徐 榮，徐永艷，何麗蓮，楊清輝，張漢堯，李富生

(1.玉溪師范學(xué)院，云南 玉溪 653100；2.西南林業(yè)大學(xué)，昆明 650224；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，昆明 650201)

【研究意義】甘蔗(SaccharumofficenarumL.) 是多年生禾本科(Gramineae)高效C4植物，不僅是中國主要的糖料作物，還可用于飼料、造紙及生物質(zhì)燃料的生產(chǎn)等。目前，甘蔗品種優(yōu)良親本材料重復(fù)利用造成遺傳基礎(chǔ)狹窄，不可避免出現(xiàn)雜交近親化、網(wǎng)絡(luò)化，隨著距離野生種的代數(shù)越來越遠(yuǎn)，品種生活力、適應(yīng)性、抗逆性、宿根性隨著世代數(shù)增加逐漸退化[1]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】為了擴大甘蔗異質(zhì)性，斑茅、蔗茅、芒屬、高粱、玉米、竹屬等被各國甘蔗育種家應(yīng)用于甘蔗遠(yuǎn)緣屬間雜交。 甘蔗屬割手密具有適應(yīng)性強、宿根性好、抗逆性強的優(yōu)點，歷來為甘蔗遺傳改良的重要種質(zhì)資源[2-4]。斑茅具有粗生、宿根性好、抗旱、抗寒、抗病、抗蟲、染色體數(shù)較少、生物量大、纖維含量高等特點[5-6]，越來越受到國內(nèi)外甘蔗育種界的重視。蔗茅具有抗寒、抗旱、耐瘠、宿根性強、抗銹病等特性，且易開花、花粉量極多，也是甘蔗育種[7-8]珍貴的種質(zhì)資源。甘蔗屬與蔗茅屬、芒屬、硬穗茅屬、河八王屬組成“甘蔗屬復(fù)合體”?！颈狙芯壳腥朦c】甘蔗屬及其近緣屬種之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系并不完全明確。ISSR (Inter-simple sequence repeats)分子標(biāo)記具有操作簡便、穩(wěn)定性好的特點，已廣泛應(yīng)用于物種分類、品種鑒定及遺傳多樣性等方面[9]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對44份甘蔗野生近緣種無性系材料進(jìn)行ISSR遺傳多樣性分析，以期搞清甘蔗野生近緣種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，為下一步種質(zhì)資源創(chuàng)新、培育甘蔗新品種等提供種質(zhì)材料和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試材料種植于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)甘蔗所野生種質(zhì)資源圃，包括甘蔗近緣植物5個屬8個種共計44份無性系材料(表1)[10]。

表1 44份供試材料及來源

續(xù)表1 Continued table 1

1.2 ISSR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化及引物的篩選

試驗根據(jù)禾本科植物的特性，將篩選引物分別利用不同甘蔗野生種進(jìn)行擴增，通過預(yù)試驗，建立一套甘蔗野生種的ISSR的優(yōu)化反應(yīng)體系及反應(yīng)程序。PCR 反應(yīng)體系：模板 DNA 1 μL、dNTP (10 mmol/L) 0.6 μL、引物(10 μmol/L) 2.0 μL、Mg2+1.6 μL、Taq酶(2.5 μL) 0.4 μL、加ddH2O 補齊20 μL。優(yōu)化后的PCR擴增程序：預(yù)變性94 ℃ 8 min;變性 94 ℃ 60 s，退火56 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 60 s，循環(huán)40個；延伸72 ℃ 6 min，保溫16 ℃，4 ℃保存。

參考錢韋等[11]使用的26條ISSR引物序列加以改動，交由上海生工合成，在優(yōu)化的反應(yīng)體系條件下，最終篩選出13條(表2)擴增特異性高、條帶清晰、反應(yīng)穩(wěn)定的引物用于下一步分析。

表2 13對ISSR引物堿基序列

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用VILBER LOURMAT凝膠成像系統(tǒng)自動掃描圖像條帶，以有(計為1)或無(計為0)記錄相對遷移位置的等位基因。運用NTSYS分析Dice (Nei and Li)系數(shù)相似性，利用UPGMA 構(gòu)建聚類樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗近緣植物5屬8種44份材料的多態(tài)位點比率與分析

對44份甘蔗野生近緣種無性系供試材料進(jìn)行了ISSR分析，13條引物擴增得到位點數(shù)為261個，其中有259個多態(tài)性位點，在屬的水平上99%為多態(tài)性位點，條帶長度在100～2500 bp(表3)，表明野生甘蔗近緣種屬具有較高的遺傳多樣性，對環(huán)境變化有較強的適應(yīng)能力。其中,引物UBC808、UBC809擴增電泳結(jié)果見圖1～4。

表3 13對ISSR引物對44份樣品材料的擴增位點統(tǒng)計

圖1 引物UBC808的ISSR擴增結(jié)果(材料A1～A24)Fig.1 Results of ISSR amplification by primer UBC808(Samples：A1-A24)

圖2 引物UBC808的ISSR擴增結(jié)果(材料A25～A44)Fig.2 Results of ISSR amplification by primer UBC808(Samples：A25-A44)

圖3 引物UBC809的ISSR擴增結(jié)果(材料A1～A24)Fig.3 Results of ISSR amplification by primer UBC809(Samples：A1-A24)

圖4 引物UBC809的ISSR擴增結(jié)果(材料A25～A44)Fig.4 Results of ISSR amplification by primer UBC809(Samples A25-A44)

對44份材料按種屬統(tǒng)計各自的擴增條帶、多態(tài)性條帶及其多態(tài)位點比率(表4)，對比分析發(fā)現(xiàn)不同屬之間的多態(tài)位點比率在55.56%～98.98%，屬間多態(tài)位點比率大小順序排列為：甘蔗屬>蔗茅屬>芒屬>金茅屬>河八王屬；與總的多態(tài)位點比率相比，種屬間的多態(tài)位點比率相對小了許多，屬間差異明顯大于種間差異。不同種之間的多態(tài)位點比率在55.56%～96.91%，其中河八王屬河八王種的多態(tài)位點最低為55.56%，蔗茅屬蔗茅種的多態(tài)位點最高為96.91%，說明蔗茅屬蔗茅種具有很高的遺傳多樣性，適應(yīng)環(huán)境的能力最強。以上各近緣種多態(tài)位點比率變異系數(shù)變幅較大的為甘蔗屬的割手密種，斑茅種次之，種的水平多態(tài)位點比率大小排列順序為：甘蔗屬割手密種>甘蔗屬斑茅種>蔗茅屬蔗茅種>芒屬五節(jié)茅種>金茅屬金茅種>河八王屬河八王種，其中蔗茅屬的滇蔗茅種、芒屬的金茅種樣品數(shù)量太少，不具有說服力。

表4 44份樣品材料的多態(tài)位點統(tǒng)計

2.2 甘蔗近緣植物5屬8種44份材料的Nei指數(shù)(h)分析

對44份供試材料用Nei & Li方法兩兩比對獲得遺傳相似系數(shù)，相似系數(shù)越大說明親緣關(guān)系越近；反之，親緣關(guān)系越遠(yuǎn)。44份材料遺傳相似系數(shù)為0.1250 000～0.7096 774，平均為0.3818。采自西藏察隅的蔗茅材料90-31和材料90-29之間相似系數(shù)最大為0.7097，采自四川攀枝花的割手密材料91-2與井研的河八王材料83-199之間相似系數(shù)最小為0.1250，說明該兩個材料之間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(圖5)。

圖5 44份材料遺傳相似系數(shù)百分比Fig.5 The genetic similarity coefficient percentage of 44 samples

甘蔗野生近緣種屬之間的相似系數(shù)集中在0.2～0.4，占比高達(dá)70%，遺傳相似系數(shù)在0.7以上的僅占0.2%，表明各種間材料遺傳分化較大，遺傳多樣性豐富，親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。

2.3 甘蔗近緣植物5屬8種44份材料的UPGMA聚類分析

根據(jù)Nei’s遺傳距離利用UPGMA構(gòu)建出甘蔗野生近緣5屬8種44個材料的UPGMA居群遺傳關(guān)系聚類圖(圖6)，12個斑茅種材料在接合線0.805處聚合，金茅的2個材料與斑茅的親緣關(guān)系更近，在接合線0.775處10個割手密材料聚合，斑茅、割手密、金茅在接合線0.74處聚合，5個五節(jié)茅材料在接合線0.755處聚后同川茅90-27在0.745處聚在一起，完全符合芒屬的傳統(tǒng)分類，11個蔗茅材料在接合線0.761處聚合后同2個河八王材料于接合線0.734處聚合在一起，芒屬、蔗茅屬、河八王屬在0.723處聚在一起，說明蔗茅屬、芒屬、河八王屬之間的關(guān)系更親近，而割手密、斑茅、金茅之間的關(guān)系更近，如果斑茅劃歸甘蔗屬，那么金茅也要劃歸甘蔗屬，該試驗的聚類結(jié)果同傳統(tǒng)分類基本吻合。采自同一地理區(qū)域(西藏察隅)編號30、32的2個蔗茅材料緊密聚合在一起，說明遺傳距離跟地理距離密切相關(guān)。

圖6 44份材料的UPGMA聚類結(jié)果Fig.6 UPGMA clustering results of 44 samples

44份材料中的17份材料共擴增得到21條特異帶，除個別有2條特異帶外，基本每個材料只擴增到1條特異帶，如采自云南潞西的斑茅材料89-8有2條特異帶，UBC808的200 bp處和UBC855的990 bp各有1條，通過特異條帶，有助于跟蹤識別雜交后代中究竟有哪個種的血緣。

3 討 論

基于ISSR分子標(biāo)記對44份甘蔗野生近緣種材料按種間、割手密、斑茅3個層次進(jìn)行遺傳多樣性分析，多態(tài)性位點百分率在屬的水平上高達(dá)99%，表明野生甘蔗近緣種屬具有較高的遺傳多樣性，對環(huán)境變化有較強的適應(yīng)能力，為甘蔗的遺傳育種改良提供了理論依據(jù)。種間水平以蔗茅屬蔗茅種的多態(tài)位點最高，為96.91%，說明其具有很高的遺傳多樣性，適應(yīng)環(huán)境的能力最強。研究結(jié)果表明屬間的多態(tài)性明顯高于種間的多態(tài)性，這與樣本數(shù)量有很大關(guān)系，一般來講樣本數(shù)量越多，則多態(tài)位點的比率越高，樣本數(shù)量少，則多態(tài)位點的比率越低。同時，研究發(fā)現(xiàn)含(AC)n、(CT)n、(CA)n、(GA)n序列的ISSR引物擴增多態(tài)性較高，暗示著甘蔗野生近緣種基因組中(AC)n、(CT)n、(CA)n、(GA)n含量豐富。甘蔗野生近緣5屬8種44個材料聚類結(jié)果顯示，不同實驗材料首先按照種聚合在一起，隨后按屬接合在一處，割手密、斑茅、金茅之間的關(guān)系更近，而蔗茅屬、芒屬、河八王屬之間的關(guān)系更為親近，該聚類結(jié)果與傳統(tǒng)分類基本吻合，說明ISSR分子標(biāo)記可以用于種間遺傳多樣性分析。種內(nèi)水平的聚類分析表明地理距離近的材料其遺傳距離也近，而與生境、海拔等因素則未表現(xiàn)出密切的相關(guān)性。值得注意的是編號29采自美國的IND81-46蔗茅單獨成一類。

斑茅的分類地位在國內(nèi)甘蔗界和植物學(xué)界并沒有統(tǒng)一，有的將其歸入甘蔗屬，有的則將其歸入蔗茅屬，甚至建議立為單種屬[12]。 在國外，早期斑茅歸類于甘蔗屬，學(xué)名為SaccharumarundinaceumRetz。直到1925年Jeswiet提出將斑茅歸類為蔗茅屬，學(xué)名為Erianthusarundinaceum(Retz) Jeswiet[13]， Dtn-R 和 Rao[14]研究進(jìn)一步驗證了Jeswiet的觀點。1972年Grassl建議把斑茅和蔗茅屬內(nèi)的13個種劃分出來成立新的Ripidium屬。Daniels和Roach于1987年將Ripidium屬重新劃歸蔗茅屬，歸類為蔗茅屬的一個組(Erianthussect.Ripidium)，現(xiàn)在國際上己基本得到承認(rèn)[15]。周耀輝認(rèn)為國外甘蔗界將斑茅歸入蔗茅屬(Erianthus) 已沒有什么爭議[16]。但查閱相關(guān)文獻(xiàn)及權(quán)威網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)，包括NCBI都將斑茅統(tǒng)一歸類在甘蔗屬內(nèi)，學(xué)名通用為SaccharumarundinaceumRetz。在國內(nèi)，斑茅的分類的確不統(tǒng)一，首先是國內(nèi)沒有Ripidium組的6個種，國內(nèi)分布的4個蔗茅屬原種中滇蔗茅、蔗茅與斑茅差異較大，無法據(jù)此確定斑茅的分類地位。周耀輝[16]將甘蔗屬、蔗茅屬某些種分別與斑茅進(jìn)行形態(tài)學(xué)比較，建議斑茅歸類在蔗茅屬更加客觀合理，而不應(yīng)該歸類于甘蔗屬。廖兆周等利用過氧化物酶同工酶的方法對甘蔗屬5個種216個材料進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)斑茅的同工酶帶數(shù)、遷移率及其分布規(guī)律均異于甘蔗屬其他4個種，認(rèn)為斑茅劃歸甘蔗屬不合理[17]。余愛麗等[18]利用ISSR標(biāo)記分析了甘蔗屬、斑茅、蔗茅和五節(jié)芒的親緣關(guān)系，表明斑茅與蔗茅的親緣關(guān)系比甘蔗屬更近一些。通過研究表明，芒屬、蔗茅屬、河八王屬之間的關(guān)系更近，而割手密、斑茅、金茅之間的關(guān)系更近。根據(jù)研究結(jié)果將斑茅歸入甘蔗屬較為合理。

4 結(jié) 論

利用ISSR分子標(biāo)記按照割手密種內(nèi)、斑茅種內(nèi)及種間3個層次對44份甘蔗野生近緣種材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，從26條ISSR引物中篩選出13條特異引物，44個種間材料的多態(tài)性百分率為99%，擴增出的261條條帶中259條為多態(tài)性條帶；種間多態(tài)性為甘蔗屬割手密種>甘蔗屬斑茅種>蔗茅屬蔗茅種>芒屬五節(jié)茅種>金茅屬金茅種>河八王屬河八王種；44個種間材料UPGMA聚類結(jié)果基本符合形態(tài)學(xué)分類，12份斑茅材料在0.805處聚合，斑茅和割手密材料在0.775處聚合，采自西藏察隅編號A30、A32的蔗茅緊密聚合，蔗茅屬、芒屬、河八王屬之間關(guān)系更近，與甘蔗屬在0.73處聚合在一起，種間遺傳相似系數(shù)在0.125～0.710。研究結(jié)果可為甘蔗遺傳育種、引種等提供理論上的指導(dǎo)。