張發(fā)勇,宋 富,齊 磊,吳飛陶,劉 鑫,于月欣,李 華,馮 毅,邵文亮,張瑋倩,徐蘭舉

(1.河北省藥品醫(yī)療器械檢驗研究院,河北 石家莊 050000;2.河北納科生物科技有限公司,河北 石家莊 050000;3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院,河北 保定 071001)

膠原被定義為含有三螺旋分子結(jié)構(gòu)的細胞外基質(zhì)分子[1],其是人體內(nèi)含量最豐富的蛋白質(zhì),是一種被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)和生物工程的天然材料。膠原的3條多肽聚集在一起形成一個左旋卷曲的、繩索狀的三重螺旋結(jié)構(gòu)[2],膠原蛋白的氨基酸序列是以大量甘氨酸(約占組合物的1/3)和脯氨酸(約占組合物的1/5)為特征。甘氨酸殘基是必需的,每3個氨基酸殘基中,甘氨酸殘基就出現(xiàn)1次,因為甘氨酸是唯一的1種小到可以容納在三重螺旋中心的氨基酸[3]。這導(dǎo)致在所有三螺旋結(jié)構(gòu)域的序列中觀察到一個特征性的重復(fù)氨基酸序列(Gly-Xaa-Yaa)n[4]。對于哺乳動物來說膠原蛋白是十分重要的,因其具有多種生理調(diào)節(jié)功能,主要包括:保健作用、美容作用、免疫作用、助吸收、緩解關(guān)節(jié)疼痛、預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥等[5]。對膠原結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能的研究大多是利用提取的動物膠原。比如從牛、豬和其他動物的組織中獲得高純度的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型膠原[6],但是動物提取的膠原蛋白在實際應(yīng)用中存在不易溯源、產(chǎn)量有限和加工處理復(fù)雜等諸多限制因素。為了解決這些問題,目前雖然已有較為成熟的化工合成技術(shù),但是其技術(shù)復(fù)雜、產(chǎn)量少和代價昂貴,并且難以標準化。因此,大量學(xué)者在多種不同表達系統(tǒng)中探索,包括:微生物(大腸桿菌、酵母菌等)[7-9]、細胞培養(yǎng)系統(tǒng)(CHO細胞、COS細胞、黑腹果蠅)[10-11]、轉(zhuǎn)基因動物(老鼠、蠶等)[12-13]、轉(zhuǎn)基因植物(煙葉、玉米種子和水稻種子等)等[14-16]。國內(nèi)外對膠原蛋白的需求量正穩(wěn)步增長,重組膠原蛋白的表達量提升有利于進一步滿足市場的需求。

筆者先將Ⅲ型膠原蛋白α1鏈的624個氨基酸序列的編碼基因進行密碼子優(yōu)化;然后化學(xué)合成,用KpnⅠ和NdeⅠ酶切位點連接到質(zhì)粒pET-30a上,轉(zhuǎn)入到EscherichiacoliBL21(DE3)中獲取發(fā)酵菌株,經(jīng)驗證確認轉(zhuǎn)化成功;最后通過正交實驗優(yōu)化發(fā)酵用的培養(yǎng)基,并確定優(yōu)化后培養(yǎng)基的表達情況,進而對得到的蛋白進行純化和表征。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

菌種為EscherichiacoliBL21(DE3);重組Ⅲ型人源化膠原蛋白基因及表達質(zhì)粒pET-30a由筆者實驗室保藏[17]。

1.1.2 培 養(yǎng) 基

種子培養(yǎng)基(質(zhì)量濃度):蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,氯化鈉10 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基(質(zhì)量濃度):酵母粉7.5 g/L,蛋白胨15.0 g/L,甘油12.0 g/L,磷酸氫二鈉17.9 g/L,磷酸二氫鉀6.8 g/L,硫酸銨4.0 g/L,硫酸鎂1.0 g/L,微量元素1 mL/L,氫氧化鈉溶液10%調(diào)至pH 7。

補料培養(yǎng)基(質(zhì)量濃度):酵母粉90 g/L,蛋白胨120 g/L,甘油200 g/L,硫酸鎂5 g/L,維生素B1 0.5 g/L,微量元素5 mL/L。

1.2 方 法

1.2.1 搖瓶培養(yǎng)

將-80 ℃保藏的含重組Ⅲ型人源化膠原蛋白基因的大腸桿菌接種于含30 mL液體LB培養(yǎng)基中,180 r/min、37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。以10%接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中,180 r/min、37 ℃培養(yǎng)2 h,加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG進行誘導(dǎo),25 ℃培養(yǎng)12 h。

1.2.2 5 L發(fā)酵罐發(fā)酵

將-80 ℃保藏的實驗菌株接種于含100 mL的LB液體培養(yǎng)基中,180 r/min、37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜;以10%的種子液接入300 mL LB液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至OD600約為1,以10%接種量接入5 L發(fā)酵罐中,控制溶氧和pH值,37 ℃培養(yǎng)8～10 h后加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG,25 ℃培養(yǎng)14 h[18]。

1.2.3 正交實驗設(shè)計

通過調(diào)整蛋白胨、酵母粉和甘油的質(zhì)量濃度調(diào)整碳氮比例,根據(jù)蛋白胨和酵母粉的氨基氮質(zhì)量濃度設(shè)計3因素4水平正交實驗,根據(jù)膠原蛋白表達量情況確定最優(yōu)的氮源和碳源添加濃度。

1.2.4 膠原蛋白表達量檢測

在優(yōu)化的最適培養(yǎng)條件下發(fā)酵生產(chǎn)膠原蛋白,每組實驗進行3次重復(fù),用SDS-PAGE檢測目的蛋白,并應(yīng)用BioAnaly軟件與已知BSA條帶進行比對分析表達量。

1.2.5 膠原蛋白純化和表征

菌體經(jīng)均質(zhì)機破碎后進行離心澄清,再進行親和層析。親和層析之前樣液進行過濾處理,除去大顆粒不溶物;親和層析樣品進行SDS-PAGE實驗確定純度收率,純化樣品進行相關(guān)表征實驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的構(gòu)建

對轉(zhuǎn)化成功的菌株進行菌液PCR驗證。提取質(zhì)粒進行單酶切和雙酶切驗證,酶切結(jié)果如圖1所示。質(zhì)粒單酶切反應(yīng)符合預(yù)期結(jié)果,雙酶反應(yīng)獲得約為2 000 bp的片段,與設(shè)計大小相同。結(jié)果表明菌株構(gòu)建成功。

M—Maker泳道;1—構(gòu)建質(zhì)粒泳道;2—KpnⅠ酶酶切泳道;3—NdeⅠ酶酶切泳道;4—KpnⅠ和NdeⅠ酶雙酶切泳道。圖1 重組Ⅲ型人源化膠原蛋白表達載體酶切結(jié)果Fig.1 Enzyme digestion results of recombinant type Ⅲ humanized collagen expression vector

2.2 正交試驗優(yōu)化培養(yǎng)基

2.2.1 正交實驗設(shè)計

在大腸桿菌培養(yǎng)過程中提高基碳源和氮源的濃度是培養(yǎng)的關(guān)鍵點,如果氮源濃度偏高,會導(dǎo)致菌體生長過于旺盛,進而造成提前衰老自溶;碳濃度偏高,細菌代謝不平衡,菌體繁殖數(shù)量少,不利于目的蛋白的積累。碳源和氮源濃度均過高會積累大量代謝抑制物,使細胞生長和外源蛋白的表達受到抑制,降低生產(chǎn)效率。碳源和氮源濃度過低,不利于菌體生物量的提高,難以達到較高的發(fā)酵密度。因此,優(yōu)化氮源和碳源濃度以及碳氮源之間的配比,既可以滿足大腸桿菌新陳代謝的需要,又可以獲得高密度發(fā)酵的理想結(jié)果[19]。根據(jù)設(shè)計的實驗控制因素和水平,建立一個3因素4水平的正交實驗,正交實驗碳氮濃度配方如表2中所示。

表2 正交實驗培養(yǎng)基碳氮配方

2.2.2 正交試驗結(jié)果

按照方法1.2.1節(jié)進行搖瓶發(fā)酵實驗,各個實驗組的菌株生長情況如圖2所示。

圖2 正交實驗配方發(fā)酵菌株增長情況Fig.2 Growth of fermentation strains in orthogonal experiment

由圖2可以看出:氮源濃度較低時,菌株后期發(fā)酵能力較弱,誘導(dǎo)后增長較慢或幾乎不增長。氮源濃度太高時菌株增長較為緩慢,配比較為適量的氮源濃度,進入誘導(dǎo)后期仍能提供較多的氮源和能量。

根據(jù)表2中的表達量進行方差分析(表3),可知蛋白胨和酵母粉對膠原的表達具有顯著影響,碳氮源3個因素的主要影響關(guān)系依次為蛋白胨>酵母粉>甘油。通過對比每個因素的不同水平對表達量影響的平均值可以得出最佳組合:蛋白胨質(zhì)量分數(shù)為2%(0.19 mol/L)、酵母粉質(zhì)量分數(shù)為1.25%(0.11 mol/L)、甘油質(zhì)量分數(shù)為0.6%(0.195 mol/L),m(碳)∶m(氮)=1∶1.54,此時膠原蛋白表達量占比最高約為15%。

表3 實驗數(shù)據(jù)方差分析

2.2.3 搖瓶發(fā)酵驗證

以調(diào)整過的完全培養(yǎng)基為對照培養(yǎng)基,驗證正交得到配方發(fā)酵情況,培養(yǎng)基成分如表4所示。根據(jù)表4中培養(yǎng)基配方,按照1.2.1節(jié)搖瓶發(fā)酵方法進行發(fā)酵,搖瓶發(fā)酵增長情況和表達情況如圖3所示。由圖3(a)可以看出:誘導(dǎo)12 h的OD600均低于6 h的OD600,表明該菌株誘導(dǎo)后期環(huán)境改變和營養(yǎng)物質(zhì)的變化導(dǎo)致菌株量減少,但表達量均有不同程度的提高(圖3b),其中2號培養(yǎng)基的表達量明顯要高于其他實驗組表達量,其菌株的增殖過程也較為穩(wěn)定,重復(fù)進行3次實驗結(jié)果基本相同。因此,正交優(yōu)化培養(yǎng)基在搖瓶水平的表達量顯著高于完全培養(yǎng)基和其他調(diào)整后的培養(yǎng)基。

表4 驗證實驗培養(yǎng)基成分

M—Maker泳道;1—誘導(dǎo)前樣品;2—1號樣品誘導(dǎo)6 h;3—1號樣品誘導(dǎo)12 h;4—2號樣品誘導(dǎo)6 h;5—2號樣品 誘導(dǎo)12 h;6—3號樣品誘導(dǎo)6 h;7—3號樣品誘導(dǎo)12 h。圖3 搖瓶發(fā)酵增長情況和表達情況Fig.3 Growth and expression of shake flask fermentation

2.3 5 L發(fā)酵罐發(fā)酵驗證

重組蛋白表達通常會對宿主細胞帶來極大的代謝負擔(dān),對細胞生理也會產(chǎn)生重要影響,尤其是當(dāng)重組蛋白表達量有明顯的提升時影響會更加顯著[19]。因此,在搖瓶工藝條件得到確定以后,進行了5 L發(fā)酵罐放大實驗,既可以驗證碳氮比例的調(diào)整對重組Ⅲ型人源化膠原蛋白表達量的影響,又能判斷較高濃度的重組Ⅲ型人源化膠原蛋白表達對宿主大腸桿菌的菌株生長的影響。

按照方法2.2.2節(jié)的發(fā)酵方法進行5 L發(fā)酵實驗,比較培養(yǎng)基優(yōu)化前后的的表達量和菌濃度差別,發(fā)酵罐發(fā)酵情況如圖4所示。由圖4(a,c)可以看出:優(yōu)化后的培養(yǎng)基進行發(fā)酵時,菌株的增長速度有明顯的升高,溶氧控制更為穩(wěn)定,誘導(dǎo)后菌體的濕重較為穩(wěn)定,發(fā)酵結(jié)束后菌體濕重達到了22%,增加了約120%。由圖4(b,d)可以看出:相同誘導(dǎo)時間的表達量要明顯高于優(yōu)化前的表達量,通過軟件分析可知優(yōu)化前最終表達量為3.45 g/L,碳氮濃度比優(yōu)化后的表達量增加了10.31 g/L,提高了199%。實驗重復(fù)3次,結(jié)果穩(wěn)定。

M—Maker泳道;1—誘導(dǎo)前樣品;2—誘導(dǎo)3 h;3—誘導(dǎo)8 h;4—誘導(dǎo)11 h;5—圖(b)誘導(dǎo)15 h,圖(d)誘導(dǎo)14 h;6—圖(b)0.5 μg BSA,圖(d)10 μg BSA。圖4 發(fā)酵罐發(fā)酵情況Fig.4 Fermentation in fermentor

2.4 蛋白純化

完成發(fā)酵培養(yǎng)后,離心收集菌體,經(jīng)高壓均質(zhì)機進行破碎,在溫度為4 ℃,轉(zhuǎn)速為7 000 r/min條件下,離心20 min收集上清液,用0.22 μm纖維濾膜過濾上清后進行蛋白純化,經(jīng)SDS-PAGE及軟件分析計算出重組Ⅲ型人源化膠原蛋白純度高于95%,收率可以達到78%(圖5),凍干后樣品濃度和性質(zhì)與純化樣品相同。

M—Maker泳道;1—純化前樣品;2,3—純化后樣品;4—凍干后樣品。圖5 重組膠原蛋白純化樣品SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of recombinant collagen purified samples

2.5 類人膠原蛋白的N端測序

重組Ⅲ型人源化膠原蛋白結(jié)構(gòu)是最為關(guān)鍵的因素,N端的序列影響其整體的生物學(xué)功能。經(jīng)檢測重組Ⅲ型人源化膠原蛋白N端分析與預(yù)期蛋白N端序列結(jié)果一致,結(jié)果為Gly-Leu-Ala-Gly-Tyr-Pro-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Pro。

2.6 分子質(zhì)量和等電點檢測

純化后的樣品經(jīng)LC-MS/MS測定分子質(zhì)量為53 kDa,與理論分子質(zhì)量一致,純化的重組Ⅲ型人源化膠原蛋白分子質(zhì)量與設(shè)計序列分子質(zhì)量大小無差異。毛細管等電聚焦法測定等電點為pH為9.6,根據(jù)等電點進行了純化過程優(yōu)化,提高了純化收率。

3 結(jié) 論

以搖瓶發(fā)酵為出發(fā)點,初步確定重組Ⅲ型人源化膠原蛋白的發(fā)酵配方,通過5 L發(fā)酵罐驗證配方及優(yōu)化發(fā)酵工藝,菌體量提高120%,蛋白表達量提高199%。優(yōu)化純化過程目前重組Ⅲ型人源化膠原蛋白收率可以達到78%,純度高于95%。該過程既可以為生產(chǎn)放大提供有效的工藝參數(shù)和基礎(chǔ)培養(yǎng)基,又可以為后期碳氮補料工藝提供參考;通過優(yōu)化補料中的碳源和氮源的添加比例可以進一步提高膠原蛋白的表達量。研究成果也為重組Ⅲ型人源化膠原蛋白的產(chǎn)業(yè)化提供了研究基礎(chǔ),可促進重組Ⅲ型人源化膠原蛋白在食品、醫(yī)療和美容等行業(yè)的快速發(fā)展。