP53、MAPK1、MAPK3、APP、JUN、AKT1等。轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，參與細胞生長、代謝、凋亡，血管生成和氧化應(yīng)激等多種生物學(xué)途徑，同時介導(dǎo)機體免疫失調(diào)、炎癥反應(yīng)等過程[13]。余錄等[14]研究發(fā)現(xiàn)山柰酚糖苷可能通過STAT3信號通路減少卒中后TNF-α、IL-1β炎性因子，降低白質(zhì)區(qū)胼胝體和紋狀體的β淀粉樣前體蛋白(APP)陽性表達，改善大鼠神經(jīng)行為障礙，縮小腦梗死范圍，減輕神經(jīng)元損傷。

Fig 5 The key pathway of JPBSHXP possible to promote neovascularization

健脾補腎活血方作用于缺血性卒中的炎癥通路有腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)信號通路、Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)信號通路；促血管新生通路主要是低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1α)信號通路、磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶(phosphatei-dylinositol-3-kinase/serine-threonine kinase，PI3K /Akt)通路(Tab 4，F(xiàn)ig 5)。腦梗死急性期常出現(xiàn)大量的炎癥因子，TNF信號通路富集基因顯示可能調(diào)節(jié)IL-1β及CCL2、CXCL10、NFKBIA等致炎因子來對抗腦缺血。Toll樣受體信號通路參與神經(jīng)炎癥的反應(yīng)過程[15]，可能是通過MAPK信號通路，調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子AP-1，調(diào)節(jié)下游基因IL-8、IL-1β、NFKBIA、IKBKB、CXCL10、CXCL11等炎性因子參與中風(fēng)后炎性反應(yīng)。這也為未來臨床及實驗研究炎癥信號通路方向提供新的研究指標(biāo)。PI3K/Akt通路，參與多種通路的調(diào)節(jié)，與炎癥免疫反應(yīng)、細胞凋亡、HIF-1α等通路均有相關(guān)性[16-17]。PI3K-Akt通路得出該方可能是調(diào)控GF、RTK、ECM等上游蛋白，使PI3K激活，AKT磷酸化啟動下游PKCs、eNOS、ERK、GSK3、p21、Bcl-2、Bax、caspase-9等靶蛋白來作用于缺血性卒中。以上得知健脾補腎活血方可能通過免疫、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、血管新生、細胞凋亡等途徑作用于缺血性卒中。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過生物信息學(xué)、計算機技術(shù)、藥理學(xué)等對方劑進行現(xiàn)代化闡釋，為新藥創(chuàng)制研發(fā)提供思路，也給予關(guān)鍵的技術(shù)支撐，對后續(xù)實驗研究指明有希望的驗證方向。本研究通過該方法得出缺血性卒中的潛在化學(xué)成分、小分子蛋白以及信號通路，在分子生物學(xué)層面為該方進一步實驗研究及臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。中醫(yī)藥在傳承中發(fā)展，在發(fā)展中創(chuàng)新，中藥新藥以證候為干預(yù)對象，以辨證論治為理論基礎(chǔ)，具有異病同治的特征。臨床研究中本方對脾腎兩虛型腦梗死、卒中后認(rèn)知障礙和腦白質(zhì)病變具有明顯療效，是否通過調(diào)控這些通路、靶蛋白發(fā)揮作用，有待于課題組下一步實驗和臨床驗證。