李鳳迪，王嘉瑞，劉新宇，黃海巖，葉麗萍，曾 艷，曹 欣

(1.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心，生物工程與技術(shù)國家民委重點實驗室，蘭州 730030；2.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心，甘肅省動物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心，蘭州 730030；3.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院， 蘭州 730030；4.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林省動物微生態(tài)制劑工程研究中心，長春 130118)

【研究意義】輪狀病毒(Rotavirus, RV)屬呼腸孤病毒科，輪狀病毒屬，基因組由11段dsRNA組成，共編碼12種蛋白，包括6種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1～VP4,VP6及VP7)和6種非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1～NSP6)[1-2]。其中結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成病毒的3層衣殼，而非結(jié)構(gòu)蛋白影響病毒的復(fù)制和基因表達(dá)調(diào)控過程[3]。輪狀病毒是引起幼兒和動物幼畜病毒性腹瀉的重要病原體[4-5]。結(jié)合RV的基因組結(jié)構(gòu)和抗原性將其分為7個組即A～G，其中A～C組能引起人畜感染，D～G組主要引起動物感染，而A組輪狀病毒又是導(dǎo)致幼兒和動物幼畜腹瀉的主要病原體。人和動物在感染輪狀病毒后，輕者癥狀為嘔吐、厭食、腹瀉、脫水等，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡[6-7]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】NSP1蛋白由RV的第5段基因編碼，在RV蛋白質(zhì)組中保守程度最低，不同來源毒株的NSP1差異較大。NSP1通過多種途徑拮抗干擾素應(yīng)答。NSP1通過蛋白酶體途徑可使IRF3快速降解，缺乏IFN啟動子活性[8-9]。NSP3蛋白通常由RV7，8或9基因片段編碼，具體的基因片段與病毒株的種類有關(guān)，一般由313個氨基酸殘基組成，為非糖基化蛋白。Trujillo-Alonso等[10]研究發(fā)現(xiàn)輪狀病毒感染誘導(dǎo)了UPR(Unfolded protein response，未折疊的蛋白反應(yīng))，而UPR在翻譯水平上被病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NSP3抑制。這種反應(yīng)似乎是由病毒復(fù)制周期中合成的病毒產(chǎn)物觸發(fā)的，更有可能是由一種或多種病毒蛋白合成的，而不是由病毒dsRNA觸發(fā)的，與谷鳳麗等[3]從感染RV的MA104細(xì)胞裂解物中分離得到具有復(fù)制酶活性的NSP3，都表明NSP3可能在病毒的復(fù)制和形態(tài)中起重要作用?！颈狙芯壳腥朦c】本文對猿輪狀病毒SA11株病毒的NSP1和NSP3的基因進(jìn)行克隆和真核表達(dá)載體構(gòu)建，基于雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)判定NSP1和NSP3蛋白對IFN-β/ISRE報告基因活性的影響，初步確定NSP3蛋白對IFN-I信號通路的調(diào)控功能。【擬解決的關(guān)鍵問題】輪狀病毒NSP3蛋白對IFN-I信號通路的調(diào)控作用初探，為研究NSP3蛋白如何拮抗宿主IFN-I抗病毒反應(yīng)的分子機(jī)理提供研究材料和奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 細(xì)胞系、載體和菌種 人胚腎上皮細(xì)胞(HEK293T)由吉林省動物微生態(tài)制劑工程研究中心保存；pRK-Flag載體、pRK-HA載體、pUCm-T載體由本實驗室保存，感受態(tài)菌種為大腸桿菌DH5α菌種。

1.1.2 主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、PBS磷酸鹽緩沖液、青霉素—鏈霉素溶液(雙抗)、胎牛血清(FBS)、各種限制性內(nèi)切酶(SalI-HF、NotI -HF)、T4 DNA連接試劑盒、Lipo6000TM轉(zhuǎn)染試劑、Western一抗稀釋液、HA標(biāo)簽抗體、Flag標(biāo)簽抗體、螢火蟲熒光素酶裂解液、雙熒光素酶檢測試劑盒等。

1.1.3 主要設(shè)備 全自動高壓滅菌器、微量移液器(2.5、10、100、200、1000 μL)、PCR擴(kuò)增儀、瓊脂糖凝膠電泳槽、凝膠成像分析系統(tǒng)、離心機(jī)、搖床、化學(xué)發(fā)光儀Amersham Imager 600 System、熒光檢測儀等。

1.2 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank上Rotavirus A NSP1 gene for NSP1, strain: SA11(GenBank: LC178570.1)和Rotavirus A NSP3 gene for NSP3，strain: SA11(GenBank: LC178572.1)基因序列分別設(shè)計上下游引物，序列如表1。引物設(shè)計時需在其前加入限制性內(nèi)切酶位點(SalⅠ為上游引物，NotⅠ為下游引物)及保護(hù)性堿基，SalⅠ限制性內(nèi)切酶識別位點前加GTCGAC保護(hù)堿基，NotⅠ限制性內(nèi)切酶識別位點前加GCGGCCGC保護(hù)堿基。引物提交生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行合成[11]。

1.3 PCR擴(kuò)增

以pUCm-T克隆載體為模版，通過PCR擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行目的基因片段NSP1和NSP3的擴(kuò)增，反應(yīng)體系為100 μL，反應(yīng)體系如表2。反應(yīng)程序為：預(yù)變性98 ℃ 20 s；變性98 ℃ 10 s，退火55 ℃ 5 s，延伸72 ℃30 s，共循環(huán)30次；最終延伸72 ℃ 2 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)核酸電泳驗證正確后將條帶切下，用康為膠回收試劑盒進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物與TaKaRa rTaq酶1∶1混合后，72 ℃延伸15 min，使目的基因加上A尾，用康為DNA純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物。純化產(chǎn)物用于連接或-20 ℃保存。

表1 Rotavirus A NSP1和NSP3的引物信息

表2 PCR反應(yīng)體系

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及測序鑒定

將加了A尾的NSP1和NSP3片段與TaKaRa 的pMD18-T載體連接，16 ℃連接過夜，連接體系如表3。連接的產(chǎn)物通過熱激法轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)菌中37 ℃搖床培養(yǎng)1 h，取適量菌液涂布帶有Amp抗性的LB平板37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取單菌落于液體LB培養(yǎng)基(含100 μg/mL Amp)中37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，通過康為質(zhì)粒小量提取試劑盒提質(zhì)粒，用SalI和NotI 進(jìn)行雙酶切37 ℃4 h，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，將大小正確的片段進(jìn)行膠回收。

表3 連接反應(yīng)體系

1.5 連接至真核表達(dá)載體

酶切產(chǎn)物連接至pRK-Flag/pRK-HA載體。16 ℃連接過夜，連接體系如表4。連接產(chǎn)物通過熱激法轉(zhuǎn)化DH5α，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗證，驗證正確的重組質(zhì)粒用康為質(zhì)粒中提試劑盒提取無內(nèi)毒素質(zhì)粒，用于轉(zhuǎn)染，并送往生工生物公司測序。

表4 連接反應(yīng)體系

1.6 轉(zhuǎn)染

以2×105cell/孔HEK293T細(xì)胞接種于24孔板，待細(xì)胞長至70%～90%時，，將構(gòu)建成功的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用等體積DMEM分別稀釋pRK-Flag-NSP1/pRK-HA-NSP1和pRK-Flag-NSP3/pRK-HA-NSP3質(zhì)粒以及Lipofectamine 6000 1 μL/孔轉(zhuǎn)染試劑，充分混勻室溫靜置5 min，再將質(zhì)?；旌衔锱c轉(zhuǎn)染試劑混合物輕輕混勻室溫靜置20 min，將混合物緩慢滴加至HEK293T中，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。

1.7 Western Blot 鑒定蛋白的表達(dá)情況

棄去細(xì)胞培養(yǎng)基后，用RIPA和2×SDS-PAGE Buffer混合物進(jìn)行裂解，100 ℃金屬浴10 min，12 000 r/min離心1 min。取上清進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)SDS-PAGE后將蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，孵育一抗稀釋液/二抗稀釋液各1 h后，利用化學(xué)發(fā)光儀Amersham Imager 600 System系統(tǒng)成像分析。

1.8 雙熒光素酶報告基因檢測

HEK293T細(xì)胞以2×105個細(xì)胞每孔接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待其融合度達(dá)70%左右按照1.7步驟轉(zhuǎn)染。分別轉(zhuǎn)染IFN-β-Luc、ISRE-Luc、和pRL-TK質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)染pRK-Flag-NSP1和pRK-Flag-NSP3作為實驗組、轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒作為陰性對照、轉(zhuǎn)染通路上游質(zhì)粒pRK-Flag-RIG-IN作為陽性對照，每組設(shè)置3個重復(fù)。轉(zhuǎn)染24 h后，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液，加入100 μL熒光素?zé)晒馑孛讣?xì)胞裂解液，置于震板儀上震蕩10 min，取20 μL上清與螢火蟲熒光素酶底物以及海腎熒光素酶底物按1∶1∶1混勻，利用熒光素酶檢測儀檢測螢火蟲熒光和海參熒光。記錄2次熒光值以及二者比值。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增目的基因

以帶有輪狀病毒SA11株NSP1、NSP3編碼基因的克隆載體為模板進(jìn)行PCR基因擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后得到NSP1和NSP3基因條帶(圖1)，條帶順序依次是2000 DNA marker、NSP1、NSP1、2000 DNA marker、NSP3、NSP3。目的條帶大小在900～1500 bp。經(jīng)查閱， NCBI中NSP1基因大小約為1491 bp，NSP3基因大小約948 bp，與預(yù)期一致，可進(jìn)行下一步試驗。

圖1 NSP1和NSP3基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Result of PCR amplification product of NSP1 and NSP3 gene

2.2 pRK-Flag-NSP1/pRK-HA-NSP1和pRK-Flag-NSP3/pRK-HA-NSP3重組質(zhì)粒的鑒定

對通過Amp抗性篩選的菌落提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到2條約為1491和948 bp的條帶，符合預(yù)期結(jié)果見圖2，NSP1和NSP3特異性條帶與預(yù)期一致，故可確認(rèn)NSP1和NSP3基因插入到pRK-Flag/pRK-HA載體中，但重組質(zhì)粒 pRK-Flag-NSP1/pRK-HA-NSP1和pRK-Flag-NSP3/pRK-HA-NSP3能否表達(dá)NSP1和NSP3 蛋白仍需進(jìn)一步驗證。

圖2 pRK-Flag-NSP1/pRK-HA-NSP1和pRK-Flag-NSP3/pRK-HA-NSP3重組質(zhì)粒鑒定Fig.2 The identification of pRK-Flag-NSP1/pRK-HA-NSP1 and pRK-Flag-NSP4/pRK-HA-NSP4 recombinant plasmid

2.3 真核表達(dá)載體的表達(dá)驗證

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后裂解細(xì)胞提取蛋白，處理后通過Western Blot，以HA標(biāo)簽抗體或Flag標(biāo)簽抗體作為一抗，檢測表達(dá)水平，圖3a～d分別為pRK-HA-NSP1、pRK-HA-NSP3、pRK-Flag-NSP1、pRK-Flag-NSP3，結(jié)果顯示，表達(dá)的NSP1和NSP3蛋白分別為59和37 kDa，可見與預(yù)期結(jié)果相符，表明目的蛋白表達(dá)，可進(jìn)行下一步試驗。

圖3 Wester blotting 檢測結(jié)果Fig.3 The identification result of protein expressed by Western-blotting

2.4 檢測NSP1、NSP3蛋白對IFN-β和ISRE啟動子活性的影響

為進(jìn)一步探究NSP1和NSP3蛋白對I型干擾素表達(dá)的影響，利用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)，在IFN-I通路上游關(guān)鍵信號分子RIG-IN刺激下，檢測NSP1和NSP3蛋白對IFN-β和ISRE啟動子活性的影響。由圖4顯示，NSP1和NSP3蛋白可抑制由RIG-IN介導(dǎo)的IFN-β和ISRE啟動子活性，證明NSP1和NSP3蛋白對IFN-β信號通路有抑制作用。

圖4 NSP1和NSP3抑制RIG-IN介導(dǎo)的IFN-β和ISRE啟動子活性Fig.4 NSP1 and NSP3 inhibition of the IFN-β and ISRE promoter activities induced by RIG-IN

3 討 論

本研究對合成猿輪狀病毒SA11株的非結(jié)構(gòu)蛋白NSP1和NSP3基因進(jìn)行PCR，獲得目的基因片段擴(kuò)增，并在體外構(gòu)建真核表達(dá)載體pRK-Flag-NSP1/pRK-HA-NSP1、pRK-Flag-NSP3/pRK-HA-NSP3,成功驗證表達(dá)出目的蛋白并獲得其蛋白印跡。后續(xù)檢測了NSP1和NSP3蛋白對IFN-β和ISRE啟動子活性的影響，結(jié)果顯示，二者均可抑制由RIG-I N介導(dǎo)的IFN-β和ISRE啟動子活性，初步證明了NSP1和NSP3蛋白對IFN-β信號通路有抑制作用。

輪狀病毒是導(dǎo)致嬰幼兒病毒性腹瀉的最重要原因之一，全世界每年約有50萬人死于輪狀病毒。正因為RV具有強(qiáng)突變性，也存在季節(jié)性和地域性的問題，導(dǎo)致對RV的醫(yī)治僅在改善階段，無法達(dá)到清除的效果[1,10]。其中RV NSP1是拮抗宿主先天性免疫的關(guān)鍵蛋白，是病毒產(chǎn)生對抗IFN-I的廣譜拮抗劑，從而抑制IFN-I的產(chǎn)生，拮抗先天性免疫[12-13]；NSP3蛋白與病毒粒子感染細(xì)胞有關(guān)，前人已經(jīng)研究了病毒蛋白與RNA之間的相互作用，其N端可以與RV mRNA3′保守末端結(jié)合，C端與Poly(A)結(jié)合引起宿主細(xì)胞關(guān)閉mRNA的翻譯[3, 14-15]，從而使NSP3在輪狀病毒復(fù)制中的起到作用。就目前了解到NSP1蛋白已有對干擾素信號通路的研究報道，本研究結(jié)果也符合前人研究的結(jié)論，確證了NSP1蛋白拮抗先天免疫的功能。目前NSP3蛋白對IFN-I信號通路的調(diào)控機(jī)制知之甚少，本試驗對其調(diào)控IFN-I信號通路的功能進(jìn)行初步探究，發(fā)現(xiàn)NSP3對RIG介導(dǎo)抗病毒免疫具有明顯的抑制作用。為闡明NSP3蛋白產(chǎn)生抗病毒作用的原理提供理論依據(jù)，為后續(xù)揭示NSP3蛋白調(diào)節(jié)IFN-I功能及進(jìn)一步研究病毒感染后機(jī)體抗病毒天然免疫過程具有重要意義。

4 結(jié) 論

本研究以PCR技術(shù)擴(kuò)增猿輪狀病毒SA11株NSP1和NSP3的基因序列，將其克隆到pRK真核表達(dá)載體中，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pRK-Flag-NSP1/pRK-HA-NSP1和pRK-Flag-NSP3/pRK-HA-NSP3，通過Western Blot檢測細(xì)胞中存在特異性外源蛋白的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)NSP1和NSP3可以抑制RIG-IN介導(dǎo)的IFN-β及ISRE啟動子活性，為后續(xù)探索NSP3蛋白調(diào)控IFN-I信號通路具體分子機(jī)制提供實驗基礎(chǔ)，為將來抗RV疫苗的開發(fā)和有效預(yù)防RV感染奠定理論基礎(chǔ)。