許力山,王劍南,哈斯巴根,孫麗麗,曹傳旺,*

1 東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院, 哈爾濱 150040

2 呼倫貝爾市林業(yè)和草原局,林木病蟲害防治檢疫站, 呼倫貝爾 021008

電力工業(yè)的發(fā)展和工業(yè)廢水的排放導(dǎo)致重金屬污染隨地表徑流進入海洋和河流等水環(huán)境,為水生生物的生存與人類社會的經(jīng)濟和生態(tài)效益造成諸多隱患[1],檢測重金屬脅迫對水環(huán)境生態(tài)毒理效應(yīng)的理論價值和經(jīng)濟意義日益突出。以水生生物作為受試對象,研究重金屬對水生生物生理指標(biāo)與生物標(biāo)志物的影響可以彌補理化檢測的不足[2—3]。暴露于重金屬環(huán)境的水生生物在分子、組織、器官和生物體水平上受到不同程度影響,導(dǎo)致種群數(shù)量下降。搖蚊是水生昆蟲群落中的重要組成部分,可以促進水生生態(tài)系統(tǒng)的碳循環(huán)。搖蚊幼蟲對周圍水體環(huán)境變化敏感,外源環(huán)境污染使口器和觸角出現(xiàn)形態(tài)變化并影響其生理指標(biāo),可作為監(jiān)測水質(zhì)和水生態(tài)毒理實驗的指示生物[4—6]。

重金屬可影響搖蚊幼蟲蛋白結(jié)構(gòu),降低血淋巴中貯能物質(zhì),破壞細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)完整性,抑制免疫反應(yīng),引起氧化還原平衡失調(diào)[7]。研究報道Cd2+和Pb2+脅迫導(dǎo)致岡比亞按蚊(Anophelesgambiae)卵活力、幼蟲和蛹存活率、羽化率和成蟲繁殖率顯著低于對照組[8]?；旌现亟饘匐x子(Cu2+、Zn2+、Cd2+、Al2+)對羽狀搖蚊(Chironomusplumosus)幼蟲的聯(lián)合毒性在低濃度脅迫下為協(xié)同作用,高濃度為拮抗作用[9]。許多研究證實搖蚊對重金屬的抗性與齡期有關(guān)[10—11],且重金屬對搖蚊的影響可從親代傳遞到子代[12]。Bervoets等發(fā)現(xiàn)游離重金屬離子活性、外界pH值以及幼蟲對外源pH適應(yīng)性影響羽狀搖蚊幼蟲對重金屬離子的富集[13]。水生生態(tài)系統(tǒng)中不同含量重金屬影響搖蚊幼蟲口器的致畸效應(yīng)[14]。李浩等研究表明搖蚊口器致畸率與Cu2+脅迫濃度存在密切聯(lián)系[15]。陳菲發(fā)現(xiàn)Hg2+和Cd2+誘發(fā)的口器致畸程度與重金屬濃度呈極顯著正相關(guān)[16]。因此,搖蚊幼蟲對水環(huán)境中重金屬脅迫響應(yīng)可作為水質(zhì)檢測的指標(biāo)之一,但實際水生生態(tài)系統(tǒng)中重金屬離子的種類與含量動態(tài)變化十分復(fù)雜[17],對多種比例混合重金屬離子連續(xù)共同作用下水生生物生態(tài)毒理研究甚少。

本文以我國南方地區(qū)優(yōu)勢種花翅搖蚊(Chironomuskiiensis)為對象,系統(tǒng)研究了3種配比Cd2+和Pb2+對搖蚊幼蟲生長發(fā)育的影響,以及口器致畸與富集效應(yīng),初步探討了多元重金屬對搖蚊的損傷和抑制作用,為探究水環(huán)境重金屬毒理機制和風(fēng)險評估提供理論依據(jù),并為水體污染早期預(yù)警提供更全面的監(jiān)測指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx與沉積物制備

花翅搖蚊(Chironomuskiiensis)初始種群來源于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲生理與毒理實驗室,用曝曬除氯5 d以上的自來水(pH 7.58,溶解氧6.02 mg/L,總硬度80 mg/L,水溫(25±1)℃)飼養(yǎng)于玻璃魚缸中,自然光照,使用氧氣泵供氧,每7 d換水一次,每次換水投喂5—10 g金魚飼料(北京三友創(chuàng)美飼料科技有限公司)。

實驗過程中的沉積物根據(jù)化學(xué)品-沉積物-水系統(tǒng)中搖蚊毒性試驗加標(biāo)于沉積物法制備[18],模擬外界環(huán)境。沉積物配比如下:4%—5%粉末狀泥炭(粒度≤1 mm,pH 5.5—6.0)；20%高嶺粘土(干重,高嶺石含量>30%)；75%—76%石英砂(以細(xì)沙為主,50%以上50—200 μM石英砂顆粒)；加入去離子水,最終混合物的水分含量為30%—50%；加入CaCO3,將最終混合物的pH調(diào)至7.0—7.5。

1.2 Cd2+和Pb2+的致毒處理

單一重金屬離子處理參照《GB 8978—1996污水綜合排放標(biāo)準(zhǔn)》和《GB 3838—2002地面水質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》[19—20]設(shè)置脅迫濃度,CdCl2(天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司)濃度為0.2 mg/L,Pb(NO3)2(天津市巴斯夫化工有限公司)濃度為1.028 mg/L。混合離子按照單一毒力48 h LC50為基準(zhǔn)[21],以Cd2+∶Pb2+等比毒性比1∶1、1∶2、2∶1配比,通過預(yù)實驗確定3種混合離子配比處理組中各組分濃度值(表1),設(shè)置蒸餾水為對照。分別處理健康、活潑、大小一致的花翅搖蚊2齡幼蟲。

表1 3種混合離子配比處理組中各組分濃度值

1.3 Cd2+和Pb2+對花翅搖蚊生長發(fā)育指標(biāo)與口器致畸測定

將健康、活潑、大小一致的30頭花翅搖蚊2齡幼蟲放入盛有1 L重金屬藥液的魚缸中,試驗過程中不更換新溶液。不同處理組重金屬濃度參照1.2。每個濃度設(shè)置5個重復(fù),隨機選取3個重復(fù)用于觀察幼蟲化蛹率,剩余2個重復(fù)在處理7 d和14 d時從發(fā)育至4齡的幼蟲中隨機取樣,用于口器致畸觀察。

參考黃建方法配制阿拉伯膠[22]。將48 g阿拉伯樹脂溶于120 mL的蒸餾水中,完全溶解后(可放置1 d),依次加入80 g三氯乙醛,20 mL冰醋酸,20 mL 50%葡萄糖漿慢慢加熱至完全溶解,待清澈透明后用濾紙過濾,置于陰暗處備用。觀察前將受試花翅搖蚊幼蟲用沸水燙死,使用濃度分別為20%、40%、60%、80%的乙醇分別浸泡蟲體1 h,逐級脫水后,放入KOH溶液中洗滌4 h,在解剖顯微鏡(MOTIC,SMZ- 140)下將幼蟲頭部與身體剝離,保持下唇板一側(cè)向上的形態(tài)移入滴有阿拉伯膠的載玻片上,從樹膠的一側(cè)蓋上蓋玻片,用適當(dāng)?shù)牧Χ葔浩褂紫x口器的上顎與下唇板清晰呈現(xiàn)后,放在顯微鏡(Olympus dp71)下進行觀察并對口器切片標(biāo)本進行拍照。

1.4 Cd2+和Pb2+富集含量測定

將健康、活潑、大小一致的花翅搖蚊2齡幼蟲放入盛有1 L重金屬藥液及沉積物的魚缸中,不同處理組重金屬濃度參照1.2。每個濃度3個重復(fù),每個處理組50頭,連續(xù)進行14 d,在處理7 d和14 d后每組隨機選取30頭搖蚊幼蟲,置于去離子水中靜置24 h用于清洗。于30 ℃烘箱中烘干24 h,加入6 mL HNO3、2 mL HCl和2 mL H2O2處理樣本,然后置于125 ℃烘箱中消解2 h,去離子水將消解溶液定容至40 mL,用0.45 μm硝酸纖維素濾膜過濾樣品,并用HNO3酸化,電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)分析重金屬含量。將沉積物樣品在105 ℃干燥24 h,然后用以上相同的方法進行消解,去離子水將消解溶液定容至100 mL,用相同的方法處理并測定。

生物-沉積物富集因子(BSAF)可用于評價生物對被測重金屬富集的難易程度[23]。BSAF按如下公式計算:B=Ct/Cs；其中,B:生物-沉積物富集因子；Ct:搖蚊體內(nèi)重金屬含量,mg/kg；Cs:沉積物中重金屬含量,mg/kg。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用EXCEL軟件進行數(shù)據(jù)處理和繪圖。利用SPSS 20.0(SPSS Inc.,USA)統(tǒng)計學(xué)軟件對組間各指標(biāo)進行ANOVA分析,采用Duncan方法分析組間顯著性差異(P<0.05)。參考中國科學(xué)院數(shù)學(xué)研究所統(tǒng)計組(1979)方法進行重金屬交互作用計算[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd2+和Pb2+對搖蚊幼蟲化蛹率和羽化率的影響

室內(nèi)重金屬處理下,花翅搖蚊2齡幼蟲于第9天開始化蛹,處理至第14天,對照組化蛹率最高,為27.78%。單一重金屬離子處理下,Cd2+處理組的化蛹率為25.56%,高于Pb2+的化蛹率22.22%。Cd2+和Pb2+混合離子處理組1∶1、1∶2、2∶1配比化蛹率分別為13.33%、11.11%和11.11%,3種配比之間無顯著性差異,但均顯著低于單一重金屬離子處理組,其中1∶2和2∶1配比的混合離子化蛹率最低,為對照組的39.99%(圖1和表2)。

圖1 Cd2+和Pb2+對花翅搖蚊幼蟲化蛹率的影響

表2 Cd2+和Pb2+脅迫下花翅搖蚊幼蟲化蛹率的差異顯著性

對照組和單一重金屬離子處理組的搖蚊幼蟲第10天開始羽化,而混合離子處理組羽化時間比對照組推遲1—2 d。處理14 d,對照組羽化率為15.56%,單一重金屬離子Cd2+脅迫下羽化率為11.11%,高于Pb2+羽化率8.89%?；旌想x子處理組1∶1、1∶2、2∶1配比羽化率分別為5.56%、4.44%、4.44%,3種配比之間無顯著差異,但均低于單一重金屬離子處理組,其中1∶2和2∶1配比混合離子處理組羽化率最低,為對照組的28.53%(圖2和表3)。

表3 Cd2+和Pb2+脅迫下花翅搖蚊幼蟲羽化率的差異顯著性

圖2 Cd2+和Pb2+對花翅搖蚊幼蟲羽化率的影響

3種不同配比的混合離子處理后,Cd2+和Pb2+在搖蚊幼蟲體內(nèi)表現(xiàn)出交互作用,對化蛹率和羽化率產(chǎn)生不同程度的影響。1∶1配比的Cd2+和Pb2+對搖蚊化蛹率的交互作用依次為Cd2+和Pb2+單獨作用下化蛹率的26.10%和30.02%；1∶2或2∶1配比的交互作用均為Cd2+單獨作用的34.78%和Pb2+單獨作用的40.01%,交互作用大。而1∶1配比的Cd2+和Pb2+對搖蚊羽化率的交互作用為負(fù)值,1∶2或2∶1配比對搖蚊羽化率的交互作用均為0,交互作用極小(表4)。

表4 Cd2+和Pb2+聯(lián)合處理對花翅搖蚊幼蟲化蛹率和羽化率的交互作用

2.2 Cd2+和Pb2+處理下?lián)u蚊口器致畸效應(yīng)

單一和混合重金屬Cd2+和Pb2+離子誘導(dǎo)搖蚊幼蟲口器出現(xiàn)不同程度和類型的致畸情況。自然條件飼養(yǎng)的搖蚊4齡幼蟲正?？谄?上顎完整且下唇板呈規(guī)則弧形。暴露于重金屬離子后,其上顎和下唇板出現(xiàn)不同類型的畸變,主要類型為上顎前齒斷裂,中齒和基齒磨損、缺失(圖3)；下唇板齒部不規(guī)則,中央齒斷裂、磨損,邊緣齒增生、缺失等(圖4)。

圖3 暴露于Cd2+和Pb2+下的花翅搖蚊口器的上顎形態(tài)異常(100X)

圖4 暴露于Cd2+和 Pb2+下的花翅搖蚊幼蟲的下唇板致畸類型(200X)

兩種重金屬及其混合離子對花翅搖蚊幼蟲口器致畸率如圖5所示。單一重金屬離子Cd2+作用7 d和14 d致畸率分別為22.42%和32.42%,低于Pb2+處理組致畸率28.62%和34.24%。在不同比例的混合離子處理組中,1∶2配比在7 d與14 d的致畸率分別為36.57%和40.61%,高于兩種單一重金屬離子,而1∶1配比 7 d與14 d的致畸率分別為14.95%和26.06%,2∶1配比的致畸率分別為13.33%和23.33%,二者在兩個時間點均低于兩種單一重金屬離子。暴露于Cd2+和Pb2+環(huán)境中的花翅搖蚊致畸率顯著高于對照,且致畸率隨時間增長而上升,其中單一重金屬Cd2+處理、混合離子1∶1配比和2∶1配比的14 d致畸率相比7 d顯著升高(P<0.05)。

圖5 Cd2+和Pb2+脅迫下的花翅搖蚊幼蟲口器致畸率

2.3 花翅搖蚊與沉積物對Cd2+和Pb2+的富集

單一重金屬Cd2+和Pb2+以及混合離子處理下花翅搖蚊體內(nèi)的富集含量如圖6所示。兩種單一重金屬處理7 d時搖蚊Cd2+和Pb2+富集含量為11.28 mg/kg和11.46 mg/kg,處理14 d時Cd2+富集含量與7 d無顯著差異(11.50 mg/kg),而Pb2+富集含量顯著上升(31.32 mg/kg)。不同配比Cd2+和Pb2+混合離子處理7 d時,1∶1、2∶1配比處理下?lián)u蚊體內(nèi)Cd2+的富集含量分別為14.32 mg/kg和14.20 mg/kg,顯著高于1∶2配比的含量5.85 mg/kg,且這兩種配比的Cd2+富集含量高于Cd2+獨立作用。處理14 d 混合離子1∶1配比中Cd2+含量為15.12 mg/kg,與7 d無顯著差異,2∶1配比中Cd2+富集含量為9.52 mg/kg,呈顯著下降趨勢；1∶2配比中Cd2+富集含量為20.99 mg/kg,呈顯著上升趨勢。不同配比混合離子處理下Pb2+富集含量由7 d至14 d均呈上升趨勢,1∶1配比中Pb2+富集含量由7.74 mg/kg上升至16.47 mg/kg,2∶1配比中Pb2+含量9.06 mg/kg上升至12.88 mg/kg,1∶2配比中Pb2+含量15.48 mg/kg上升至42.50 mg/kg,其中1∶2配比的富集含量在兩個時間點均顯著高于另外兩種配比(P<0.05),且高于Pb2+獨立作用。

圖6 花翅搖蚊幼蟲體內(nèi)Cd2+和 Pb2+的富集含量

單一重金屬Cd2+和Pb2+及混合離子的脅迫下,沉積物的富集含量如圖7所示。兩種單一重金屬離子暴露7 d時,Pb2+處理組富集含量為8.31 mg/kg,顯著高于Cd2+富集含量1.30 mg/kg,為Cd2+處理組含量的6.38倍；暴露14 d Pb2+和Cd2+的富集含量分別為7.78 mg/kg和1.62 mg/kg,但與7 d相比無顯著性差異。不同配比的Cd2+和Pb2+混合離子處理7 d,1∶1、1∶2、2∶1配比處理的沉積物中Cd2+富集含量分別為0.96 mg/kg、1.95 mg/kg和0.73 mg/kg；3種配比Pb2+富集含量分別為8.13 mg/kg、6.94 mg/kg、12.59 mg/kg,2∶1配比處理的沉積物富集含量顯著高于其它配比。處理14 d,3種配比中Cd2+富集含量分別為0.89 mg/kg、0.66 mg/kg、0.69 mg/kg,無顯著性差異；3種配比中Pb2+濃度分別為7.18 mg/kg、6.19 mg/kg、11.25 mg/kg,3種配比相比7 d均呈下降趨勢,且差異不顯著。

圖7 沉積物中Cd2+和Pb2+的富集含量

單一重金屬離子處理下,Cd2+7 d至14 d的BSAF呈下降趨勢,Pb2+則呈上升趨勢,且Cd2+的BSAF在7 d和14 d均顯著高于Pb2+(表5)。不同配比混合離子處理下,1∶2配比處理7 d Cd2+的BSAF顯著低于1∶1和2∶1配比的BSAF,而處理14 d顯著高于1∶1、2∶1配比。Pb2+的BSAF在3種混合離子處理組中由7 d至14 d均呈上升趨勢,但幅度較小(表6)。

表5 單一重金屬處理中花翅搖蚊的生物-沉積物富集因子

表6 混合離子處理中花翅搖蚊的Cd2+和Pb2+生物-沉積物富集因子

3 討論

昆蟲在過量重金屬脅迫下產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng),消耗大量的能量,降低對食物的營養(yǎng)利用,干擾昆蟲體內(nèi)代謝和細(xì)胞正常生理功能,導(dǎo)致形態(tài)結(jié)構(gòu)、生長發(fā)育、繁殖能力異常[7],同時水生生物可將重金屬吸附在器官表面,影響器官正常生理功能,誘發(fā)細(xì)胞和組織畸型[25]。本文研究結(jié)果表明單一重金屬離子Cd2+、Pb2+及混合離子脅迫顯著降低花翅搖蚊幼蟲的化蛹率和羽化率,延長發(fā)育歷期。單一重金屬Pb2+抑制作用強于Cd2+,混合離子脅迫下的化蛹率和羽化率低于單一重金屬離子,表現(xiàn)出更強的抑制作用,這可能與Cd2+和Pb2+對搖蚊幼蟲的不同毒性作用及搖蚊幼蟲在重金屬脅迫下多種保護酶系的活性密切相關(guān)[21]。交互作用的大小可作為化蛹率或羽化率在聯(lián)合處理下不同水平的效應(yīng)變化對各單一組分依賴程度的度量依據(jù),1∶2和2∶1混合配比下的化蛹率和羽化率相同,Cd2+和Pb2+的含量變化對兩種配比的交互作用相等,而Cd2+和Pb2+對化蛹率的交互作用強于羽化率,可能與重金屬離子在幼蟲和蛹內(nèi)富集含量差異及變態(tài)發(fā)育過程中對重金屬的排泄有關(guān)[26]。重金屬脅迫導(dǎo)致?lián)u蚊幼蟲口器上顎前齒斷裂、上顎中齒與基齒缺失、下唇板斷裂、磨損、增生、缺失等,這將降低搖蚊幼蟲在水中的取食能力,影響營養(yǎng)物質(zhì)的積累,間接抑制搖蚊的生理功能,進而導(dǎo)致化蛹率和羽化率的降低?？谄髦禄逝c重金屬的種類和配比存在密切關(guān)系,單一重金屬Pb2+處理和Pb2+主導(dǎo)的1∶2配比處理組致畸率高于其它處理組。已有研究證實搖蚊幼蟲口器致畸與多線形染色體核仁活性有密切聯(lián)系,致畸率隨多線形染色體核仁活性的增強而上升[27],說明Pb2+對花翅搖蚊多線形染色體核仁活性的影響可能比Cd2+更大,導(dǎo)致致畸率更高。

重金屬具有隱蔽性、長期性和不可逆性,昆蟲通過攝食和呼吸等積累營養(yǎng)物質(zhì)和維持生理平衡,食物與環(huán)境中的重金屬也會在昆蟲體內(nèi)富集。研究報道甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)取食添加Pb2+的飼料后,在中腸檢測到大量Pb2+[26],Pb2+脅迫處理下的搖蚊幼蟲也出現(xiàn)大量Pb2+富集[28]。本文研究結(jié)果顯示Cd2+和Pb2+處理7 d時搖蚊的富集含量無顯著差異,處理14 d的Cd2+濃度與7 d無顯著變化,而Pb2+濃度則顯著升高,這種差異可能是花翅搖蚊幼蟲對Pb2+的攝入與代謝的調(diào)節(jié)和控制作用不強的結(jié)果。搖蚊幼蟲具有調(diào)節(jié)體內(nèi)必需金屬元素(如Co、Mn、Cu和Zn)的能力,將富集含量保持在穩(wěn)定水平,而缺乏對Pb等非必需金屬元素調(diào)節(jié)能力[29]。Pb2+主要作用于生物體系統(tǒng)和器官,干擾蛋白質(zhì)和酶與氨基酸的結(jié)合[30],而Cd2+影響昆蟲血淋巴的氧化還原平衡,破壞細(xì)胞和組織,降低昆蟲免疫反應(yīng)[31],且Pb2+對花翅搖蚊發(fā)揮毒力效果所需時間比Cd2+長[21],作用機制和作用時間的不同以及混合體系中一種組分對其他組分代謝酶的抑制和誘導(dǎo)作用[32]是混合離子不同配比在不同時間產(chǎn)生協(xié)同和拮抗等聯(lián)合作用的重要原因,也導(dǎo)致了本研究中不同比例混合離子處理的Cd2+和Pb2+富集含量與單一重金屬離子處理這一不同結(jié)果。1∶1和2∶1配比處理7 d時Cd2+占主導(dǎo),而1∶2配比中Pb2+占主導(dǎo),結(jié)果表明Cd2+主導(dǎo)下的致畸率低于Pb2+主導(dǎo)下的致畸率,而14 d時Pb2+富集含量的增加對致畸率無顯著影響,可能是混合離子相互作用對各組分產(chǎn)生了促進或抑制的效果。

沉積物中重金屬離子向水體擴散的主要因素包括水文物理干擾、底棲生物活動干擾以及鹽度、溶解氧濃度等在內(nèi)的化學(xué)環(huán)境條件[33—34]。梁霞等證實沉積物中Pb2+釋放的主要影響因素為水-沉積物界面pH值及物理干擾,在pH≥7.0的條件下,沉積物中重金屬釋放量相對較低[28]。本研究中水體-沉積物界面的pH值穩(wěn)定在7.0—7.5,說明重金屬Pb2+主要通過攝食和體表滲透進入搖蚊的消化系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)形成富集效應(yīng)。重金屬的生物-沉積物富集因子(BSAF)與生物對重金屬的富集能力呈正相關(guān),Cd2+在不同處理組7 d至14 d的BSAF均高于Pb2+,表明花翅搖蚊對Cd2+的富集能力比Pb2+更強,這一結(jié)果與劉曉偉等人的研究結(jié)果一致[23]。此外,混合離子處理下14 d沉積物中Cd2+和Pb2+富集含量比7 d低,這可能與搖蚊幼蟲的吸收和攝食轉(zhuǎn)化等因素有關(guān)[7]?；旌想x子處理7 d的1∶2處理組以及處理14 d的3種配比處理組中Pb2+富集含量高于Cd2+含量,但富集能力低于Cd2+,這可能與搖蚊對Pb2+和Cd2+的攝入與代謝的調(diào)控能力以及富集閾值不同有關(guān),Cd2+富集含量達到富集閾值后受到體內(nèi)調(diào)控作用不再增加,Pb2+調(diào)控作用不強導(dǎo)致Pb2+富集含量未達到富集閾值時不斷增加,而Pb2+富集閾值往往取決于環(huán)境濃度[29]。重金屬脅迫延長搖蚊幼蟲的發(fā)育歷期,將影響單位時間內(nèi)搖蚊的世代數(shù)和種群數(shù)量,破壞水環(huán)境的生態(tài)循環(huán)[35],而搖蚊作為水環(huán)境食物鏈的底層,其生物量的變化和體內(nèi)重金屬的富集也將影響整個水生生態(tài)系統(tǒng)乃至人類健康。本研究結(jié)果可為水生生態(tài)系統(tǒng)中復(fù)雜組分之間的相互作用提供理論支持,并為研究混合重金屬離子對水生生物各生理指標(biāo)的影響以及完善重金屬生物監(jiān)測提供理論參考。