黃圓圓，王明慧，何麗艷，熊澤恩，陳 潔，Shaukat ALI，孟建玉，桑 文*

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 / 生物防治教育部工程研究中心，廣東廣州 510640；2. 貴州省煙草科學(xué)研究院，貴州 貴陽(yáng) 550081)

斜紋夜蛾(Spodoptera litura)屬于鱗翅目夜蛾科 昆蟲(chóng)，在亞洲、歐洲及非洲均有分布，在我國(guó)主要分布于長(zhǎng)江流域、南方各省以及黃河以北少部分地區(qū)。斜紋夜蛾能取食109 科389 種植物，包括葫蘆科、薔薇科、豆科、十字花科蔬菜以及柑橘(Citrus reticulata)等果樹(shù)[1]。其初孵幼蟲(chóng)常聚集于葉背啃食，3 齡后分散取食植物葉片、嫩莖，也可取食花蕾、花，嚴(yán)重時(shí)可將整株植物全食。5～6 齡幼蟲(chóng)進(jìn)入暴食期，其食量約占整個(gè)幼蟲(chóng)期的90%以上[2]。斜紋夜蛾不但直接危害作物，其排泄物還可引起植株腐爛[3]。斜紋夜蛾重發(fā)區(qū)域的作物減產(chǎn)達(dá)80%以上，甚至絕收[4]。

目前，以氯蟲(chóng)苯甲酰胺、蟲(chóng)螨腈、茚蟲(chóng)威、甲維鹽·茚蟲(chóng)威、甲維鹽·蟲(chóng)螨腈等藥劑為核心防治手段的化學(xué)防治是控制斜紋夜蛾的主要策略，但殺蟲(chóng)劑的長(zhǎng)期大量使用會(huì)帶來(lái)“3R”(病蟲(chóng)抗性、農(nóng)藥殘留、病蟲(chóng)再猖獗)問(wèn)題[5—8]。昆蟲(chóng)病原真菌是一種被廣泛使用的生物農(nóng)藥，專一性強(qiáng)，殺蟲(chóng)效果好，是害蟲(chóng)綠色防控技術(shù)的重要組成部分。綠僵菌(Metarhizium anisopliae) 用于防治澳洲疫蝗(Chortoicetes terminifera)[9]、云杉八齒小蠹(Ipstypographus)[10]和黑豆蚜蟲(chóng)(Aphis craccivora)[11]，致死率均在70%以上。綠僵菌同時(shí)被證實(shí)對(duì)夜蛾科害蟲(chóng)具有良好的防治效果[12]。萊氏綠僵菌(Metarhizium rileyi)對(duì)草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda) 的自然感染率達(dá)29.83%，在室內(nèi)條件下，用分離獲得的1×108個(gè)·mL-1孢子懸浮液侵染草地貪夜蛾3 齡幼蟲(chóng)，7 d 后幼蟲(chóng)死亡率可達(dá)100%[13]。

昆蟲(chóng)病原真菌資源豐富，具有寄主范圍廣、代謝類型復(fù)雜、生態(tài)友好、不易產(chǎn)生抗性、可擴(kuò)散傳播等諸多優(yōu)點(diǎn)，但其田間應(yīng)用效果易受環(huán)境影響，難以在防控蟲(chóng)害方面繼續(xù)發(fā)揮優(yōu)勢(shì)[14—17]。紫外線對(duì)微生物的殺傷主要通過(guò)使DNA 分子產(chǎn)生嘧啶二聚體，進(jìn)而使遺傳物質(zhì)失活，導(dǎo)致微生物失去繁殖能力或死亡[18]。研究表明，紫外光直接照射會(huì)導(dǎo)致附著昆蟲(chóng)體壁的昆蟲(chóng)病原真菌孢子萌發(fā)率降低，殺蟲(chóng)能力大為減弱[19—20]。

昆蟲(chóng)受到真菌侵染時(shí)，體內(nèi)免疫系統(tǒng)被觸發(fā)。昆蟲(chóng)主要依靠細(xì)胞免疫和體液免疫等先天免疫系統(tǒng)來(lái)抵御真菌感染[21]。細(xì)胞免疫中，昆蟲(chóng)血液循環(huán)系統(tǒng)中自由移動(dòng)的血細(xì)胞構(gòu)成昆蟲(chóng)免疫的第一道防線[22—23]。血細(xì)胞通常會(huì)吞噬入侵血漿的微生物，并將其包裹控制[24]。美洲大蠊細(xì)胞接種綠僵菌后，血細(xì)胞通過(guò)吞噬作用形成結(jié)節(jié)使綠僵菌孢子鈍化、不能萌發(fā)，或者徹底分解孢子[25]。體液免疫的機(jī)制多樣化，如黑化反應(yīng)、血淋巴凝固或抗菌肽的產(chǎn)生[23,26]。體液免疫往往依賴于特定的信號(hào)通路，比如果蠅受到真菌感染后被誘導(dǎo)合成抗真菌肽(Drosomycin)和碧蝽金屬肽(Metchnikowin)等[27]。除了真菌侵染會(huì)引起昆蟲(chóng)的免疫反應(yīng)，其他物理脅迫也會(huì)誘導(dǎo)昆蟲(chóng)的免疫反應(yīng)[28—29]。例如，紫外線-B(UV-B)脅迫誘導(dǎo)激活桃蚜(Myzus persicae)的抗原加工、呈遞、趨化因子信號(hào)等[30]。那么，UV-B 能否通過(guò)提前激活免疫反應(yīng)間接抑制昆蟲(chóng)病原真菌殺蟲(chóng)效果呢？

本研究通過(guò)篩選出對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)具有較高致病力的綠僵菌株系，測(cè)定UV-B 照射對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)抵抗綠僵菌致病力的影響，隨后利用異硫氰酸熒光素(FITC)對(duì)綠僵菌進(jìn)行熒光標(biāo)記，分析紫外線脅迫下斜紋夜蛾血細(xì)胞數(shù)量、血細(xì)胞吞噬作用、血漿抗真菌活性變化，明確紫外輻射對(duì)昆蟲(chóng)抵御病原真菌侵染的間接效應(yīng)，為綠僵菌田間應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 昆蟲(chóng)飼養(yǎng)

斜紋夜蛾從華南農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田的棉花上采集。按照David 等[31]方法連續(xù)多代飼養(yǎng)于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部生物防治工程研究中心。飼養(yǎng)溫度(25±2)℃，相對(duì)濕度(80±5)%，光周期(L/D) 16 h/8 h。

1.2 蟲(chóng)生真菌培養(yǎng)和孢子懸液配制

金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)分離株SCHX46、SM036 和ZB16 來(lái)自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部生物防治工程研究中心蟲(chóng)生真菌種質(zhì)資源庫(kù)。將綠僵菌接種于PDA 平板上，在(26±2) ℃下培養(yǎng)10 d[32]。待菌株充分產(chǎn)孢后，用0.01% Tween-80 去離子水溶液洗脫平板上的真菌分生孢子，用濾紙(Whatman No. 2)篩選后裝入無(wú)菌小瓶。用顯微鏡計(jì)數(shù)，配制1×109分生孢子·mL-1綠僵菌孢子懸浮液，以此為原液，用含0.01% Tween-80 去離子水連續(xù)稀釋，制備較低濃度(1×105、1×106、1×107和1×108分生孢子·mL-1)分生孢子懸浮液[17]。

1.3 斜紋夜蛾幼蟲(chóng)的綠僵菌處理

用飼喂法比較不同株系、不同濃度綠僵菌分生孢子懸浮液處理對(duì)斜紋夜蛾4 齡幼蟲(chóng)死亡率的影響。在未凝固人工飼料中添加5 種濃度(1×105、1×106、1×107、1×108和1×109分生孢子·mL-1)的各個(gè)綠僵菌分離株。以不添加真菌孢子為對(duì)照。將制備好的飼料冷卻，置于4 ℃?zhèn)溆?。將剛蛻皮的斜紋夜蛾4 齡幼蟲(chóng)饑餓3 h 后移入直徑4 cm 小塑料杯，分別投喂飼料1 g。每處理設(shè)置5 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每重復(fù)30 頭幼蟲(chóng)，每天更換新鮮飼料。統(tǒng)計(jì)處理7 d后幼蟲(chóng)死亡率，選擇致死率最好的綠僵菌分離株。利用所選的綠僵菌菌株孢子懸液注射法檢測(cè)斜紋夜蛾4 齡幼蟲(chóng)死亡率。按照1.2 制備綠僵菌菌株分生孢子懸液(1×103、1×104和1×105分生孢子·mL-1)。將4 齡斜紋夜蛾幼蟲(chóng)靜置于冰上5 min 使其休眠，然后用75%乙醇擦拭蟲(chóng)體滅菌。對(duì)幼蟲(chóng)腹部進(jìn)行注射孢子懸液以感染斜紋夜蛾。對(duì)照組注射等量的DPBS 溶液。

1.4 UV-B 處理斜紋夜蛾幼蟲(chóng)

將4 齡斜紋夜蛾幼蟲(chóng)置于UV-B 熒光燈(光源波長(zhǎng)的峰值在303 nm，TL 20W/12 RS，東莞智臣電子有限公司，中國(guó))下照射0.5 h，以未照射UV-B 的斜紋夜蛾幼蟲(chóng)作為對(duì)照。每天記錄幼蟲(chóng)死亡率。每處理設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每重復(fù)20 頭幼蟲(chóng)。

1.5 斜紋夜蛾幼蟲(chóng)血淋巴吞噬能力測(cè)定

采用異硫氰酸熒光素(FITC)對(duì)綠僵菌進(jìn)行標(biāo)記[34]。將4 齡幼蟲(chóng)分為2 組，每組20 頭幼蟲(chóng)。紫外線處理幼蟲(chóng)0.5 h，對(duì)照組幼蟲(chóng)置于實(shí)驗(yàn)室條件下。幼蟲(chóng)孵育后先用75%乙醇擦拭蟲(chóng)體滅菌，再用顯微注射器從幼蟲(chóng)腹部氣門處注射FITC 標(biāo)記的孢子懸液(1×107分生孢子·mL-1) 20 μL。注射后對(duì)幼蟲(chóng)進(jìn)行取血，并立即向血淋巴中加入抗凝劑。在暗視野顯微鏡下觀察不同時(shí)間點(diǎn)血淋巴中血細(xì)胞的吞噬情況，確定吞噬一個(gè)或多個(gè)分生孢子的血細(xì)胞百分比，測(cè)定其吞噬率。每樣本觀察200 個(gè)以上血細(xì)胞，每處理3 次重復(fù)。

1.6 斜紋夜蛾幼蟲(chóng)血漿抗真菌活性測(cè)定

用含有100 μg·μL-1氨芐西林的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)稀釋綠僵菌分生孢子懸浮液至4×104分生孢子·mL-1。分別在紫外脅迫處理0 h、4 h、8 h及24 h 時(shí)將紫外線照射0.5 h 的斜紋夜蛾4 齡幼蟲(chóng)置于冰上5 min，然后解剖并收集血淋巴，以相同時(shí)間點(diǎn)未作UV-B 處理的斜紋夜蛾4 齡幼蟲(chóng)為對(duì)照。將收集的血淋巴加入DPBS，1/5 稀釋，然后測(cè)定每毫升血淋巴細(xì)胞數(shù)。剩余樣品離心提取血漿，將血漿置于-80 ℃冰箱保存。

取稀釋的綠僵菌孢子懸浮液100 μL分別與不同處理幼蟲(chóng)的100 μL 血漿混合，置于96 孔組織培養(yǎng)板培養(yǎng)24 h 后，混合培養(yǎng)板內(nèi)溶液，從每個(gè)孔中取出50 μL 溶液，用PDB 稀釋至100 μL。將溶液涂抹在馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基(PDA)平板上，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，10 d 后測(cè)定孢子數(shù)。每處理3 次重復(fù)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 19.0 進(jìn)行單因素方差分析(one way ANOVA)和多重比較，通過(guò)Tukey’s HSD 檢驗(yàn)差異顯著性(P＜0.05)。采用GrapgPad Prism 8 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼喂法篩選綠僵菌毒力菌株

為保證對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組用金龜子綠僵菌處理的斜紋夜蛾幼蟲(chóng)死亡率有顯著差異，先篩選出毒力最強(qiáng)的菌株。用含有不同濃度分生孢子的人工飼料飼喂斜紋夜蛾4 齡幼蟲(chóng)，幼蟲(chóng)死亡率隨飼料中孢子濃度升高而升高。比較相同濃度(1×109分生孢子·mL-1)菌株處理斜紋夜蛾5 d 后的死亡率，ZB16、SM036和SCHX46 處理后的死亡率分別為82.22%、73.00%和71.00% (圖1)。三種綠僵菌菌株中，ZB16 毒力最強(qiáng)，其次為SM036 和SCHX46。此外，ZB16 菌株的致死速度也較快。因此，后續(xù)采用金龜子綠僵菌菌株ZB16 實(shí)驗(yàn)。

圖1 三種綠僵菌菌株不同濃度孢子懸浮液對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)的致死率比較Fig. 1 Concentration-mortality response of Spodoptera litura to topical application of three different isolates of Metarhizium anisopliae

2.2 不同濃度綠僵菌ZB16 孢子懸浮液對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)死亡率的影響

斜紋夜蛾4 齡幼蟲(chóng)的死亡率與綠僵菌分生孢子濃度成正比(圖2)。注射1×105分生孢子·mL-1懸浮液7 d 后，幼蟲(chóng)死亡率最高(72.22%)，而注射1×103分生孢子·mL-1懸浮液的幼蟲(chóng)死亡率最低(30.00%)。注射1×104分生孢子·mL-1懸浮液的幼蟲(chóng)死亡率為50%，該劑量用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 綠僵菌ZB16 不同孢子濃度懸浮液處理的斜紋夜蛾幼蟲(chóng)死亡率Fig. 2 Concentration-mortality response of Spodoptera litura to injection of Metarhizium anisopliae isolate ZB16

2.3 UV-B 脅迫對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)抗真菌能力的影響

UV-B 照射斜紋夜蛾幼蟲(chóng)0.5 h，然后注射不同濃度綠僵菌分生孢子懸浮液。結(jié)果表明，未經(jīng)UV-B照射的斜紋夜蛾幼蟲(chóng)注射綠僵菌懸浮液(1×104分生孢子·mL-1) 7 d 后存活率為49.67%，而UV-B 照射0.5 h 后再注射綠僵菌懸浮液的斜紋夜蛾幼蟲(chóng)7 d 后存活率為65.56%(圖3)。多重比較表明，相同時(shí)間內(nèi)不同處理間幼蟲(chóng)死亡率有顯著差異(圖3)。

圖3 UV-B 脅迫下注射綠僵菌孢子懸浮液的斜紋夜蛾死亡率(%)Fig. 3 Effect of UV-B stress on mortality (%) of Spodoptera litura injected with Metarhizium anisopliae

2.4 UV-B 脅迫對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)血淋巴中血細(xì)胞數(shù)量的影響

UV-B 照射0.5 h 再用綠僵菌處理的斜紋夜蛾4齡幼蟲(chóng)與未照射UV-B 只用綠僵菌處理的幼蟲(chóng)相比，其在不同時(shí)間測(cè)得血細(xì)胞數(shù)量均有顯著差異。UV-B處理0.5 h 后的4 h、8 h 以及24 h，用綠僵菌處理的斜紋夜蛾幼蟲(chóng)血細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組(未照射UV-B)相比顯著增加(表1)。

表1 UV-B 脅迫對(duì)幼蟲(chóng)血細(xì)胞數(shù)量的影響Table 1 Effect of UV-B exposure on the amount of hemocyte of Spodoptera litura larvae

2.5 UV-B 脅迫對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)血細(xì)胞吞噬功能的影響

UV-B 照射0.5 h 后用綠僵菌處理的斜紋夜蛾4齡幼蟲(chóng)與未照射UV-B 的幼蟲(chóng)相比，兩者在不同時(shí)間測(cè)得的血細(xì)胞吞噬率均有顯著差異。UV-B 照射組的斜紋夜蛾幼蟲(chóng)血細(xì)胞吞噬率在處理4 h 后最高，達(dá)30.2%，隨后逐漸降低(表2)。

表2 UV-B 照射對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)血淋巴中血細(xì)胞吞噬活性的影響Table 2 Effect of UV-B exposure on phagocytic activity of Spodoptera litura haemocyte in haemolymph

2.6 UV-B 脅迫對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)血漿抗真菌活性的影響

金龜子綠僵菌孢子懸浮液分別與不同時(shí)間實(shí)驗(yàn)室條件下飼養(yǎng)幼蟲(chóng)的血漿以及UV-B 照射0.5 h 處理后幼蟲(chóng)的血漿混合培養(yǎng)。培養(yǎng)10 d 后，UV-B 處理后4 h 與8 h 的幼蟲(chóng)與實(shí)驗(yàn)室條件下飼養(yǎng)的相同時(shí)間點(diǎn)的幼蟲(chóng)相比，其血漿與真菌孢子懸浮液混合物中真菌孢子數(shù)顯著降低。說(shuō)明紫外脅迫能夠增加斜紋夜蛾幼蟲(chóng)血漿的抗真菌活性(表3)。

表3 UV-B 照射對(duì)斜紋夜蛾血漿抗真菌活性的影響Table 3 Effect of UV-B exposure on anti-fungal activity in Spodoptera litura plasma

3 討論

綠僵菌是一種寄主范圍較廣的昆蟲(chóng)病原真菌，被應(yīng)用于多種害蟲(chóng)防治[15]。然而，諸多因素可能抑制綠僵菌活性，其防治效果一定程度上取決于自身對(duì)這些環(huán)境因素的耐受性。太陽(yáng)輻射中的紫外線成分(UV-A 和UV-B)對(duì)生物有機(jī)體，包括真菌有破壞作用[36]。UV-B 照射可抑制真菌分生孢子的活性[37—38]。此外，亞致死劑量的紫外線照射不僅降低綠僵菌的萌發(fā)率還能降低其毒力[39—40]。綠僵菌這種易受環(huán)境干擾的不穩(wěn)定性是對(duì)其應(yīng)用于田間防治害蟲(chóng)的一種嚴(yán)重阻礙[41—42]。然而，紫外線作為自然環(huán)境中廣泛存在的物理脅迫因子，不僅對(duì)綠僵菌產(chǎn)生直接影響，同時(shí)可能通過(guò)影響昆蟲(chóng)免疫，如上調(diào)昆蟲(chóng)中熱激蛋白基因的表達(dá)來(lái)影響綠僵菌防治效果[43]。因此明確UV-B 對(duì)綠僵菌侵染昆蟲(chóng)的影響，有助于提高蟲(chóng)生真菌類生物農(nóng)藥在害蟲(chóng)防治中的應(yīng)用效果。

本研究發(fā)現(xiàn)UV-B 脅迫能使被綠僵菌侵染的斜紋夜蛾死亡率降低。實(shí)驗(yàn)中為了排除幼蟲(chóng)死亡是由UV-B 對(duì)真菌孢子的直接影響造成的，皆對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)先進(jìn)行UV-B 脅迫，后用綠僵菌處理。有類似的研究表明，物理脅迫能減少蟲(chóng)生真菌對(duì)昆蟲(chóng)的侵染。自然感染球孢白僵菌(Beauveria bassiana)的大蠟螟(Galleria mellonella)幼蟲(chóng)，分別在43 ℃和28 ℃飼養(yǎng)15 min。43 ℃下飼養(yǎng)的幼蟲(chóng)存活時(shí)間顯著更長(zhǎng)，且大蠟螟幼蟲(chóng)先受到熱脅迫后再注射球孢白僵菌，也有類似表現(xiàn)，說(shuō)明大蠟螟幼蟲(chóng)存活率增加并非熱脅迫對(duì)真菌的不利影響造成的[44]。Mowlds 等[45]研究表明，大蠟螟幼蟲(chóng)被白色念珠菌(Monilia albican)感染前在4 ℃或37 ℃下預(yù)孵育24 h，與在30 ℃下預(yù)孵育24 h 相比，對(duì)白色念珠菌的抗性增強(qiáng)。Richards 等[44]的研究表明，熱脅迫24～48 h 能在一定程度上減少甘藍(lán)夜蛾(Mamestra brassicae)幼蟲(chóng)受綠僵菌和白僵菌的感染。溫和的物理刺激(搖晃)幼蟲(chóng)也可以減少白色念珠菌和煙曲霉(Aspergillus fumigatus)對(duì)大蠟螟幼蟲(chóng)的感染[46—47]。

物理脅迫可以誘導(dǎo)昆蟲(chóng)的免疫反應(yīng)，進(jìn)而影響真菌的致病潛力[43—44,48]。甘藍(lán)夜蛾受熱脅迫(伴隨著真菌感染)后，其血細(xì)胞數(shù)量增多、血細(xì)胞吞噬功能增強(qiáng)，且幼蟲(chóng)血淋巴中某些抗微生物肽的水平增加[44]。有研究表明，血細(xì)胞可以吞噬真菌分生孢子，并通過(guò)傷口愈合和血凝固保護(hù)昆蟲(chóng)免受真菌感染[34,49]。本研究中，紫外脅迫能提高斜紋夜蛾幼蟲(chóng)血細(xì)胞數(shù)量、血細(xì)胞吞噬功能和血淋巴抗真菌活性，并且受紫外脅迫后斜紋夜蛾幼蟲(chóng)的真菌抗性顯著提高。說(shuō)明在綠僵菌侵染昆蟲(chóng)時(shí)，UV-B 脅迫下的斜紋夜蛾幼蟲(chóng)免疫反應(yīng)被激活，從而抵御真菌侵染。

4 結(jié)論

本文從對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)具有較高致病力的金龜子綠僵菌3 種株系中篩選出毒力最高的菌株ZB16，研究表明紫外脅迫降低了受綠僵菌侵染的斜紋夜蛾4 齡幼蟲(chóng)的死亡率。進(jìn)一步利用異硫氰酸熒光素(FITC)對(duì)綠僵菌進(jìn)行熒光標(biāo)記，證實(shí)紫外線脅迫下斜紋夜蛾血細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞吞噬活性以及血漿抗真菌活性均上升，說(shuō)明紫外線脅迫下的昆蟲(chóng)免疫反應(yīng)發(fā)生變化，對(duì)綠僵菌的抗性增強(qiáng)。