粟玉剛，李向勇，李 蜜，陳宇明，譚鏡明

（1.長(zhǎng)沙市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法局，湖南長(zhǎng)沙 410013；2.長(zhǎng)沙生態(tài)動(dòng)物園，湖南長(zhǎng)沙 410118）

牛羽虱（Bovicola bovis，B.bovis）是一類寄生于牛體表的專性外寄生蟲，隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門（Arthropoda）昆蟲綱（Insect）翅亞綱（Pterygota）虱目（Phthiraptera）絲角亞目（Ischnocera）獸羽虱科（Trichodectidae）牛羽虱屬（Bovicola）。牛羽虱是一類非常普遍且具有臨床意義的體外寄生蟲[1]，給畜牧業(yè)造成了一定經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)報(bào)道[2]，英國(guó)每年由其導(dǎo)致的損失高達(dá)2 000 萬(wàn)英鎊。牛感染牛羽虱后表現(xiàn)為瘙癢和擦傷，嚴(yán)重者大量脫毛，出現(xiàn)皮膚創(chuàng)傷和感染[3]。除了體表可見(jiàn)的傷害外，牛羽虱還會(huì)造成斑點(diǎn)類隱藏?fù)p傷[4]。該病傳染性較強(qiáng)，如果牛群里有一頭?；疾?，在短時(shí)間內(nèi)就會(huì)傳遍整個(gè)牛群。牛羽虱對(duì)牛的正常生長(zhǎng)和活動(dòng)帶來(lái)了嚴(yán)重?fù)p害和影響，但該病常常被養(yǎng)殖戶忽視[5]。牛羽虱雖然是一類常見(jiàn)寄生蟲，但很少有相關(guān)研究報(bào)道，因此準(zhǔn)確鑒別牛羽虱不僅對(duì)該病防控具有重要意義，而且具有重要的學(xué)術(shù)價(jià)值。

線粒體基因組是近年來(lái)分子生物學(xué)領(lǐng)域最常用的分子標(biāo)記之一，因其具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、缺少重組、呈母系遺傳、進(jìn)化速率快等特點(diǎn)[6-8]，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于虱子分類鑒定、系統(tǒng)發(fā)育和分子進(jìn)化分析等領(lǐng)域[9-11]。線粒體基因組中的細(xì)胞色素c 氧化酶第I 亞基（cytochrome c oxidase subunit 1，cox1）基因是理想的分子遺傳標(biāo)記。本研究采集來(lái)自湖南省長(zhǎng)沙市黃牛體表的虱子，基于初步的形態(tài)學(xué)觀察后，對(duì)蟲體的cox1基因進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序和序列分析，以期為牛羽虱的分類鑒定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 3 只虱子樣品采集自湖南省長(zhǎng)沙市某黃牛養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.1.2 主要試劑 Wizard?SV Genomic DNA Purification System（DNA 提取試劑盒），購(gòu)自美國(guó)Promege 公司；Proteinase K（蛋白酶K，20 mg/mL）、Nuclease-free Water（無(wú)核酸酶水）、無(wú)水乙醇，購(gòu)自北京全式金生物公司；PremixTaq?（混合聚合酶），購(gòu)自TaKaRa 公司；Bioweste regular agarose G-10（普通瓊脂糖）、GelstainRedTM（核酸染料），購(gòu)自US EverBright 公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 S1010E 小型離心機(jī)、SCIVS 小型渦旋震蕩儀，購(gòu)自Scilogex 公司；5427 R Centrifuge 高速離心機(jī)，購(gòu)自Eppendorf 公司；三溫三控水浴鍋，購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；全自動(dòng)樣品快速研磨儀，購(gòu)自上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；電子秤，購(gòu)自Sartorius 公司；DYY-6C 型電泳儀，購(gòu)自北京六一生物科技有限公司；Quantum VilBer LouRMAT 紫外凝膠成像系統(tǒng)，購(gòu)自北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；Applied biosystems?2720 Thermal Cycler PCR 擴(kuò)增儀，購(gòu)自上海艾研生物科技有限公司；Nikon SMZ18 體視顯微鏡，購(gòu)自湖北上光儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蟲體采集 在黃牛體表翻開(kāi)被毛，用鑷子采集虱子樣品，以生理鹽水反復(fù)沖洗后，保存于酒精內(nèi)，置-40 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 形態(tài)學(xué)觀察 取出存放于酒精內(nèi)的蟲體樣本若干只，使用體視顯微鏡分別對(duì)蟲體背面、腹面進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察并拍照。

1.2.3 蟲體總DNA 提取 取3 只蟲體樣本，將蟲體分別放入滅菌1.5 mL Eppendorf 離心管中，用超純水反復(fù)沖洗5 次后，使用研磨機(jī)研磨，然后根據(jù)Wizard?SV Genomic DNA Purification System（DNA 提取試劑盒）說(shuō)明書提取DNA，將提取的DNA 樣品置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 引物合成 參照Hafner 等[12]報(bào)道的虱子cox1基因序列通用引物（L6625：5'-CCGGATCCT TYTGRTTYTTYGGNCAYCC-3'；H7005：5'-CCG GATCCACNACRTARTANGTRTCRTG-3'），由 上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2.5 PCR 擴(kuò)增 以提取的蟲體總DNA 為模板，使用上述合成的引物進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)總體系25.0 μL：PremixTaq? 12.5 μL，Nuclease-free Water 10.5 μL，上下游引物各0.5 μL，模板1.0 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃變性10 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃再延伸2 min。取5.0 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳儀設(shè)置電壓120 V、電流100 mA，用核酸染料染色，在紫外透射儀下觀察結(jié)果并拍照。

1.2.6 序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析 將陽(yáng)性PCR產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果使用DNAMAN 軟件拼接好后，提交至NCBI 進(jìn)行Blast 對(duì)比。從GenBank 下載部分獸羽虱科現(xiàn)有的cox1序列（表1），以長(zhǎng)角羽虱科的草原雕虱（Falcolipeurus suturalis，基因登錄號(hào)MW696813）作為外群，利用Mega 5.0 軟件中最大似然法（maximum likelihood method），采用GTR模型構(gòu)建羽虱的cox1序列系統(tǒng)發(fā)育樹，使用自舉檢驗(yàn)（bootstrap=1 000）估算所構(gòu)建發(fā)育樹的可靠性。

表1 基于cox1 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中包含的羽虱物種

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

在體視顯微鏡下觀察可發(fā)現(xiàn)：蟲體平均大小為7.5 mm×3.0 mm。蟲體頭部呈鈍圓的三角形，在頭部中央有1 對(duì)細(xì)長(zhǎng)的觸角；胸部有3 對(duì)足，由基節(jié)、脛節(jié)、跗節(jié)和爪組成；腹部由8 節(jié)組成，各節(jié)的背面和腹面有硬化的幾丁質(zhì)片，腹部的兩側(cè)邊也可以觀察到片形的硬化片，氣門存在于此；體表有許多細(xì)小的針形剛毛（圖1）。

2.2 PCR 擴(kuò)增

PCR 擴(kuò)增結(jié)果（圖2）顯示，3 個(gè)蟲體DNA樣本均能成功擴(kuò)增出大小約400 bp 的片段，與預(yù)期目的片段長(zhǎng)度相符，且無(wú)非特異性雜帶，空白對(duì)照為陰性。

2.3 測(cè)序結(jié)果及分析

3 個(gè)虱子蟲體樣本cox1序列長(zhǎng)度相同，均為400 bp。在刪除引物序列和低質(zhì)量序列后，得到長(zhǎng)度為389 bp 的序列片段。Blast 結(jié)果顯示，3 個(gè)樣本cox1序列與GenBank 收錄的牛羽虱（登錄號(hào)MH001191）序列相似性為99.0%～99.5%，說(shuō)明本次采集虱子屬于牛羽虱。

2.4 cox1 基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

基于cox1基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，采集自湖南省長(zhǎng)沙市的牛羽虱與GenBank 收錄的牛羽虱（登錄號(hào)MH001191 和AF545680）均位于同一大分支（圖3），且與山羊羽虱親緣關(guān)系更近，與犬毛虱親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，這與之前的研究結(jié)果[11]一致。系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)一步驗(yàn)證了本研究的3 個(gè)樣本屬于牛羽虱。

3 討論

對(duì)寄生蟲進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定是防控寄生蟲病的基礎(chǔ)。寄生虱一般有宿主特異性，如寄生在牛的羽虱僅有牛羽虱，寄生在山羊的羽虱為山羊羽虱和屈緣羽虱，寄生在綿羊的羽虱僅有綿羊羽虱。本研究采集的虱子蟲體平均大小為7.5 mm×3.0 mm，頭部鈍圓，中央處有一對(duì)細(xì)長(zhǎng)觸角，體表有剛毛，腹部有硬化片。根據(jù)世界羽虱名錄及其宿主特異性，初步鑒定該虱子樣品為牛羽虱[13]。然而，因?yàn)榕Ｓ鹗?、山羊羽虱、屈緣羽虱和綿羊羽虱的形態(tài)學(xué)特征非常相似，所以單靠形態(tài)學(xué)很難對(duì)這些羽虱進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分和鑒定，而分子生物學(xué)技術(shù)很好地解決了這一問(wèn)題。

線粒體基因組是近年來(lái)分子生物學(xué)研究的重點(diǎn)之一。根據(jù)線粒體基因組中cox1基因具有種內(nèi)保守、種間差異性較大的特點(diǎn)，其在寄生蟲的分類鑒定和種群遺傳方面被認(rèn)為是非常理想的遺傳標(biāo)記[14-16]。本研究獲得的3 個(gè)樣本株序列與GenBank收錄的牛羽虱（登錄號(hào)MH001191）cox1序列相似性高達(dá)99.0%～99.5%，系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系也顯示與牛羽虱均處于同一分支，進(jìn)一步證明本研究樣本株為牛羽虱。該結(jié)果為準(zhǔn)確鑒定牛羽虱奠定了基礎(chǔ)，也進(jìn)一步說(shuō)明將線粒體cox1基因作為羽虱的分類鑒定遺傳標(biāo)記具有一定意義。