閆嵩 柳馳 任偉超 劉秀波 徐姣 馬偉

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱，150040)(開(kāi)姆尼茨工業(yè)大學(xué)，德國(guó)·開(kāi)姆尼茨)(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué))

柳葉芹(Czernaevialaevigataturcz.)是傘形科多年生植物。從形態(tài)學(xué)研究可知，傘形科植物的果實(shí)，因其具有豐富的變異和穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)而成為最顯著的分類器官；傘形科物種果實(shí)的翅、油管、內(nèi)果皮、心皮柄等特征，被用于物種的分類[1-5]；但也有研究認(rèn)為，這些變異的果實(shí)性狀很難推斷出傘形科物種內(nèi)部的進(jìn)化關(guān)系[6]。現(xiàn)代藥物化學(xué)研究表明，傘形科植物具有大量的揮發(fā)油、香豆素、三萜皂苷、生物堿等多種化學(xué)成分[7]。Suleimen et al.[8]采用高效液相色譜法，成功檢測(cè)到了33種揮發(fā)油成分，除此之外還含有少量香豆素。

葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的場(chǎng)所，是一種半自主復(fù)制的細(xì)胞器，具有單獨(dú)的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、相對(duì)獨(dú)立的遺傳信息，其結(jié)構(gòu)和遺傳信息在研究親緣關(guān)系方面具有重要的作用[9]。葉綠體基因組具有大小適中、便于測(cè)序，且在不同物種間有良好的共線性等特點(diǎn)，有利于基因組之間的比較分析[10]。近幾年，隨著高通量技術(shù)的發(fā)展，葉綠體基因組在多種藥用植物[11-16]的物種鑒定及分類、系統(tǒng)發(fā)育與進(jìn)化、遺傳多樣性分析等方面得到了廣泛應(yīng)用。

柳葉芹是一種重要的藥用植物。以往關(guān)于柳葉芹的研究，主要集中在描述其形態(tài)變異和化學(xué)成分方面；但對(duì)柳葉芹的分子和進(jìn)化方面的研究減少。為此，本研究在依據(jù)本課題組前期對(duì)柳葉芹葉綠體基因組研究[17]的基礎(chǔ)上，以2020年5月31日采自黑龍江省伊春市的柳葉芹為試驗(yàn)材料，利用十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB)提取基因組DNA，采用Illumina NovaSeq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，得到柳葉芹完整的葉綠體基因組序列，分析柳葉芹葉綠體基因組組裝、序列特征、系統(tǒng)發(fā)育。深層次挖掘葉綠體基因組信息，對(duì)組裝后的葉綠體基因組結(jié)構(gòu)、長(zhǎng)重復(fù)序列、簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)位點(diǎn)、密碼子偏好性進(jìn)行分析，并與其他傘形科植物共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。旨在為研究傘形科其他植物提供較為詳細(xì)、完善的資料，為該物種鑒定以及群體和個(gè)體水平的遺傳差異分析提供新的方法。

1 材料與方法

試驗(yàn)材料：柳葉芹(Czernaevialaevigataturcz.)植物樣本，于2020年5月31日采自黑龍江省伊春市。取部分新鮮葉片用液氮處理，于超低溫低溫冰箱中-80 ℃保存；其余部分保存在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院(標(biāo)本號(hào)：YCL20200531T7)。

柳葉芹的DNA提取與高通量測(cè)序方法：使用十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB)提取的基因組DNA經(jīng)檢測(cè)合格后，用機(jī)械打斷的方法(超聲波)將DNA片段化；后對(duì)片段化的DNA進(jìn)行片段純化、末端修復(fù)、3′端加A、連接測(cè)序接頭，再用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增形成測(cè)序文庫(kù)；建好的文庫(kù)先進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫(kù)用Illumina NovaSeq進(jìn)行測(cè)序(測(cè)序由武漢貝納科技服務(wù)有限公司完成)。通過(guò)SOAPnuke軟件進(jìn)行低質(zhì)量數(shù)據(jù)過(guò)濾。

柳葉芹的葉綠體基因組組裝、注釋與分析方法：使用測(cè)序數(shù)據(jù)拼接軟件(SPAdes)進(jìn)行基因組拼接，利用序列比對(duì)軟件(blastn)將拼接結(jié)果與Czernaevialaevigata(MW284876)參考基因組進(jìn)行比對(duì)分析比對(duì)，依據(jù)比對(duì)情況確定候選序列組裝結(jié)果。利用葉綠體基因組注釋軟件(PGA)[18]對(duì)柳葉芹葉綠體基因組注釋后并繪圖；運(yùn)用葉綠體基因組邊界收縮擴(kuò)張?jiān)诰€分析軟件(IRscope)對(duì)柳葉芹和同屬傘形科5個(gè)物種以及擬南芥葉綠體基因組進(jìn)行比較分析；使用密碼子偏好性分析軟件(CodonW)對(duì)密碼子偏好性進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)估算相對(duì)同義密碼子的使用頻率；采用簡(jiǎn)單重復(fù)序列分析軟件(MISA)[19]對(duì)葉綠體進(jìn)行簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)檢測(cè)。

柳葉芹葉綠體基因組系統(tǒng)進(jìn)化分析方法：從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)中下載傘形科6個(gè)物種的葉綠體基因組序列，分別是北柴胡[BupleurumchinenseDC.(MN893666)]、疏葉當(dāng)歸[AngelicalaxifoliataDiels(NC_040122)]、林當(dāng)歸[AngelicasylvestrisLinnaeus(MN275034)]、細(xì)苞藁本[LigusticumcapillaceumWolff(NC_049051)]、歐芹[Petroselinumcrispum(Mill.) Hill(NC_015821)]、擬南芥[Arabidopsisthaliana(L.) Heynh.]葉綠體基因組(NC_000932)，并將其作為外類群參與系統(tǒng)進(jìn)化分析。通過(guò)核苷酸序列多重比對(duì)軟件(MAFFT)，對(duì)上述7個(gè)物種葉綠體基因組序列進(jìn)行多重比對(duì)，導(dǎo)出的比對(duì)序列利用系統(tǒng)進(jìn)化分析軟件(MEGA 7.0)構(gòu)建鄰接樹(shù)；自舉檢測(cè)值為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 柳葉芹葉綠體基因組基本特征

柳葉芹的葉綠體基因組呈現(xiàn)雙螺旋環(huán)狀結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖1)，基因組全長(zhǎng)146 161 bp，包括2個(gè)反向重復(fù)序列(IRa區(qū)長(zhǎng)度為17 422 bp、IRb區(qū)長(zhǎng)度為17 422 bp)、1個(gè)大單拷貝區(qū)(LSC區(qū)長(zhǎng)度為93 538 bp)、1個(gè)小單拷貝區(qū)(SSC區(qū)長(zhǎng)度為17 779 bp)?；蚪M中包含有2個(gè)基因間隔(Gap)，DNA的4種堿基中鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶所占的比例(GC)為37.54%，組裝覆蓋度為224.3。

圖1 柳葉芹葉綠體基因組圖譜

2.2 柳葉芹葉綠體基因注釋、基因功能及分類

通過(guò)對(duì)柳葉芹葉綠體基因組進(jìn)行注釋，共得到113個(gè)基因(見(jiàn)表1)，可將其分為4個(gè)大類：自身復(fù)制、光合作用、其它基因、未知功能。具有自我復(fù)制功能的基因共70個(gè)，參與光合作用的基因共33個(gè)基因，其它基因共5個(gè)，未知功能基因共5個(gè)。

表1 葉綠體基因組的基因

2.3 柳葉芹葉綠體基因組比較

柳葉芹與其他6種植物的LSC/IRb、IRb/SSC、SSC/IRa、IRa/LSC邊界及基因分布見(jiàn)圖2。柳葉芹與疏葉當(dāng)歸、林當(dāng)歸、細(xì)苞藁本的LSC/IRb的交界處，存在完整的ycl2基因。細(xì)苞藁本Ndhf基因，完整地存在于IRb/SSC交界處；而柳葉芹、疏葉當(dāng)歸、林當(dāng)歸的Ndhf基因，僅存在于SSC區(qū)一側(cè)，且距邊界11～22 bp。柳葉芹、疏葉當(dāng)歸、林當(dāng)歸3個(gè)物種在IRa區(qū)域含有完整的trnL基因，同時(shí)柳葉芹在該區(qū)域還有1個(gè)完整的ndhB基因，而在疏葉當(dāng)歸、林當(dāng)歸中不存在ndhB基因。

圖2 柳葉芹葉綠體基因組的反向重復(fù)區(qū)域和單拷貝區(qū)域邊界

2.4 柳葉芹葉綠體基因組長(zhǎng)重復(fù)序列

所有的長(zhǎng)重復(fù)序列包括3種類型，包括正向重復(fù)序列、回文重復(fù)序列、串聯(lián)重復(fù)序列，這些長(zhǎng)重復(fù)序列具有促進(jìn)葉綠體基因組重排的功能，并且可以增加其居群遺傳多樣性。在柳葉芹葉綠體基因組中，共發(fā)現(xiàn)5個(gè)正向重復(fù)序列、3個(gè)回文重復(fù)序列、4個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列。其中1個(gè)回文重復(fù)序列較長(zhǎng)(為17 422 bp)，是葉綠體基因組的反向重復(fù)區(qū)(IR)，其余重復(fù)序列長(zhǎng)度較短(均在100 bp左右)。利用這些重復(fù)序列，可為后期開(kāi)發(fā)種群進(jìn)化標(biāo)記提供研究基礎(chǔ)。

2.5 柳葉芹葉綠體基因組簡(jiǎn)單重復(fù)序列

簡(jiǎn)單重復(fù)序列，是由基因組中1到6個(gè)核苷酸組成的基本單位重復(fù)多次構(gòu)成的一段DNA序列，廣泛存在于基因組的各個(gè)區(qū)域，具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、相對(duì)保守等優(yōu)點(diǎn)，可用于遺傳多態(tài)性研究[20-21]。通過(guò)對(duì)柳葉芹葉綠體基因組的分析，共有205個(gè)簡(jiǎn)單重復(fù)序列位點(diǎn)，包括：138個(gè)復(fù)雜重復(fù)類型，其數(shù)量最多；沒(méi)有單核苷酸重復(fù)類型；52個(gè)二核苷酸重復(fù)類型；2個(gè)三核苷酸重復(fù)類型；8個(gè)四核苷酸重復(fù)類型；1個(gè)五核苷酸重復(fù)類型。97.56%的簡(jiǎn)單重復(fù)序列位點(diǎn)都含有腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)的堿基對(duì)，僅有5個(gè)簡(jiǎn)單重復(fù)序列位點(diǎn)由鳥(niǎo)嘌呤(G)-胞嘧啶(C)堿基對(duì)組成，說(shuō)明腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)堿基對(duì)具有堿基偏好性。從堿基組成方面分析，這與柳葉芹葉綠體基因組中腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)堿基對(duì)比例較高(62.38%)相一致。

2.6 柳葉芹與同屬物種的親緣關(guān)系

葉綠體基因組的聚類分析，對(duì)植物發(fā)育進(jìn)化研究具有重要意義。本研究選用5種已報(bào)道的傘形科植物葉綠體基因組，并以擬南芥的葉綠體基因組作為外類群，通過(guò)構(gòu)建鄰接樹(shù)(NJ-tree)，對(duì)柳葉芹進(jìn)行進(jìn)化分析，以確定其在傘形科植物中的進(jìn)化位置(見(jiàn)圖3)。由圖3可見(jiàn)：不同科的植物分為不同的進(jìn)化分支，6種傘形科植物聚在1個(gè)分支上，說(shuō)明植物科間關(guān)系明確。在這個(gè)大的分支基礎(chǔ)上，柳葉芹與同屬物種聚到一支上，并且自展值為100，說(shuō)明柳葉芹與同屬物種在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中親緣關(guān)系最為接近。

圖3 依據(jù)柳葉芹和6個(gè)物種葉綠體基因組構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討論

葉綠體基因組大小一般在70～220 kbp之間，隨著物種的不同而不同[22-23]。已有研究表明，導(dǎo)致葉綠體基因組大小發(fā)生顯著變化的主要原因，是反向重復(fù)區(qū)的顯著擴(kuò)張、收縮，甚至丟失。光合作用是影響反向重復(fù)區(qū)區(qū)大小的因素之一。有研究[24]表明，寄生植物的葉綠體基因組相對(duì)較小，主要是由于反向重復(fù)區(qū)區(qū)收縮導(dǎo)致的。葉綠體基因組通常含有100～120個(gè)編碼基因，其中蛋白編碼基因占總數(shù)80%以上，而tRNA、rRNA占比較少。在對(duì)葉綠體功能基因注釋的結(jié)果也能發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)的基因與光合作用以及基因轉(zhuǎn)錄翻譯相關(guān)。因此，深入分析植物葉綠體基因組，有助于了解植物在光合作用過(guò)程中相關(guān)機(jī)制。

葉綠體基因組具有高度保守性，不易于重組，在一定程度上保留了植物的進(jìn)化信息，因而在植物系統(tǒng)發(fā)育分析上，葉綠體基因組被認(rèn)為是一個(gè)遺傳信息豐富、有價(jià)值的多層次的分類資源。本研究對(duì)柳葉芹葉綠體基因組進(jìn)行測(cè)序及數(shù)據(jù)挖掘，通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，起轉(zhuǎn)錄翻譯作用和參與光合作用過(guò)程的基因，占被注釋到基因總數(shù)的91.15%，這與多數(shù)植物葉綠體基因組中基因功能一致。柳葉芹97.56%的簡(jiǎn)單重復(fù)序列位點(diǎn)都含有腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)的堿基對(duì)，這與該物種葉綠體基因組整體腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)比例相一致。通過(guò)將柳葉芹與其它傘形科植物以及以擬南芥作為外類群植物構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果表明：柳葉芹與疏葉當(dāng)歸的關(guān)系最為接近，支持率達(dá)100%。

4 結(jié)論

本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)柳葉芹葉綠體進(jìn)行測(cè)序，并進(jìn)行了長(zhǎng)重復(fù)序列、簡(jiǎn)單重復(fù)序列位點(diǎn)、密碼子偏好性、近緣種葉綠體基因組比較、系統(tǒng)進(jìn)化的分析。為傘形科植物研究提供了更為詳細(xì)、完善的資料，為該物種鑒定以及群體和個(gè)體水平的遺傳差異分析提供了新的方法。