蔣依辰，王琳玉，于清洋，邳植

（黑龍江大學現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學院，哈爾濱 150080）

0 引言

甜菜（Beta vulgarisL.）是莧科甜菜屬二年生草本植物，主要分布在我國內蒙古和新疆自治區(qū)、黑龍江省、吉林省、寧夏回族自治區(qū)等地[1]。每年甜菜產(chǎn)糖量占我國食糖總產(chǎn)量的10%～20%，是我國主要的糖料作物[2]。鹽漬、低溫、干旱等非生物脅迫會導致甜菜的萌發(fā)率降低，幼苗生長狀態(tài)差，塊根發(fā)育減緩，嚴重限制了甜菜的產(chǎn)量和含糖率。因此，解析甜菜對非生物脅迫的適應機制對進一步提高甜菜產(chǎn)量具有重要意義[3]。研究表明，超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（Peroxidase，POD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）組成的抗氧化酶系統(tǒng)是甜菜抵御非生物脅迫的重要方式之一。BvP5CS、BvCOLD1和BvCBL4等參與干旱、低溫和鹽脅迫的應答基因也被成功克隆[4-5]。然而，目前針對甜菜的非生物脅迫研究多集中在生理、轉錄和蛋白水平，表觀遺傳調控如何參與甜菜非生物脅迫應答目前研究較少。

組蛋白的甲基化、乙?；?、磷酸化、泛素化等翻譯后修飾是表觀遺傳調控的重要方式之一[6]。20 世紀60年代，ALLFREY 等[7]第一次研究出乙酰基團能與核心組蛋白的賴氨酸殘基連接從而產(chǎn)生乙?；揎棧@種修飾會促進基因的轉錄。此后，大量關于組蛋白修飾及其對染色質重塑和轉錄調控的機制陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。組蛋白的乙?；揎検怯山M蛋白乙酰轉移酶（HAT）將乙酰輔酶A 中的乙?；D移到特定的賴氨酸殘基，從而中和賴氨酸側鏈的正電荷的過程。該過程會減弱組蛋白與DNA 的親和程度，增加側鏈的疏水體積，破壞氫鍵的形成能力，使染色質結構松散，有利于轉錄因子或轉錄調節(jié)蛋白與DNA 的結合，促進基因的轉錄[7-8]。根據(jù)HAT 的結構和性質，植物HAT 可以分為GNAT 家族、MYST 家族、CBP 家族、TAFII250 家族[9]。GNAT/MYST 超家族成員在動物、真菌和植物中具有較高的保守性。其中，GNAT家族的成員含有motif A～D 4 個特征基序，而MYST 家族僅含有特征motif A。CBP 家族成員涉及調節(jié)細胞周期控制、分化和凋亡。與動物CBP 家族成員相比，植物CBP 家族成員缺少bromodomain、KIX、Glutamine-rich 結構域，但具有zf-TAZ 和PHD 結構域[10]。TAFII250 家族成員作為TFIID 轉錄因子的一個亞基，含有與其他HAT家族成員不同的乙?；揎椊Y構域[10]。

研究表明，HAT 在調控非生物對植物的脅迫中有重要的作用。擬南芥gcn5 突變體中許多熱響應基因在被熱激后無法被正常誘導表達，導致突變體表型在熱激響應上有缺陷[11]。進一步研究表明AtGCN5 能結合到熱響應基因HSAF3和UVH6的啟動子上，并影響其H3K9和H3K14 的乙酰化修飾水平[12]。在鹽脅迫下，水稻的OsHAC701、OsHAC703、OsHAC704、OsHAG703和OsHAM701的轉錄水平增加，這種情況的產(chǎn)生與組蛋白H3K18乙酰化的增加有關，所以這些蛋白質可能在水稻鹽脅迫反應中起重要作用[13]。

目前，關于組蛋白乙?；D移酶的研究主要是以擬南芥、玉米、水稻為主要研究對象。甜菜組蛋白乙酰轉移酶（BvHATs）家族成員的研究尚未有明確報道，也不清楚在哪些BvHATs 與脅迫響應相關。因此，本研究將利用同源比對的方法在甜菜基因組中檢索BvHATs基因家族成員；對BvHATs基因家族進行系統(tǒng)進化、基因結構和功能結構域分析；通過分析非生物脅迫下基因表達模式篩選脅迫相關的BvHATs，以期為闡明BvHATs家族基因的功能及其調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 不同物種基因組數(shù)據(jù)的獲取及HAT家族成員檢索

本研究從Phytozome、CoGe、URG、TAIR 等數(shù)據(jù)庫分別檢索下載擬南芥、甜菜、大豆、胡蘿卜等13 種植物的蛋白質組數(shù)據(jù)（表1）。以擬南芥HAT 蛋白序列進行Blastp 檢索[14]。以E-value<1E-15 且score 值>50 為閾值[15-16]，從13個植物蛋白質組數(shù)據(jù)中檢索的HAT家族成員進行系統(tǒng)進化樹的構建。

表1 研究所用蛋白質組數(shù)據(jù)Table1 Theproteomic databaseused inthis study

1.2 HAT基因家族系統(tǒng)進化分析的構建

利用Cluster Omega 對挑選出的HAT 進行序列比對，所有參數(shù)采用默認值[30]。隨后，利用IQ-TREE 軟件采用最大似然法構建進化樹[31]，基于蛋白序列比對結果以ModelFinder計算建樹最優(yōu)模型。最終，采用JTT+R5作為最優(yōu)模型構建進化樹，bootstrap設置為1 000[32]。建樹結果使用EvolView進行可視化[33]。

1.3 BvHATs基因和蛋白質結構分析

基于甜菜基因組gff 文件利用TBtools 軟件[34]從中提取HAT 基因家族成員基因組定位、外顯子和內含子位置信息，并繪制染色體定位圖譜。HAT 基因家族成員編碼蛋白分子量和等電點通過Expasy 計算，蛋白功能結構域信息則通過HMMscan進行檢索。

1.4 非生物脅迫下BvHATs基因表達模式分析

目前SRA 數(shù)據(jù)庫中僅有鹽脅迫（PRJNA453103）和堿脅迫（PRJNA420895）后的甜菜轉錄組數(shù)據(jù)。因此，BvHATs 基因在鹽脅迫和堿脅迫下的表達模式通過SRA 數(shù)據(jù)獲取，低溫脅迫下的表達模式利用RNA-seq 對低溫處理后甜菜實驗進行轉錄組測序。將甜菜‘KWS9147’播種于方盆中（12 cm×12 cm×10 cm），在溫度（24±2）℃、光照強度為200μmol/(m2·s)、光周期16 h/8 h 條件下進行培養(yǎng)。將生長24 d 的甜菜幼苗分別進行常溫（24 ℃)和低溫（4 ℃）培養(yǎng)24 h 后剪取葉片進行總RNA 的提取。隨后，通過RNA-seq 獲得低溫脅迫前后甜菜轉錄組數(shù)據(jù)。鹽脅迫和堿脅迫葉片轉錄組數(shù)據(jù)則從SRA 數(shù)據(jù)庫中獲取。鹽脅迫處理條件為土培澆灌含有300 mmol/L NaCl 霍格蘭營養(yǎng)液處理21 d；堿脅迫處理條件為水培pH9.67 堿性霍格蘭營養(yǎng)液（含50 mmol/L NaHCO3和25 mmol/L Na2CO3）處理7 d。甜菜轉錄組數(shù)據(jù)采用Salmon 對基因進行定量，計算各轉錄本TPM值，獲得BvHATs在低溫脅迫、鹽脅迫、堿脅迫下的表達模式。

2 結果與分析

2.1 HAT家族基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

為明確HAT 家族成員之間的系統(tǒng)發(fā)育關系構建系統(tǒng)進化樹（圖1），7 個BvHATs 分別屬于GNAT、TAFII250 和CBP 家族。GNAT 家族含有4 個甜菜基因，CBP 家族含有2 個甜菜基因，TAFII250 家族含有1 個甜菜基因。BvHATs 常與菠菜、綠穗莧、藜麥等莧科植物HAT 位于同一亞枝，而與十字花科（擬南芥、蕪菁）、豆科（大豆、豌豆）植物常位于不同亞枝。這說明莧科內HAT家族成員保守性較強，莧科HAT 可能與其他科屬植物HAT的具有不同的調控功能。

圖1 HAT基因家族系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of HAT gene family

2.2 BvHATs的理化性質

BvHATs 編碼蛋白在氨基酸長度、分子量大小和等電點上都存在著一定的差異性（表2）。GNAT 家族成員的氨基酸數(shù)目在461～753 aa，蛋白質分子量在51.8～83.3 kDa，蛋白等電點在5.32～8.73。與其他的CBP和TAFII250 家族成員相比，具有較小蛋白質分子量，氨基酸數(shù)目均在1 000 aa以下。2個CBP家族的成員氨基酸長度均在1 500 aa 左右，分子量分別為160.8 kDa和187.9 kDa，等電點分別為6.53、8.53。TAFII250 家族的Bv3_058510_ugws的蛋白質序列較長，達到1 904 aa，蛋白質分子量為215.0 kDa，等電點為5.58。

表2 甜菜HAT基因家族信息Table2 Theinformationof HATfamilyin sugarbeet

2.3 BvHATs的染色體定位分析

為了解BvHATs在基因組的分布情況，利用TBtools軟件進行了染色體定位分析，結果表明所有的BvHATs基因均位于核基因組（圖2）。Bv2_026300_ydyh定位于Chr2 染色體的上端。Bv3_058510_ugws和Bv4_085980_ujsz分別位于Chr3 和Chr4 染色體的中部位置。Bv5_120220_wckr則定位于Chr5 染色體的下端。在Chr7 染色體上分布有3 個基因，其中，Bv7_166250_wdiq定位到染色體上端，而Bv7_178170_nxgz和Bv7_178460_zusm并未確定在Chr7染色體中的具體位置。

圖2 BvHATs基因染色體定位Fig.2 The distribution of BvHATs in the chromosome

2.4 BvHATs功能結構域分析

通過hmmscan 對BvHATs含有的功能結構域進行注釋（圖3）。GNAT 家族中，Bv7_178460_zusm.t1、Bv5_120220_wckr.t1、Bv7_166250_wdiq.t1都含有Acetyltransf_1或Acetyltransf_10這兩個乙酰轉移酶功能結構域，但Bv4_085980_ujsz.t1中未注釋到相關結構域。除Acetyltransf結構域外，各GNAT家族成員含有的其他結構域差異較大。Bv7_178460_zusm.t1含有兩個Radical_SAM 結構域，可以催化包括異常甲基化、異構化、硫插入、環(huán)形成、厭氧氧化和蛋白質自由基形成等多種反應。Bv5_120220_wckr.t1和Bv4_085980_ujsz.t1含有的bromodomain 結構域能夠參與識別組蛋白賴氨酸乙酰化修飾并促進蛋白發(fā)生互作關系。CBP 家族的Bv2_026300_ydyh.t1、Bv7 178170 nxgz.t1皆含有HAT_KAT11 保守結構域。此外，Bv7_178170_nxgz.t1在HAT_KAT11 兩端含有zf-TAZ 和ZZ 鋅指結構，這與擬南芥等植物CBP 成員功能結構域分布相同。Bv2_026300_ydyh.t1兩端缺少zf-TAZ和ZZ，但含有PHD 鋅指結構。TAFII250家族成員Bv3_058510_ugws.t1含有保守的TFIID 轉錄因子亞基，并在其上游和下游分別含有ubiquitin 泛素化修飾結構域和bromodomain 結構域。這與擬南芥TAFII250亞家族具有相同的結構域特征。此外，Bv3_058510_ugws.t1還在N末端含有TATA盒結合蛋白結合結構域（TBP-bindingdomain），可能在調控目標基因表達中具有一定功能。

圖3 BvHATs功能結構域分析Fig.3 Analysis of function domain in BvHATs

2.5 非生物脅迫下BvHATs表達模式分析

對BvHATs 家族基因在鹽脅迫、堿脅迫和低溫脅迫下的轉錄組數(shù)據(jù)進行分析（圖4）。結果表明，BvHATs家族基因在不同非生物脅迫下呈現(xiàn)出不同的表達規(guī)律。在鹽脅迫下，各個BvHATs 表達量均未發(fā)生顯著變化。其中，Bv4_085980_ujsz在不同鹽脅迫樣品中表達量差異較大，部分樣品中TPM 值為2～3，而在一些重復中TPM 值為0。除Bv3_058510_ugws、Bv7_166250_wdiq上調不顯著外，其余BvHATs均在堿脅迫后表達量顯著上調，但僅有Bv4_085980_ujsz變化倍數(shù)超過2 倍。在冷脅迫下，CBP家族基因Bv2_026300_ydyh表達量顯著下調。

圖4 不同脅迫下BvHATs的表達模式Fig.4 Expression patterns of BvHATs under various stresses

3 討論與結論

組蛋白乙酰轉移酶是一種重要的酶類，在轉錄激活、細胞周期調控、DNA 復制、修復等生理過程中起到很大作用[35]。HAT一共含有GNAT、MYST、CBP 和TAFII250四個基因家族[36]。通過比對擬南芥中已知HAT序列，在甜菜基因組中共鑒定到7 個BvHATs。從基因數(shù)目和系統(tǒng)進化樹結果來看，GNAT 和TAFII250 家族基因在莧科和十字花科分化后沒有出現(xiàn)明顯的基因加倍事件，而擬南芥CBP 家族成員數(shù)目（5 個）明顯多于甜菜（2 個）。同時，甜菜中缺少MYST 家族成員。這些結果暗示甜菜和擬南芥HAT 在調控生長發(fā)育和脅迫響應中可能存在一定差異。

研究表明，AtGCN5 能夠與CBF1、DREB2A、AREB1～2 等脅迫響應相關的轉錄因子相互作用形成蛋白復合體，催化H3K9、H3K14、H3K27、H4K4、H4K5 位點的乙酰化修飾[37-39]。此外，AtHAC1、AtHAF2等基因也被發(fā)現(xiàn)參與鹽脅迫、低溫、光脅迫等應答過程[40]。BvHATs 是否參與鹽脅迫和低溫等應答過程值得探究。為此我們通過系統(tǒng)進化樹分析和非生物脅迫下基因表達模式分析尋找可能的非生物脅迫應答B(yǎng)vHATs。通過系統(tǒng)進化樹分析，篩選出Bv5_120220_wckr為AtGCN5的直系同源基因。但是系統(tǒng)進化樹結果表明莧科植物與十字花科植物HAT分別形成不同亞枝，暗示其基因功能存在一定差異。根據(jù)不同脅迫下的表達特性分析可知，Bv5_120220_wckr僅在堿脅迫中基因水平顯著上調，所以Bv5_120220_wckr是否參與甜菜鹽漬、低溫等脅迫仍需進一步研究?；谵D錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)多個BvHATs在鹽堿和低溫脅迫中表達模式發(fā)生顯著變化。特別是CBP 家族基因Bv2_026300_ydyh在低溫脅迫后表達量顯著下調，暗示其參與低溫應答過程。而Bv4_085980_ujsz和Bv7_178170_nxgz響應堿脅迫。這與擬南芥中低溫、鹽脅迫等多個非生物脅迫響應均由At-GCN5參與調控不同，甜菜中不同脅迫的應答可能由不同HAT 成員參與。綜上，本研究為進一步闡明BvHATs功能及其調控機制提供了一定基礎信息。