曲高陽 陳雨 劉姿 張國冰 郝小惠 沈福海 李金龍

華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院(河北省器官纖維化重點實驗室) 河北唐山 063210

游離二氧化硅(silicon dioxide，SiO2)粉塵俗稱矽塵，是我國采礦、隧道、建筑、噴砂、陶瓷等行業(yè)中存在的主要職業(yè)性有害因素。據(jù)國家衛(wèi)生健康委員會公布的2020年我國衛(wèi)生健康事業(yè)發(fā)展統(tǒng)計公報顯示，2020年全國共報告各類職業(yè)病新病例17064例，其中職業(yè)性塵肺病及其他呼吸系統(tǒng)疾病14408例，而職業(yè)性塵肺病14367例，占各類新發(fā)職業(yè)病的84.19%(14367/17064)，可見防治塵肺病是職業(yè)病防治工作的重中之重。矽肺是一種由于生產(chǎn)過程中長期吸入游離SiO2粉塵而引起的以肺部彌漫性纖維化為主的全身性疾病，其進展快、死亡率高且影響范圍廣。近年來，國內(nèi)外學(xué)者圍繞矽肺發(fā)生的免疫學(xué)機制進行了相關(guān)研究后發(fā)現(xiàn)，矽肺的發(fā)生早期始于巨噬細胞識別和吞噬SiO2粉塵后激活的固有免疫反應(yīng)，然后凋亡和崩解的巨噬細胞釋放大量促炎活性因子，引起適應(yīng)性免疫應(yīng)答失衡并擴大炎癥反應(yīng)，繼而影響肺組織損傷修復(fù)過程，最終導(dǎo)致不可逆的肺部間質(zhì)纖維化[1-3]。目前關(guān)于游離SiO2粉塵效應(yīng)靶細胞的研究大多集中于巨噬細胞、中性粒細胞和T淋巴細胞等免疫細胞，然而對于能夠初始和調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)，且專職抗原提呈功能最為強大的樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)的研究較為少見。因此，本研究以DCs為研究對象，初步探討游離SiO2粉塵對小鼠骨髓源樹突狀細胞(bone marrow-derived dendritic cells，BMDCs)細胞因子表達的影響，試圖從適應(yīng)性免疫應(yīng)答初始環(huán)節(jié)為探討游離SiO2粉塵致肺部炎癥和矽肺的發(fā)生提供理論線索。

1 材料與方法

1.1主要儀器與試劑 BioTek Epoch全波長酶標儀(美國BioTek公司)、QuantStudioTM 6實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)、NanoDrop2000核酸濃度測定儀(美國Thermo公司)HF90 CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)、SW-CJ-1CU超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)。

SiO2(美國SIGMA公司)，RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，青鏈霉素混合液、谷氨酰胺(以色列BI公司)，HEPES緩沖液(以色列BI公司)，胎牛血清(以色列BI公司)，細胞增殖檢測試劑盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8,上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-12、IL-10、IL-23、TGF-β Mouse Uncoated ELISA Kit(美國Invitrogen公司)，TMB顯色終止液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，M5 Super plus qPCR RT kit(北京聚合美生物科技有限公司)，2×M5 HiPer Realtime PCR Super mix(北京聚合美生物科技有限公司)。

1.2BMDCs細胞培養(yǎng)及分組 健康SPF級C57BL/6小鼠(6～8周，雌性)，體質(zhì)量18～22 g。小鼠及飼料均購自北京華阜康生物科技股份有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)-2019-0008。于華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心屏障實驗室飼養(yǎng)，動物室溫度控制在(20 ± 2)℃，照明時間為(12 ± 2)h/d，相對濕度為50%～60 %。頸椎脫位法處死，分離后肢股骨。5mL注射器針頭貫通股骨后，用1mL注射器吸取無菌PBS反復(fù)沖洗3～5遍，收集細胞后300 g離心力離心棄上清液。經(jīng)紅細胞裂解操作后PBS沖洗2～3遍，加入含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液、1%谷氨酰胺、1%HEPES、GM-CSF (20 ng/mL)和IL-4(10 ng/mL)的RPMI1640培養(yǎng)液，經(jīng)70 μm濾網(wǎng)過濾后將細胞接種于10cm2細胞培養(yǎng)皿中。當天記為第一天，將細胞培養(yǎng)板放入37 ℃，含5% CO2的飽和濕度孵箱中培養(yǎng)過夜，于第二天更換新鮮培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)，隔天半量換液，于第八天用吸管輕輕吹打培養(yǎng)皿后收集懸浮細胞，CD11c+-FITC抗體流式細胞術(shù)鑒定BMDCs純度>80%[4]，可滿足后續(xù)實驗需要。

游離SiO2粉塵(粒徑0.5～10 μm，1μm<80%粒徑<5 μm，純度>99%)經(jīng)瑪瑙研缽充分研磨2 h后進行高壓滅菌處理，使用前用無菌PBS溶解 并經(jīng)超聲處理后進行染毒實驗。將獲得的BMDCs分為對照組、LPS陽性活化組、SiO2(10 μg/cm2)+ LPS處理組、SiO2(25 μg/cm2)+ LPS處理組、SiO2(50 μg/cm2)+ LPS處理組、SiO2(75 μg/cm2)+ LPS處理組、SiO2(150 μg/cm2)+ LPS處理組。具體處理方案：BMDCs經(jīng)不同濃度SiO2預(yù)處理2 h后，加入25 ng/mL LPS繼續(xù)孵育6 h或24 h，收集懸浮細胞或細胞上清液后進行相關(guān)指標的測定。

1.3BMDCs細胞活力測定 將收集的BMDCs按照1×105/mL細胞密度接種到96孔板中，每組設(shè)置4個平行樣，并保證每孔RPMI1640培養(yǎng)液體積為100 μL。BMDCs經(jīng)不同濃度SiO2預(yù)處理2 h后，加入25 ng/mL LPS繼續(xù)孵育24 h，24 h后每孔加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃， 5% CO2的環(huán)境下孵育3 h。于全波長酶標儀490 nm下讀取吸光度值。

1.4BMDCs上清液中細胞因子含量檢測 將收集的BMDCs按照5×105個/mL細胞密度接種到24孔板中，每組設(shè)置4個平行樣。BMDCs經(jīng)不同濃度SiO2預(yù)處理2 h后，加入25 ng/mL LPS繼續(xù)孵育24 h，24 h后收集細胞上清液，300 g/min，離心5min后收集細胞上清液，置于-80 ℃冰箱保存待用。采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)測定BMDCs上清液中細胞因子含量。按照ELISA試劑盒使用說明依次進行包被抗原、阻斷、樣品加樣、加酶標抗體和底物顯色等操作，每孔加入TMB顯色終止液50 μL，450 nm波長讀數(shù)，制作標準曲線后分析數(shù)據(jù)。

1.5BMDCs目的基因轉(zhuǎn)錄水平測定 采用實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR，Real-time qPCR)法測定BMDCs目的基因轉(zhuǎn)錄水平。將收集的BMDCs按照5×106/mL細胞密度接種到6孔板中，每組設(shè)置4個平行樣。BMDCs經(jīng)不同濃度SiO2預(yù)處理2 h后，加入25 ng/mL LPS繼續(xù)孵育，6 h后輕輕吹打收集BMDCs，300 g離心力離心5 min后加入Trizol試劑，混勻靜置5 min后-80 ℃凍存待用。取出經(jīng)Trizol裂解的BMDCs室溫解凍，12000 g/min離心10min(2～8 ℃)，取上清液于1.5 mL離心管中，冰上孵育5 min，室溫孵育5 min。每1 mLTrizol加氯仿0.2 mL。密閉后渦旋儀劇烈振搖15 s后常溫孵育2～3 min，12000 g/min離心10min后液體分為三層。吸取上層無色水相，加入0.5 mL異丙醇使RNA沉淀，顛倒混勻，常溫下(15～30 ℃)孵育10 min后12000 g/min離心10min。棄上清液，于定性濾紙上輕輕叩敲，吸干管內(nèi)剩余的液體，1 mL 75 %乙醇洗RNA，7500 g/min，離心5 min，洗兩遍。干燥后將RNA溶于DEPC水，測其濃度和純度。

依次混合500 ng RNA模板、1 μL 10×gDNA plus remover mix，用DEPC水補足至10 μL后將反應(yīng)液混勻，短暫離心后42℃溫育2 min，然后置于冰上冷卻。繼續(xù)加入4mL 5×M5 RT Super plus Mix和DEPC水6mL，輕輕混勻，短暫離心后37℃孵育15 min，85℃加熱 5 s使酶失活，置于冰上進行后續(xù)實驗或-80 ℃保存。按照10 ng cDNA、10 mL 2 × M5 HiPer Realtime PCR Super mix、上下游引物(10 μm)各0.5 μL，引物序列見表1。無菌雙蒸水補足致20 μL配置PCR擴增體系。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性60 s，95℃變性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸60 s，變性至延伸步驟循環(huán)40次，循環(huán)數(shù)(Ct值)≤35為有效擴增，記錄熒光信號到達所設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的Ct值。以Gapdh為內(nèi)參，按照△Ct值=目的基因△Ct值-內(nèi)參基因Ct值，△△Ct值=(實驗組目的基因Ct值-實驗組組內(nèi)參基因Ct值)-(對照組目的基因Ct值-對照組內(nèi)參基因Ct值)方法依次計算出2-△△Ct值，即為目的基因的相對表達量。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1小鼠BMDCs細胞活力測定結(jié)果 與對照組相比， LPS陽性活化組BMDCs的細胞活力增強，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與LPS陽性活化組相比，75、150 μg/cm2SiO2抑制LPS活化的BMDCs細胞活力，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其余各濃度SiO2組未對BMDCs細胞活力產(chǎn)生明顯影響。見圖1。因此本研究選擇10、25和50 μg/cm2三個濃度梯度進行后續(xù)實驗。

圖1 各組BMDCs細胞活力比較

2.2游離SiO2粉塵對小鼠BMDCs分泌炎癥因子的影響 與對照組相比，LPS陽性活化組TNF-α、IL-6和IL-1β水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與LPS陽性活化組相比，SiO2(10、25、50 μg/cm2)+ LPS處理組TNF-α水平升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)； SiO2(25、50 μg/cm2)+ LPS處理組IL-6水平升高而SiO2(10 μg/cm2)+ LPS處理組降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；SiO2(10、25、50 μg/cm2)+ LPS處理組 IL-1β水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 游離SiO2粉塵對小鼠BMDCs分泌炎癥因子的影響

2.3游離SiO2粉塵對小鼠BMDCs中炎癥因子基因表達的影響 與對照組相比，LPS陽性活化組BMDCs中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β的基因表達顯著上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與LPS陽性活化組相比，SiO2(10、25、50 μg/cm2)+ LPS處理組BMDCs中炎癥因子IL-6的基因表達均上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)； 而TNF-α和Il-1β的基因表達未發(fā)生顯著差異。見表3。

表3 游離SiO2粉塵對小鼠BMDCs中炎癥因子基因表達的影響

2.4游離SiO2粉塵對小鼠BMDCs分泌T淋巴細胞誘導(dǎo)型細胞因子的影響 與對照組相比， LPS陽性活化組IL-12、IL-10、IL-23水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而TGF-β水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與LPS陽性活化組相比，SiO2(10、50 μg/cm2) + LPS組IL-12水平降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；SiO2(10 μg/cm2)+ LPS處理組IL-10水平降低，而SiO2(25 μg/cm2)+ LPS組IL-10水平升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；SiO2(10、25 μg/cm2)+ LPS組IL-23水平升高，且差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；SiO2(25 μg/cm2)+ LPS組TGF-β水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 游離SiO2粉塵對小鼠BMDCs分泌T淋巴細胞誘導(dǎo)型細胞因子的影響

2.5游離SiO2粉塵對小鼠BMDCs中T淋巴細胞誘導(dǎo)型細胞因子基因表達的影響 與對照組相比，LPS陽性活化組IL-12b、IL-10和IL-23α的基因表達上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與LPS陽性活化組相比，SiO2(10、25 μg/cm2)+ LPS處理組IL-12b和IL-23α的基因表達下調(diào)，SiO2(25、50 μg/cm2)+ LPS處理組IL-10的基因表達下調(diào)，且差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表5 游離SiO2粉塵對小鼠BMDCs中T淋巴細胞誘導(dǎo)型細胞因子基因表達的影響

3 討論

矽肺是一種長期吸入游離SiO2粉塵所致的職業(yè)性疾病，可引起肺部慢性炎癥、進行性肺纖維化以及全身性免疫功能失常[5]。國內(nèi)外學(xué)者近些年從機械刺激學(xué)說、氧化應(yīng)激學(xué)說以及免疫學(xué)說等多角度闡述了游離SiO2粉塵致肺部炎癥和矽肺的發(fā)病機制。從免疫學(xué)角度出發(fā)，游離SiO2粉塵作為職業(yè)性有害因素經(jīng)呼吸道吸入肺部之后，患者迅速進入急性炎癥反應(yīng)階段，主要表現(xiàn)為大量炎性細胞浸潤和肺泡屏障的破壞，同時伴有趨化因子和細胞因子的大量釋放。在此炎癥反應(yīng)階段，DCs是連接固有免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的橋梁，在初始和調(diào)節(jié)幼稚T淋巴細胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。隨著游離SiO2粉塵的反復(fù)暴露，肺部早期的炎癥反應(yīng)進入纖維修復(fù)期，肺部的成纖維細胞增殖活化并釋放膠原蛋白，逐漸出現(xiàn)彌漫性間質(zhì)纖維化，并最終形成矽結(jié)節(jié)。基于以上矽肺演進的病理過程，本研究以小鼠BMDCs為研究對象，建立游離SiO2粉塵暴露的DCs體外模型，從適應(yīng)性免疫應(yīng)答初始環(huán)節(jié)為探討游離SiO2粉塵致肺部炎癥和矽肺的發(fā)生提供理論線索。

與經(jīng)典的炎性刺激物L(fēng)PS相比，已有研究報道SiO2不能有效地誘導(dǎo)巨噬細胞和DCs表達炎癥因子TNF-α和IL-1β[6-7]。因此，本研究為了較為敏感的觀察SiO2對BMDCs細胞因子表達的影響，我們首先給予BMDCs不同濃度SiO2預(yù)處理2 h后，加入25 ng/mL LPS繼續(xù)孵育6 h或者24 h，收集懸浮細胞或細胞上清液后進行相關(guān)指標的測定。本研究結(jié)果顯示25和50 μg/cm2SiO2明顯促進LPS活化的BMDCs分泌炎癥因子TNF-α和IL-6，而對IL-1β的表達無明顯影響。與此研究結(jié)果相類似，Beamer 等[8]發(fā)現(xiàn)，100 μg/mL SiO2可以顯著誘導(dǎo)經(jīng)1 μg/mL LPS刺激的BMDCs分泌炎癥因子TNF-α。Zhao和Chan等[9-10]的研究結(jié)果也分別證實，游離SiO2粉塵暴露的C57BL/6小鼠早期肺泡灌洗液中IL-6含量明顯升高，且SiO2能夠明顯誘導(dǎo)巨噬細胞分泌炎癥因子TNF-α和IL-6。He等[11]研究證實，與巨噬細胞相比，DCs細胞似乎具有更強大的IL-1β分泌能力，而關(guān)于SiO2誘導(dǎo)還是抑制巨噬細胞和DCs等免疫細胞表達IL-1β的研究結(jié)論目前尚不完全一致[12-14]，猜測可能是與實驗中所采用的SiO2粒徑、濃度以及不同的細胞模型有關(guān)。

矽肺的發(fā)生是多種細胞與分子共同參與的免疫學(xué)過程，涉及固有免疫、適應(yīng)性免疫以及非特異性免疫功能的異常變化。近年來研究發(fā)現(xiàn)，T淋巴細胞在矽肺發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[15]。T淋巴細胞主要分為CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、細胞毒性T 細胞(cytotoxic T cell，CTL)等亞型。其中，CD4+T淋巴細胞又可進一步分為 Th1、Th2、Th17和Treg型細胞，此四類細胞的增殖分化除與DCs細胞表面主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)II和協(xié)同刺激分子CD86/CD80的表達密切相關(guān)外，還接受免疫微環(huán)境中復(fù)雜的細胞因子調(diào)控。DCs細胞分泌的Th1誘導(dǎo)型細胞因子IL-12能夠誘導(dǎo)幼稚T淋巴細胞分化為Th1細胞，進而在炎癥早期發(fā)揮作用；DCs細胞分泌的Th2誘導(dǎo)型細胞因子IL-4和IL-10能夠誘導(dǎo)幼稚T淋巴細胞分化為Th2細胞，同時輔助B淋巴細胞活化，發(fā)揮體液免疫的作用；DCs細胞分泌的Th17誘導(dǎo)型細胞因子IL-6和IL-23則能夠誘導(dǎo)幼稚T淋巴細胞向Th17細胞分化，在自身免疫性疾病和機體防御反應(yīng)中具有重要意義；DCs細胞分泌的Treg誘導(dǎo)型細胞因子TGF-β能夠誘導(dǎo)幼稚T淋巴細胞向Treg細胞分化，參與成纖維細胞的活化，在肺損傷的纖維修復(fù)期發(fā)揮作用。

本研究結(jié)果顯示，與LPS陽性活化組相比，經(jīng)10 μg/cm2SiO2染毒的BMDCs中IL-12和IL-10的蛋白和基因表達水平均降低，而25 μg/cm2SiO2染毒的BMDCs細胞上清液中IL-23和TGF-β的含量明顯升高。Beamer 等[8]的研究結(jié)果也證實，與LPS陽性活化組相比，經(jīng) SiO2染毒的BMDCs細胞上清液中IL-10的含量明顯降低。Bao等[16]在建立的小鼠矽肺模型早期炎癥反應(yīng)中也發(fā)現(xiàn)，小鼠肺組織中Th1誘導(dǎo)型細胞因子Il-12基因表達下降。本實驗中發(fā)現(xiàn)SiO2誘導(dǎo)TNF-α分泌；而有研究發(fā)現(xiàn)TNF-α可以調(diào)節(jié)Th17細胞分泌[17]，推測經(jīng)SiO2染毒的BMDCs通過上調(diào)TNF-α、IL-6和IL-23表達，很可能為Th17細胞的增殖和分化提供合適的免疫微環(huán)境，此推測也簡介佐證了Song和Re SL等的研究結(jié)論[15, 18]。除此之外，本研究觀察到SiO2能夠誘導(dǎo)小鼠BMDCs分泌少量TGF-β，此結(jié)果與關(guān)于矽肺成因的主流觀點不謀而合。近年來，部分學(xué)者認為CD4+ T淋巴細胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)在矽肺演進中的作用多體現(xiàn)在矽肺早期的炎癥反應(yīng)階段，然中性粒細胞、巨噬細胞和成纖維細胞交織的固有免疫反應(yīng)在矽肺晚期間質(zhì)纖維化和矽結(jié)節(jié)形成中的作用更為重要，此觀點目前尚不統(tǒng)一[15, 19]。

綜上所述，游離SiO2粉塵可促進小鼠BMDCs分泌炎癥因子TNF-α，以及Th17誘導(dǎo)型細胞因子IL-23和Treg誘導(dǎo)型細胞因子TGF-β，同時抑制BMDCs分泌Th1誘導(dǎo)型細胞因子IL-12。