周 力，張峰碩，桂林生，侯生珍

(青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016)

【研究意義】青海黑藏羊俗稱貴德黑裘皮羊，主要集中分布于青海省海南藏族自治州貴南縣[1]。黑藏羊具有體格較大、體質(zhì)結(jié)實(shí)，肌肉發(fā)育適中，繁殖性能強(qiáng)，生長速度較快，且肉質(zhì)細(xì)嫩多汁，膻味輕，風(fēng)味好等特性[2]。最主要的特點(diǎn)為全身被毛及皮膚為純黑色，隨著年齡增大毛色逐漸變成黑紅或灰色[3]。由于早期對(duì)該品種保護(hù)意識(shí)不強(qiáng)，造成種群數(shù)量銳減，幾乎瀕臨滅絕。近年來，黑藏羊產(chǎn)業(yè)正從生產(chǎn)裘皮向肉用轉(zhuǎn)型，此時(shí)若能了解黑藏羊的品種特性對(duì)于調(diào)動(dòng)當(dāng)?shù)啬撩耩B(yǎng)殖積極性，提高經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】肺是氧氣運(yùn)輸?shù)恼{(diào)控中心，反芻動(dòng)物通過肺從外界環(huán)境攝取氧氣，并且為機(jī)體提供所需的氧分子[4]。為了適應(yīng)高原低氧環(huán)境，動(dòng)物肺部結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生明顯的生理變化[5]。目前，許多學(xué)者都是圍繞藏系綿羊生長發(fā)育[6]、飼養(yǎng)方式[7]、營養(yǎng)需求[8]以及肌肉品質(zhì)[9]等方面進(jìn)行了大量研究，但對(duì)青海特色資源黑藏羊的研究相對(duì)匱乏，關(guān)于其肺組織適應(yīng)低氧環(huán)境的遺傳機(jī)制更是未見相關(guān)報(bào)道。【本研究切入點(diǎn)】研究黑藏羊的低氧適應(yīng)機(jī)制對(duì)于推動(dòng)畜牧業(yè)的發(fā)展具有重要的意義，同時(shí)低氧是癌癥等重大疾病產(chǎn)生的重要原因，進(jìn)行低氧適應(yīng)原理的研究，也可為高原疾病的治療提供相應(yīng)思路。【擬解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)擬以生活在高寒牧區(qū)的黑藏羊?yàn)樵囼?yàn)對(duì)象，通過研究不同精粗比日糧對(duì)育成期黑藏羊肺形態(tài)發(fā)育、抗氧化酶活性及其相關(guān)基因表達(dá)的影響，以期為肉羊的飼養(yǎng)管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)

飼養(yǎng)試驗(yàn)于2021年2—6月青海省海南州貴南縣黑藏羊繁育中心進(jìn)行，試驗(yàn)期128 d，其中預(yù)試期8 d，正試期120 d。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選擇60只體況良好、體重相近(10.45±0.96)kg的2月齡斷奶黑藏羊，隨機(jī)分為3個(gè)處理組，每組20只，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)4只。分別飼喂精粗比為70∶30、50∶50和30∶70的日糧。試驗(yàn)期間每天08:00和17:30將精料與粗料攪拌混勻后飼喂羔羊，粗飼料由燕麥青貯和燕麥青干草組成(以干物質(zhì)1∶1計(jì))，自由采食和自由飲水。日糧設(shè)計(jì)參考中國《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 816—2004)以及結(jié)合當(dāng)?shù)夭匮蝻曫B(yǎng)實(shí)際情況進(jìn)行飼糧的配制，其日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 日糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.3 樣品采集與處理

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，每組中隨機(jī)選取5只黑藏羊于清晨空腹屠宰(禁食12 h、禁水2 h)，然后迅速剪取每只試驗(yàn)羊右側(cè)的肺臟組織兩份，其中一份放入4%多聚甲醛溶液中固定48 h，用于觀察組織形態(tài)學(xué)，另一份置于液氮中，用于抗氧化酶活性及其相關(guān)基因的測(cè)定。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 肺組織形態(tài)發(fā)育的測(cè)定 試驗(yàn)采用常規(guī)石蠟進(jìn)行包埋，利用蘇木精—伊紅(HE)染色法進(jìn)行染色。應(yīng)用電腦Imaginge pro plus 6.0軟件和OlympusBX 51顯微鏡進(jìn)行觀察和拍照，測(cè)量指標(biāo)包括：肺泡隔厚度、單個(gè)肺泡面積、單位面積肺泡數(shù)、血管數(shù)、血管直徑、中膜厚度以及中膜厚度/血管直徑。每個(gè)樣本觀察3張非連續(xù)切片，每張切片選取5個(gè)視野，每個(gè)視野分別測(cè)定3組數(shù)據(jù)，結(jié)果取其平均值。

1.4.2 肺組織抗氧化酶活性的測(cè)定 從液氮中取肺臟樣品，經(jīng)過研磨，用生理鹽水稀釋成10%組織勻漿，-20 ℃保存?？寡趸富钚灾笜?biāo)包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)。操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，購自江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司。

1.4.3 抗氧化酶相關(guān)基因表達(dá)的測(cè)定 采用Trizol法提取肺組織的總RNA，RNA的濃度和質(zhì)量通過OD260/280和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行。檢測(cè)合格后利用北京天根生化科技有限公司提供的FastKing RT kit cDNA的第一鏈合成試劑盒將提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。利用羅氏LightCycler 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀測(cè)定SOD、CAT和GSH-Px基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)體系為20 μL，其中包括1.0 μL cDNA模板、10 μL 2× SuperReal Color PreMix和正、反游引物各0.6 μL，用RNasc-free ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件為∶95 ℃預(yù)變性15 min;95 ℃變性10 s，60 ℃退火/延伸30 s，循環(huán)數(shù)為40。以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參，目的基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-△△CT法[10]計(jì)算。引物均由上海生工公司負(fù)責(zé)合成，引物序列見表2。

表2 引物序列及參數(shù)

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

初始數(shù)據(jù)經(jīng)過 Excel 2019整理，應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，試驗(yàn)結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”(Mean±SD)表示，以P<0.05作為顯著性判斷的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同精粗比日糧對(duì)黑藏羊肺臟發(fā)育的影響

2.1.1 黑藏羊肺組織HE染色結(jié)果 采用HE染色法對(duì)各組黑藏羊肺組織進(jìn)行染色，在20×10倍的顯微鏡下觀察，標(biāo)尺為50 μm，結(jié)果如圖1所示。

Ⅰ:肺泡；Ⅱ血管；Ⅲ:中膜；Ⅳ:肺泡隔Ⅰ:Alveolus; Ⅱ:Blood vessels; Ⅲ: Membrane; Ⅳ: Alveolar septum圖1 不同精粗比日糧下黑藏羊肺組織HE染色結(jié)果Fig.1 HE staining results of lung tissues of black Tibetan sheep under different diets of concentrate to forage ratio

2.1.2 不同精粗比日糧對(duì)黑藏羊肺組織發(fā)育的影響 由表3可知，70∶30組和50∶50組肺泡隔厚度顯著高于30∶70組(P<0.05)。50∶50組單個(gè)肺泡面積顯著低于30∶70組(P<0.05)，但較70∶30組差異不顯著(P>0.05)。70∶30組和30∶70組單位面積肺泡數(shù)顯著低于50∶50組(P<0.05)。

表3 日糧精粗比對(duì)黑藏羊肺泡相關(guān)測(cè)量值的影響

由表4可見，70∶30組血管直徑顯著高于50∶50組和30∶70組(P<0.05)。50∶50組和30∶70組中膜厚度顯著低于70∶30組(P<0.05)。各組間中膜厚度/血管直徑和單位面積血管數(shù)差異不顯著(P>0.05)。

表4 日糧精粗比對(duì)黑藏羊血管相關(guān)測(cè)量值的影響

2.2 不同精粗比日糧對(duì)黑藏羊肺組織抗氧化酶活性的影響

黑藏羊肺組織抗氧化酶活性結(jié)果如表5所示，50∶50組超氧化物歧化酶活性顯著大于70∶30組(P<0.05)，較30∶70組差異不顯著(P>0.05)。70∶30組過氧化氫酶活性顯著小于其他2組(P<0.05)。30∶70組谷胱甘肽過氧化物酶活性顯著高于70∶30組(P<0.05)，較50∶50組差異不顯著(P>0.05)。

表5 日糧精粗比對(duì)黑藏羊肺組織抗氧化酶活性的影響

2.3 不同精粗比日糧對(duì)黑藏羊肺組織抗氧化酶mRNA表達(dá)的影響

由圖2可知，50∶50組SOD和CAT基因的mRNA表達(dá)量顯著高于70∶30組(P<0.05)，但與30∶70組差異不顯著(P>0.05)。30∶70組GSH-Px基因的mRNA表達(dá)量顯著高于70∶30組(P<0.05)，但與50∶50組差異不顯著(P>0.05)。

圖2 黑藏羊肺組織mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative mRNA expression in lung tissue of black Tibetan sheep

3 討 論

3.1 不同精粗比日糧飼糧對(duì)黑藏羊肺組織形態(tài)發(fā)育的影響

在長期的自然選擇與進(jìn)化過程中，生活在青藏高原及其附近地區(qū)的動(dòng)物，其肺部結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生了一系列變化來更好的適應(yīng)高原低氧環(huán)境，并且能夠增加氧氣的攝入、運(yùn)輸和擴(kuò)散能力[11]。因此，以“高原黑珍珠”之稱的黑藏羊?yàn)樵囼?yàn)對(duì)象探討青藏高原土著動(dòng)物的低氧適應(yīng)機(jī)制具有重要的意義。研究發(fā)現(xiàn)，相較于180日齡平原黃牛的肺泡組織結(jié)構(gòu)，180日齡高原牦牛肺泡隔厚度、單個(gè)肺泡面積和單位面積內(nèi)肺泡數(shù)之間差異均不明顯，但單位面積內(nèi)肺泡面積顯著增大，有利于高原牦牛在低氧環(huán)境下的氣體交換[12]。馮秋菊等[13]同樣指出，與平原同類動(dòng)物相比，高原土著動(dòng)物更有利于低氧環(huán)境下的氣體交換，其原因與體內(nèi)單位面積內(nèi)的肺泡數(shù)較多和肺泡隔較厚有關(guān)。此外，賈榮莉[14]試驗(yàn)也證實(shí)，藏羊肺組織中肺泡較小，單位面積肺泡數(shù)量多，單位面積血管數(shù)量較多，有助于藏羊增加肺部氧氣的攝入和轉(zhuǎn)運(yùn)。基于上述人員研究結(jié)果可以看出，反芻動(dòng)物肺臟發(fā)育狀況與其機(jī)體適應(yīng)高原低氧的環(huán)境具有緊密的聯(lián)系。在本試驗(yàn)中，相較于70∶30組與30∶70組，50∶50組黑藏羊肺組織發(fā)育較佳。其原因可能是日糧中的適宜精料水平能夠促進(jìn)瘤胃發(fā)酵。增加對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，但精料添加過高，也會(huì)使瘤胃產(chǎn)酸增加，繼而影響機(jī)體正常的生長發(fā)育。

3.2 不同精粗比日糧對(duì)黑藏羊肺組織抗氧化酶活性的影響

當(dāng)體內(nèi)抗氧化能力降低時(shí)，會(huì)造成活性氧自由基數(shù)量急劇上升，發(fā)生氧化還原反應(yīng)，引起氧化損傷與細(xì)胞功能失調(diào)，從而影響機(jī)體健康[15]。而SOD、CAT和GSH-Px等抗氧化酶能夠清除有害的氧自由基，以達(dá)到保護(hù)的目的[16]。其中，SOD作為生物體內(nèi)氧自由基的天然清除劑，其活性能夠反映機(jī)體清除氧自由基的能力[17]。CAT可以特異性清除體內(nèi)過多的過氧化氫，保護(hù)細(xì)胞免受過氧化損傷[18]。而GSH-Px是分解體內(nèi)過氧化物的重要分子，消除細(xì)胞內(nèi)的過氧化氫及脂質(zhì)自由基，有利于維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整[19]。以貴州黑山羊?yàn)檠芯繉?duì)象，發(fā)現(xiàn)日糧精料水平由22%提高至66%時(shí)，可以提高血漿中T-AOC、SOD、GSH-Px水平，并且能夠降低MDA含量，其抗氧化應(yīng)激能力持續(xù)增強(qiáng)[20]。Sgorlon等[21]指出，當(dāng)飼糧中精料水平由30%增長到55%時(shí)，母羊血液抗氧化應(yīng)激能力持續(xù)增加。侯志高等[22]在荷斯坦奶牛上也得到類似的結(jié)論。以上研究均證實(shí)營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏和不平衡均不能滿足反芻動(dòng)物營養(yǎng)需要，甚至導(dǎo)致體內(nèi)自由基數(shù)量不斷蓄積，從而擾亂氧化應(yīng)激的平衡狀態(tài)，發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。從本試驗(yàn)來看，當(dāng)日糧精粗比為50∶50時(shí)，能夠提高肺組織中SOD、CAT和GSH-Px活性?？赡苁怯捎谶m宜的營養(yǎng)水平日糧在一定程度上使體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和消除處于可調(diào)控范圍，平衡氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而提高黑藏羊抗氧化應(yīng)激的能力。此外，本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，日糧精粗比與黑藏羊肺組織的SOD、CAT和GSH-Px基因的mRNA表達(dá)量存在密切的聯(lián)系，其機(jī)理有待接下來深入的研究。

4 結(jié) 論

在本試驗(yàn)條件下，適宜的精粗比日糧有利于促進(jìn)黑藏羊肺組織形態(tài)發(fā)育，并增強(qiáng)其抗氧化能力，其中精粗比為50∶50的日糧飼喂效果較佳。