蘇丹 車南穎 歐喜超 趙穎麗 李琨 陳學(xué)敬 林海峰 穆晶 黃海榮

病理學(xué)檢查是細(xì)菌學(xué)檢查之外最重要的結(jié)核病確診途徑。近年來，超聲或CT引導(dǎo)下的針吸活檢技術(shù)由于微創(chuàng)、精準(zhǔn)、便利、低風(fēng)險(xiǎn)等特點(diǎn)逐步得到普及，使得病理學(xué)檢查在疾病診斷和鑒別診斷中發(fā)揮日益重要的價(jià)值。我國(guó)肺外結(jié)核患者約占全部結(jié)核病患者的10%～20%，骨關(guān)節(jié)結(jié)核占全部結(jié)核病的3%～5%，占肺外結(jié)核的15%[1]。骨關(guān)節(jié)結(jié)核若延誤治療，則會(huì)導(dǎo)致截癱、脊柱后凸畸形等嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重危害患者生命及生活質(zhì)量[2]。早期診斷、早期治療是控制骨關(guān)節(jié)結(jié)核的關(guān)鍵。對(duì)骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者組織標(biāo)本和膿液標(biāo)本開展分子生物學(xué)檢測(cè)，改變了過去骨關(guān)節(jié)結(jié)核細(xì)菌學(xué)診斷陽(yáng)性率低的局面，同時(shí)還能及時(shí)提供結(jié)核分枝桿菌的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果，促進(jìn)診斷和治療精準(zhǔn)程度的提高[3]。本研究以臨床疑似骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者為研究對(duì)象，回顧性分析了多種細(xì)菌學(xué)和病理學(xué)檢測(cè)技術(shù)診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核的檢測(cè)效能，探討分子生物學(xué)技術(shù)在骨關(guān)節(jié)結(jié)核診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

對(duì)象和方法

一、研究對(duì)象

收集2016 年1月至2018 年12月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院住院治療的213例疑似骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者為研究對(duì)象?；颊呒{入情況及各項(xiàng)檢測(cè)開展情況見圖1。213例納入患者中，男性152例，占71.4%(152/213)，女性61例，占28.6%(61/213)；漢族患者占87.3%(186/213)；15～64歲患者占85.4%(182/213)，<15歲患者占2.8%(6/213)，≥65歲患者占11.7%(25/213)。本研究方案通過首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審批編號(hào)：BJXK-2016-05)。

圖1 患者納入及各項(xiàng)檢查開展情況

二、診斷標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)骨結(jié)核綜合參考標(biāo)準(zhǔn)(composite reference standard, CRS)[4]與《中國(guó)結(jié)核病病理學(xué)診斷專家共識(shí)》[5]，將疑似骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者分為以下4類：確診骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者(結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性)、臨床診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者(結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陰性、活檢或手術(shù)標(biāo)本病理顯示為干酪樣肉芽腫，并且對(duì)抗結(jié)核治療反應(yīng)良好)、疑似骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者(沒有細(xì)菌學(xué)及病理學(xué)證據(jù)，但是對(duì)抗結(jié)核治療反應(yīng)良好，影像學(xué)符合骨關(guān)節(jié)結(jié)核)、非結(jié)核患者(沒有細(xì)菌學(xué)等其他結(jié)核方面證據(jù)并且抗結(jié)核治療無效)。

根據(jù)細(xì)菌學(xué)和病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果，將疑似骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者分為以下四類： 確診骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者：骨標(biāo)本涂片和(或)陽(yáng)性，或者病理抗酸染色陽(yáng)性；上述檢查均陰性，但同期伴肺部疾病痰標(biāo)本檢測(cè)涂片和(或)培養(yǎng)和(或)分子檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，同時(shí)骨病理檢查肉芽腫性病變。高度疑似骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者：骨標(biāo)本涂片、培養(yǎng)均陰性，骨標(biāo)本病理典型的肉芽腫伴或不伴壞死。疑似骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者： 骨標(biāo)本涂片、培養(yǎng)均陰性，骨標(biāo)本病理檢測(cè)不典型的肉芽腫，伴或不伴壞死。排除結(jié)核患者：骨標(biāo)本涂片、培養(yǎng)均陰性，骨標(biāo)本病理檢測(cè)無肉芽腫病變，臨床不考慮為結(jié)核，或是通過其他檢查排除結(jié)核。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)在骨科進(jìn)行手術(shù)的疑似骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者；(2)患者手術(shù)標(biāo)本同時(shí)送檢細(xì)菌學(xué)和病理學(xué)檢查；(3)送檢病理檢查的組織標(biāo)本和送檢細(xì)菌學(xué)檢查的膿液標(biāo)本來自相同手術(shù)部位。

數(shù)據(jù)采集：收集按照研究納入標(biāo)準(zhǔn)納入患者的膿液標(biāo)本涂片鏡檢、BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)(MGIT 960培養(yǎng))、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(FQ-PCR)檢測(cè)、GeneXpert MTB/RIF(Xpert)檢測(cè)結(jié)果，以及組織標(biāo)本抗酸桿菌染色和FQ-PCR檢測(cè)結(jié)果。

三、研究方法

1．標(biāo)本處理：膿液標(biāo)本采用N-乙酰-L半胱氨酸(NALC)-氫氧化鈉法進(jìn)行處理。所有組織標(biāo)本均經(jīng)4%中性甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋。

2. 膿液標(biāo)本涂片檢查：遵照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[6]中的標(biāo)準(zhǔn)化操作程序執(zhí)行。

3．膿液標(biāo)本MGIT 960培養(yǎng)：加入0.5 ml處理后的膿液標(biāo)本至MGIT 960培養(yǎng)管(含0.8 ml OADC營(yíng)養(yǎng)添加劑和抑菌劑)，然后將培養(yǎng)管放入MGIT 960全自動(dòng)培養(yǎng)系統(tǒng)(美國(guó)BD公司)中進(jìn)行培養(yǎng)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)并讀取結(jié)果。以結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv作為陽(yáng)性對(duì)照，以空白管作為陰性對(duì)照。

4. 膿液標(biāo)本Xpert檢測(cè)：將Xpert MTB/RIF試劑盒配套的處理液加入到含有NALC-NaOH處理后膿液標(biāo)本的離心管中，渦旋振蕩后靜置15 min，將處理后樣品由加樣孔緩慢加入到反應(yīng)盒內(nèi)，然后上機(jī)，反應(yīng)2 h后讀取結(jié)果[7]。

5. 膿液標(biāo)本FQ-PCR檢測(cè)：采用達(dá)安基因公司生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌PCR檢測(cè)試劑盒，陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照設(shè)置及其他具體操作見產(chǎn)品說明書。

6. 組織標(biāo)本抗酸染色：抗酸染色試劑盒(BA-4090B)購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。石蠟切片厚4 μm，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇(高濃度到低濃度)后入水；石碳酸復(fù)紅染色1 h，水洗后鹽酸乙醇分化數(shù)秒至無紅色，再水洗；亞甲藍(lán)染色20 s，水洗；梯度乙醇脫水，二甲苯透明后，中性膠封片，油鏡下觀察。結(jié)果判定：觀察見到紅色桿狀、略彎曲、串珠狀抗酸桿菌為抗酸染色陽(yáng)性。

7. 組織標(biāo)本FQ-PCR檢測(cè)：石蠟包埋組織標(biāo)本的DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司(北京)，DNA提取按照試劑盒操作說明書進(jìn)行。結(jié)核分枝桿菌核酸測(cè)定試劑盒(熒光PCR法)購(gòu)自上海之江生物科技股份有限公司，具體操作見產(chǎn)品說明書。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用四格表的形式計(jì)算敏感度和特異度，根據(jù)CRS，評(píng)價(jià)不同檢測(cè)技術(shù)對(duì)骨關(guān)節(jié)結(jié)核的檢測(cè)效能。各種檢測(cè)方法的檢出率采用配對(duì)卡方檢驗(yàn)(McNemar test)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、細(xì)菌學(xué)聯(lián)合病理學(xué)檢查對(duì)患者的檢出情況

依據(jù)CRS，213例納入患者中，186例患者診斷為骨關(guān)節(jié)結(jié)核，27例患者排除骨關(guān)節(jié)結(jié)核。186例骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者中，脊柱結(jié)核患者占64.0%(119/186)，外周骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者占36.0%(67/186)。27例排除骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者包括非結(jié)核性滑膜炎2例、葡萄球菌感染3例、金黃色葡萄球菌感染2例、布魯桿菌病3例、真菌感染伴陳舊性肺結(jié)核1例、胞內(nèi)分枝桿菌感染1例，其余15例未獲得明確的臨床診斷，但均排除結(jié)核病。

依照細(xì)菌學(xué)和病理學(xué)聯(lián)合分類標(biāo)準(zhǔn)，186例骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者中，124例為確診結(jié)核患者，23例為高度疑似患者，39例為疑似患者。不同類別的患者在疾病發(fā)生部位間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。見表1。

表1 不同患病部位在不同分類患者中的分布情況 [例數(shù)(構(gòu)成比，%)]

二、不同檢測(cè)方法在骨關(guān)節(jié)結(jié)核診斷中的檢測(cè)效能

在213例疑似骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者中，分別以開展相應(yīng)檢查的納入患者作為分析對(duì)象，根據(jù)CRS結(jié)果，膿液標(biāo)本涂片鏡檢、MGIT 960液體培養(yǎng)、FQ-PCR、Xpert以及組織標(biāo)本抗酸桿菌染色和FQ-PCR檢測(cè)的敏感度分別為28.7% (49/171)、49.0% (48/98)、58.1% (25/43)、87.5% (161/184)、48.6%(90/185)和85.4%(146/171)；特異度分別為100.0% (26/26)、11/11、8/9、96.2%(25/26)、96.3% (26/27)和100.0% (27/27)，見表2。

表2 不同檢測(cè)方法在骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者中的檢測(cè)效能

對(duì)124例確診骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者不同類型檢查的結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，膿液標(biāo)本涂片鏡檢、MGIT 960液體培養(yǎng)、FQ-PCR、Xpert檢測(cè)以及組織標(biāo)本抗酸染色和FQ-PCR檢測(cè)骨關(guān)節(jié)結(jié)核的敏感度分別為42.2% (49/116)、62.3% (48/77)、60.0% (18/30)、95.1% (117/123)、72.4% (89/123)和92.9% (105/113)。

23例高度疑似骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者不同類型檢查的結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，膿液標(biāo)本FQ-PCR、Xpert檢測(cè)以及組織標(biāo)本FQ-PCR檢測(cè)的敏感度分別為3/5、77.3% (17/22)和77.3% (17/22)。39例疑似骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者中，膿液標(biāo)本FQ-PCR、Xpert檢測(cè)以及組織標(biāo)本FQ-PCR檢測(cè)的敏感度分別為4/8、69.2% (27/39)和72.9% (27/37)。

膿液標(biāo)本FQ-PCR檢測(cè)在不同分類骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者中的敏感度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.513，P=0.888)；膿液標(biāo)本Xpert檢測(cè)在確診骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者中的檢測(cè)敏感度明顯高于高度疑似和疑似骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者(χ2=19.331，P=0.000)；組織標(biāo)本FQ-PCR檢測(cè)在確診骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者中的檢測(cè)敏感度明顯高于高度疑似和疑似骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者(χ2=10.037，P=0.005)。

三、 Xpert在不同部位骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者中檢測(cè)利福平耐藥情況

在186例確診骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者中，184例患者進(jìn)行了Xpert檢測(cè)，其中23例結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)結(jié)果為陰性，161例結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。11例結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)陽(yáng)性患者為利福平耐藥，利福平耐藥率為6.8%(11/161)，其中腰椎結(jié)核患者6例，胸椎與外周骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者各2例，四肢骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者1例。

討 論

骨關(guān)節(jié)結(jié)核如能早診斷、早治療，不僅可以盡快控制疾病進(jìn)展、縮短療程，還可減輕患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，避免或減少后遺癥的發(fā)生。傳統(tǒng)骨關(guān)節(jié)結(jié)核的診斷主要依賴細(xì)菌學(xué)檢查，主要包括抗酸染色涂片鏡檢和分枝桿菌培養(yǎng)等檢測(cè)技術(shù)。結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性被認(rèn)為是結(jié)核病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，同時(shí)獲得陽(yáng)性培養(yǎng)物還能為后續(xù)開展藥物敏感性試驗(yàn)和菌種鑒定等提供檢測(cè)對(duì)象。結(jié)核病病灶中的氧分壓對(duì)結(jié)核分枝桿菌分裂繁殖的速度有重要影響，當(dāng)病灶中氧分壓高時(shí)細(xì)菌分裂繁殖快。骨關(guān)節(jié)結(jié)核病灶中的氧分壓遠(yuǎn)比肺結(jié)核病灶低，因此，造成骨關(guān)節(jié)結(jié)核病灶中荷菌量相對(duì)較低，影響了各種細(xì)菌學(xué)檢查的陽(yáng)性率。同時(shí)，結(jié)核分枝桿菌在中性環(huán)境中有利于分裂繁殖，而骨關(guān)節(jié)結(jié)核的寒性膿腫為偏堿性的微環(huán)境，不利于結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)，進(jìn)一步減少了骨關(guān)節(jié)結(jié)核病灶中的荷菌量[2]。國(guó)內(nèi)外研究表明，骨關(guān)節(jié)結(jié)核膿液或病灶中結(jié)核分枝桿菌改良羅氏培養(yǎng)陽(yáng)性率為25%～71.15%，陽(yáng)性結(jié)果報(bào)告時(shí)間為30 d左右[8-9]； MGIT 960 液體培養(yǎng)陽(yáng)性率可達(dá)56.90%～83.87%，報(bào)告時(shí)間為11 d左右[10]。近些年，分子診斷技術(shù)在骨關(guān)節(jié)結(jié)核細(xì)菌學(xué)診斷中逐漸發(fā)揮著越來越重要的作用，明顯提高了骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者的病原學(xué)陽(yáng)性檢出率[11-12]，并且能夠在檢測(cè)當(dāng)天或幾天內(nèi)獲得一線抗結(jié)核藥物的藥物敏感性結(jié)果，有助于對(duì)耐藥結(jié)核病患者盡快制定合理的個(gè)體化治療方案。傳統(tǒng)的骨關(guān)節(jié)結(jié)核病理學(xué)診斷是通過大體和鏡下觀察病灶組織的形態(tài)學(xué)改變來獲得診斷結(jié)果[13-14]。通常結(jié)核性病變典型者表現(xiàn)為上皮樣細(xì)胞(epithelioid cell)聚集形成肉芽腫結(jié)節(jié)，中央可見均質(zhì)紅染的干酪樣壞死，外周可見朗格漢斯(Langhans)巨細(xì)胞，可伴或不伴有抗酸桿菌檢查陽(yáng)性。本研究結(jié)果顯示，通過對(duì)組織標(biāo)本開展分子生物學(xué)檢測(cè)能夠進(jìn)一步優(yōu)化骨關(guān)節(jié)結(jié)核和耐藥骨關(guān)節(jié)結(jié)核的診斷技術(shù)選擇。

本研究發(fā)現(xiàn)膿液標(biāo)本 Xpert 檢測(cè)和組織標(biāo)本FQ-PCR 檢測(cè)均獲得比較高的敏感度，二者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分子診斷普遍具有檢測(cè)時(shí)間短的優(yōu)勢(shì)，有利于盡快診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核，減少診斷延誤。關(guān)于肺結(jié)核的研究顯示， Xpert檢測(cè)較其他檢測(cè)技術(shù)表現(xiàn)出更高的敏感度[15]。但在本研究中組織標(biāo)本 FQ-PCR檢測(cè)獲得與膿液標(biāo)本Xpert 檢測(cè)接近的敏感度，可能主要是因?yàn)榻M織標(biāo)本FQ-PCR檢測(cè)通常在組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)有結(jié)核肉芽腫病變后才從病灶部位取材進(jìn)行檢測(cè)，因此，本研究中獲得的組織標(biāo)本 FQ-PCR 陽(yáng)性檢出率要遠(yuǎn)高于膿液標(biāo)本的 FQ-PCR 檢測(cè)結(jié)果。另外，對(duì)于發(fā)現(xiàn)肉芽腫的組織標(biāo)本可優(yōu)先考慮價(jià)格更為便宜的FQ-PCR技術(shù)進(jìn)行結(jié)核病的確診。

在確診骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者中，骨關(guān)節(jié)結(jié)核組織標(biāo)本進(jìn)行FQ-PCR 檢測(cè)的敏感度要高于抗酸染色法(分別為92.9%和72.4%)。與抗酸染色方法相比，F(xiàn)Q-PCR 檢測(cè)在組織標(biāo)本荷菌量較少時(shí)仍可獲得比較理想的陽(yáng)性檢出率，從而明顯提高病理學(xué)診斷結(jié)核病患者的病原學(xué)陽(yáng)性率。過去病理診斷除了細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，通常僅開展組織抗酸染色，以進(jìn)一步診斷結(jié)核。從本研究中的病理抗酸染色方法中能夠看出，即便顯微鏡下呈現(xiàn)典型的肉芽腫病變，抗酸染色檢出率仍然不高，主要原因就是因?yàn)榭顾崛旧R檢技術(shù)本身敏感度低，由此提示對(duì)組織標(biāo)本常規(guī)開展分子檢查非常有必要。

本研究中Xpert和FQ-PCR分別在依據(jù)CRS排除結(jié)核的患者中獲得1例陽(yáng)性結(jié)果，分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)在臨床應(yīng)用過程中，可能會(huì)由于患者曾經(jīng)感染結(jié)核分枝桿菌或者實(shí)驗(yàn)室污染等原因，出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果。因此，在分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)時(shí)，要考慮有假陽(yáng)性的可能，避免誤判。此外，本研究中所用參考標(biāo)準(zhǔn)是骨結(jié)核綜合參考標(biāo)準(zhǔn)，這一標(biāo)準(zhǔn)并未充分考慮非結(jié)核分枝桿菌(NTM)的影響，因此對(duì)于抗酸桿菌陽(yáng)性、培養(yǎng)未做進(jìn)一步鑒定時(shí)，有可能會(huì)將NTM肺病誤判為結(jié)核病。然而，本研究中涂片陽(yáng)性和(或)培養(yǎng)陽(yáng)性的患者，通常Xpert和FQ-PCR檢測(cè)結(jié)果也為陽(yáng)性，表明本研究納入的患者由NTM感染引起的可能性比較低。由于本研究納入患者主要來自北方地區(qū)，屬于NTM感染相對(duì)少見的區(qū)域，如果相同的技術(shù)在NTM病發(fā)病率高的地區(qū)使用，要高度關(guān)注由NTM造成的假陽(yáng)性問題。

Xpert檢測(cè)在獲取結(jié)核病診斷結(jié)果的同時(shí)可以通過檢測(cè)rpoB基因是否突變從而可以證實(shí)結(jié)核分枝桿菌是否對(duì)利福平耐藥[15-16]。我國(guó)作為全球耐多藥結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家，骨關(guān)節(jié)結(jié)核耐藥情況并不罕見，如果不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)耐藥，往往導(dǎo)致病灶清除手術(shù)失敗，出現(xiàn)多次手術(shù)的現(xiàn)象，給患者及社會(huì)都會(huì)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。本研究發(fā)現(xiàn)在161 例 Xpert檢測(cè)陽(yáng)性的患者中，11例為利福平耐藥。Xpert檢測(cè)技術(shù)對(duì)骨關(guān)節(jié)結(jié)核耐藥患者的早期發(fā)現(xiàn)，對(duì)患者治療方案的制定具有十分重要的指導(dǎo)意義，在保證治療成功率的同時(shí)，可節(jié)省大量的治療經(jīng)費(fèi)，帶來良好的社會(huì)效益。

綜上所述，分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)結(jié)核病病理學(xué)和細(xì)菌學(xué)診斷的不足，諸如 Xpert檢測(cè)等新型分子生物學(xué)診斷技術(shù)的推廣應(yīng)用，不僅可以提高骨關(guān)節(jié)結(jié)核的確診率，還可以提早發(fā)現(xiàn)患者感染的結(jié)核分枝桿菌是否對(duì)利福平耐藥。因此，在標(biāo)本量足夠的前提下，推薦聯(lián)合多種病理學(xué)和細(xì)菌學(xué)檢測(cè)技術(shù)，提高骨關(guān)節(jié)結(jié)核的確診率。

利益沖突所有作者聲明均不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)蘇丹、黃海榮：采集數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析、論文撰寫和修改；車南穎、歐喜超：統(tǒng)計(jì)分析、論文撰寫；趙穎麗、李琨：采集數(shù)據(jù)；陳學(xué)敬、林海峰、穆晶：統(tǒng)計(jì)分析、論文修改