李修珍姜明張穎劉育含李帆曾飛，5馬玉瑩，5楊加震，5楊芳

1.青島大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，青島266003；

2.青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心，青島266071；

3.中國人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，南京210002；

4.天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，天津300070；

5.大連醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，大連116044

氟化鈉（sodium fluoride，NaF）是一種用于防齲的常見局部氟化物[1]。NaF防齲的主要作用機(jī)制：氟離子能與釉質(zhì)中的羥磷灰石發(fā)生反應(yīng)取代磷灰石結(jié)晶的羥離子，而形成難溶于水的氟磷灰石，增強(qiáng)耐酸力，促進(jìn)再礦化[2]；抑制主要致齲菌的生長代謝以及胞外多糖的生成，阻礙細(xì)菌在牙面上的黏附與定植[3]；有效的抑酶劑，能抑制細(xì)菌胞內(nèi)烯醇酶和三磷酸腺苷酶（adenosine triphosphatase，ATPase）的活性[4]，減少有機(jī)酸的形成。

在齲病的四聯(lián)因素學(xué)說中，病原微生物的作用占主導(dǎo)地位；了解微生物之間相互協(xié)作、相互競爭的關(guān)系有助于探索防治微生物感染的新策略[5]。變異鏈球菌（Streptococcus mutans，S.mutans）是重要的致齲菌株，可通過細(xì)胞代謝作用將飲食中的碳水化合物轉(zhuǎn)化為酸并造成牙齒硬組織脫礦，最終導(dǎo)致齲齒的發(fā)生[6]。白色念珠菌（Candida albicans，C.albicans）是齲齒菌斑樣本中最常分離到的條件致病真菌種類[7]，尤其是在低齡兒童齲樣本中常與變異鏈球菌一同被檢出[8-10]。這種細(xì)菌和真菌的共生關(guān)系是否促進(jìn)生物膜毒力增強(qiáng)有待進(jìn)一步闡明[11]。因此，目前針對變異鏈球菌和白色念珠菌的相關(guān)性研究受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛重視。

隨著細(xì)菌耐藥性問題的日益突出，臨床亟需新型抗菌劑以及創(chuàng)新型的藥物評價(jià)體系[12]。傳統(tǒng)藥物評價(jià)體系采用稀釋法和擴(kuò)散法來進(jìn)行監(jiān)測，通過最小抑制濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）對目標(biāo)藥物進(jìn)行定量評價(jià)[13]，但是不生長不代表微生物無代謝活性，此類不生長但有代謝活性（non-growing but metabolically active，NGMA）的微生物細(xì)胞往往是感染復(fù)發(fā)的關(guān)鍵[14]，增加細(xì)菌感染性疾病的治療難度。另外該評價(jià)體系只能將微生物視為表型一致的群體卻忽略細(xì)胞異質(zhì)性的存在，而藥物作用下細(xì)胞的異質(zhì)性正是產(chǎn)生耐藥性的重要途徑。重水拉曼技術(shù)則不需要外源性標(biāo)記且能揭示細(xì)菌細(xì)胞的代謝活性信息，反映細(xì)胞對藥物的應(yīng)激模式并評價(jià)藥物療效。其原理是當(dāng)細(xì)菌攝入比胞內(nèi)元素質(zhì)量更大的同位素時(shí)，相應(yīng)物質(zhì)所對應(yīng)的拉曼峰會(huì)向波數(shù)減少的方向漂移，使拉曼圖譜特定區(qū)域（2 040～2 300 cm-1）出現(xiàn)重水峰。同位素的特異性漂移則作為微生物是否攝入同位素標(biāo)記底物和攝入量的指示標(biāo)志，這與微生物在單細(xì)胞層面上的細(xì)胞功能存在密切聯(lián)系。

重水拉曼技術(shù)基于ΔC-D ratio測定的最小代謝抑制濃度（minimum inhibitory concentration based on metabolic activity，MIC-MA）可定量評價(jià)抗菌劑對目標(biāo)菌種的代謝活性抑制作用[15-16]。該技術(shù)已成功應(yīng)用于評價(jià)抗菌劑對細(xì)菌、真菌代謝活性的影響[16]，但是多種微生物的代謝互作以及耐藥性研究相對較少見。因此，本研究采用重水拉曼技術(shù)在單細(xì)胞尺度下，系統(tǒng)研究白色念珠菌對變異鏈球菌代謝活性及耐藥性的影響，為預(yù)防和治療由這兩種微生物為主引起的口腔疾病提供新的啟示和思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和菌株培養(yǎng)

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)菌株變異鏈球菌UA159、白色念珠菌ATCC10231購自中國醫(yī)學(xué)菌種保藏中心；腦心浸液培養(yǎng)基（brian heart infusion，BHI）固體培養(yǎng)基：稱取BHI粉3.85 g，1.5 g瓊脂粉，溶于100 mL雙蒸水，121℃下高溫高壓滅菌15 min，待瓊脂稍冷后超凈臺內(nèi)倒平板，凝固后封口膜封口，4℃冰箱保存；BHI液體培養(yǎng)基：稱取BHI粉3.85 g，溶于100 mL雙蒸水，121℃下高溫高壓滅菌15 min，待冷卻至室溫時(shí)于4℃冰箱保存；NaF溶液：稱取NaF粉120 mg，溶于10 mL雙蒸水，0.22μm針頭式濾膜過濾除菌，配制成1.2 g·L-1NaF溶液，-20℃冰箱保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)菌株的培養(yǎng) 將變異鏈球菌UA159和白色念珠菌ATCC10231劃線接種到BHI固體培養(yǎng)基，變異鏈球菌37℃厭氧培養(yǎng)36 h；白色念珠菌37℃培養(yǎng)24 h。分別挑取變異鏈球菌和白色念珠菌菌落轉(zhuǎn)種于BHI液體培養(yǎng)基中，變異鏈球菌37℃厭氧活化12 h，白色念珠菌37℃活化12 h備用。

1.2 變異鏈球菌純培養(yǎng)體系中MIC和MIC-MA的測定

采用肉湯稀釋法測定NaF對變異鏈球菌的MIC。用分光光度計(jì)分別測定培養(yǎng)前后600 nm波長處的光密度（optical density，OD）值。調(diào)整菌液密度至OD600=0.5，將所獲菌液加入不同濃度NaF實(shí)驗(yàn)組（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.2、1.6、2.0 g·L-1）及空白對照組中，37℃厭氧培養(yǎng)24 h。ΔOD600（0和24 h OD600的變化）≤0.05，對應(yīng)的最低藥物濃度，即NaF對變異鏈球菌的MIC[17]。

采用重水拉曼技術(shù)測定NaF對變異鏈球菌的MIC-MA。將變異鏈球菌菌液按培養(yǎng)體系總體積的10%接 種 至 含0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 g·L-1NaF的BHI培養(yǎng)基（含30%重水）中，37℃厭氧培養(yǎng)，按0、1、2、4、8、12 h時(shí)間梯度取樣，每次取待測樣品1 000μL，用ddH2O洗滌3次，離心轉(zhuǎn)速為12 000 r·min-1，離心2 min，最后用ddH2O重懸細(xì)菌沉淀。取1.5μL重懸菌液，滴入CaF2玻片，自然風(fēng)干。利用LabRam HR型的改良后共聚焦拉曼熒光顯微鏡，在100倍物鏡下隨機(jī)收集30個(gè)拉曼圖譜。參數(shù)設(shè)定如下：激光源為532 nm的Nd:YAG激光源，樣品上激光強(qiáng)度50 mW，照射時(shí)間1 s，分光光柵300 grooves·mm-1，拉曼圖譜范圍400～3 500 cm-1。圖譜經(jīng)過減背景，基線歸一化，最大值標(biāo)準(zhǔn)化處理。計(jì)算ΔC-D ratio（培養(yǎng)0與8 h的C-D ratio差值），當(dāng)ΔC-D ratio≤0且標(biāo)準(zhǔn)差＜0.005，即為NaF對變異鏈球菌的MIC-MA[16]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 不同濃度的白色念珠菌上清液對變異鏈球菌重水代謝能力的影響

白色念珠菌上清液的制備：取活化后的白色念珠菌菌液配置初始OD600=4的白色念珠菌菌液，作為母液，按照濃度梯度進(jìn)行稀釋。將不同濃度的菌液進(jìn)行離心，13 000 r·min-1離心3 min，吸取上清液并用0.22μm孔徑的過濾器進(jìn)行過濾去除全部細(xì)胞后，置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

變異鏈球菌菌液（OD600=0.5）離心后將沉淀置于含30%濃度重水的BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)，同時(shí)按培養(yǎng)體系總體積10%的比例加入不同濃度的白色念珠菌上清液（OD600為0.05、0.1、0.5、2.5、4.0）刺激，陰性對照為純培養(yǎng)變異鏈球菌。將菌液放置于37℃培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)，按0、1、2、4、8、12 h時(shí)間梯度取樣，每次取待測樣品1 000μL，用ddH2O洗滌3次，離心轉(zhuǎn)速為12 000 r·min-1，離心2 min，最后用ddH2O重懸細(xì)菌沉淀。取1.5μL重懸菌液，滴入CaF2玻片，自然風(fēng)干。拉曼采集條件設(shè)置詳見1.2。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 混合培養(yǎng)體系中白色念珠菌上清液對變異鏈球菌的耐藥性影響

白色念珠菌上清液的制備方法見1.3。將變異鏈球菌接種至含不同濃度NaF（0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 g·L-1）的BHI培養(yǎng)基（含30%重水）中，同時(shí)按培養(yǎng)體系總體積的10%加入OD600=0.5的白色念珠菌上清液刺激。將菌液放置于37℃培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)，按0、1、2、4、8、12 h時(shí)間梯度取樣，每次取待測樣品1 000μL，用ddH2O洗滌3次，離心轉(zhuǎn)速為12 000 r·min-1，離心2 min，最后用ddH2O重懸細(xì)菌沉淀。取1.5μL重懸菌液，滴入CaF2玻片，自然風(fēng)干。100倍物鏡下在不同視野內(nèi)隨機(jī)采集30個(gè)拉曼圖譜，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)中定量數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)方法采用T檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用R Version 3.6.1軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，拉曼圖譜之間的比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NaF對純培養(yǎng)變異鏈球菌MIC和MIC-MA的測定

不同濃度NaF對于純培養(yǎng)變異鏈球菌的MIC測定結(jié)果。ΔOD600（0 h和24 h OD600的變化）≤0.05，對應(yīng)的最低藥物濃度，即NaF對變異鏈球菌的MIC。當(dāng)NaF濃度為0、0.2 g·L-1時(shí)，測得的ΔOD600分別為0.293、0.278，即ΔOD600＞0.05；而當(dāng)NaF濃度為0.4、0.6、0.8、1.2、1.6、2.0 g·L-1時(shí)，測得的ΔOD600分別為0.014、0.002、0.002、0.003、0.001、0.003，即ΔOD600＜0.05。因此，NaF對變異鏈球菌的MIC為0.4 g·L-1。

不同濃度NaF對于純培養(yǎng)變異鏈球菌的MICMA測定結(jié)果見圖1。當(dāng)ΔC-D ratio（培養(yǎng)0與8 h的C-D ratio差值）≤0且標(biāo)準(zhǔn)差＜0.005，即為NaF對變異鏈球菌的MIC-MA。當(dāng)NaF濃度在MIC（0.4 g·L-1），2×MIC（0.8 g·L-1）時(shí)，ΔC-D ratio＞0；在3×MIC（1.2 g·L-1），4×MIC（1.6 g·L-1），5×MIC（2.0 g·L-1）時(shí)，ΔC-D ratio＜0。因此，NaF對變異鏈球菌的MIC-MA為1.2 g·L-1，即3×MIC。即NaF在MIC-MA濃度作用下變異鏈球菌的代謝活性才得到完全抑制。

變異鏈球菌UA159在不同濃度藥物[0、MIC（0.4 g·L-1）、MIC-MA（1.2 g·L-1）]刺激下，作用8 h后的C-D ratio強(qiáng)度見圖2所示。隨著NaF濃度升高，C-D ratio逐漸降低。

圖2 變異鏈球菌UA159在不同濃度NaF作用8 h的單細(xì)胞拉曼圖譜Fig 2 The temporal change of SCRS for S.mutans UA159 under different concentrationsof NaFat 8 h

隨著NaF濃度的升高，ΔC-D ratio呈下降趨勢，表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)。當(dāng)藥物濃度達(dá)到MIC-MA時(shí)，絕大多數(shù)變異鏈球菌進(jìn)入小于0的“代謝靜止區(qū)”，而在MIC濃度下，大部分細(xì)菌仍存在一定的代謝活性。變異鏈球菌在不同濃度NaF作用下C-D ratio的時(shí)間梯度曲線顯示見圖3，MIC濃度下的變異鏈球菌UA159的C-D ratio有一定幅度的回升（27.2%），此時(shí)的NaF對變異鏈球菌的抑制代謝活性程度僅達(dá)72.8%，而藥物濃度在MIC-MA時(shí)，變異鏈球菌的代謝活性在12 h內(nèi)始終保持在基線水平（抑制代謝活性程度=X0-X1/X0-X2，X0為12 h時(shí)對照組的C-D ratio，X1為12 h時(shí)NaF在MIC濃度下的C-D ratio，X2為12 h時(shí)NaF在MIC-MA濃度下的C-D ratio）。

圖3 12 h內(nèi)變異鏈球菌在不同濃度NaF作用下C-D ratio的時(shí)間梯度曲線Fig 3 Temporal dynamics of C-D ratio of S.mutans UA159 under different concentrationsof NaFin 12 h

2.2 不同濃度的白色念珠菌上清液對變異鏈球菌重水代謝能力的影響

無藥物刺激下，變異鏈球菌在不同濃度的白色念珠菌上清液作用下C-D ratio的時(shí)間梯度曲線見圖4。當(dāng)白色念珠菌上清液OD600＜0.5時(shí)，混合體系中變異鏈球菌的重水代謝能力與純培養(yǎng)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。當(dāng)OD600≥0.5時(shí)，變異鏈球菌的重水代謝能力明顯高于純培養(yǎng)體系，且在不同時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示低濃度（OD600＜0.5）的白色念珠菌上清液并未引起變異鏈球菌的代謝改變。而當(dāng)上清液OD=2.5、OD=4.0時(shí)，變異鏈球菌的重水代謝活性在生長穩(wěn)定期（8、12 h）時(shí)與OD600=0.5時(shí)相比差異不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。因此OD600=0.5默認(rèn)為引起變異鏈球菌UA159代謝活性升高的濃度閾值，且已經(jīng)飽和。因此，本研究選取OD600=0.5來進(jìn)行下一步白色念珠菌上清液對變異鏈球菌的耐藥性研究。

圖4 變異鏈球菌UA159在不同濃度的白色念珠菌上清液作用下C-D ratio的時(shí)間梯度曲線Fig 4 Temporal dynamics of C-D ratio of S.mutans UA159 under different concentrationsof C.albicans supernatant

2.3 混合培養(yǎng)體系中NaF對變異鏈球菌的抑菌效能評價(jià)

不同濃度NaF刺激下，變異鏈球菌在OD600=

0.5的白色念珠菌上清液作用下C-D ratio的時(shí)間梯度曲線見圖5。結(jié)果顯示在NaF濃度≤1.2 g·L-1的刺激時(shí)，白色念珠菌上清液與變異鏈球菌的混合體系重水代謝能力均較純培養(yǎng)體系有一定的提高，不同時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而當(dāng)NaF濃度＞1.2 g·L-1，這種促進(jìn)作用被抑制，不同時(shí)間點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。因此，白色念珠菌上清液的加入使變異鏈球菌的代謝活性升高，從而降低了其對NaF的藥物敏感性；但當(dāng)NaF濃度足夠高時(shí)（4×MIC、5×MIC），混合體系中的變異鏈球菌的代謝活性同樣可得到完全的抑制，并在監(jiān)測周期內(nèi)未見恢復(fù)代謝活性。

圖5 不同NaF濃度時(shí)，變異鏈球菌在加或不加白色念珠菌上清液體系中的C-D ratio時(shí)間梯度曲線Fig 5 Temporal dynamicsof C-D ratio of S.mutans UA159 under different concentrationsof NaFwith or without adding the C.albicans supernatant

加入白色念珠菌上清液的混合培養(yǎng)體系中，NaF對變異鏈球菌的MIC-MA測定結(jié)果見圖6。隨著NaF濃度的升高，ΔC-D ratio呈下降趨勢，表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)。當(dāng)藥物濃度達(dá)到純培養(yǎng)體系的MICMA，即1.2 g·L-1，此時(shí)的變異鏈球菌仍存在一定的代謝活性，直到1.6 g·L-1，絕大多數(shù)細(xì)菌進(jìn)入小于0的“代謝靜止區(qū)”。因此，混合培養(yǎng)體系中，NaF對變異鏈球菌的MIC-MA較純培養(yǎng)體系升高，即1.6 g·L-1，提示白色念珠菌上清液的加入?yún)f(xié)同增強(qiáng)了變異鏈球菌的毒力，使其對NaF的藥物敏感性降低。

圖6 混合體系中，NaF對變異鏈球菌UA159的MIC-MA測量Fig 6 Themeasurement of MIC-MA of NaFfor S.mutans UA159 in themixed system

3 討論

本研究采用肉湯稀釋法和重水拉曼技術(shù)，確定了純培養(yǎng)條件下NaF對變異鏈球菌的MIC及MICMA，定量評價(jià)NaF對變異鏈球菌的抑菌效能。同時(shí)本文建立了細(xì)菌-真菌互作模型，系統(tǒng)研究白色念珠菌對變異鏈球菌代謝活性及耐藥性的影響，旨在為后期探討兩菌的相互作用及產(chǎn)物利用關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

由于在齲齒菌斑生物膜樣本的大量存在，變異鏈球菌是目前公認(rèn)與齲病關(guān)系最密切的口腔細(xì)菌。變異鏈球菌的關(guān)鍵毒力因素是通過葡糖基轉(zhuǎn)移酶（glucosyltransferases，Gtfs）將膳食中的蔗糖轉(zhuǎn)化為胞外多糖，而富含胞外多糖的基質(zhì)可作為一種限制擴(kuò)散的屏障，加速生物膜和牙面之間酸性微環(huán)境的創(chuàng)建[9]。白色念珠菌是口腔常見的條件致病真菌之一，也常在齲齒菌斑樣本中被檢出。白色念珠菌和變異鏈球菌的相關(guān)性研究已有諸多報(bào)道。Falsetta等[11]通過建立嚙齒動(dòng)物模型證明，變異鏈球菌和白色念珠菌之間建立了一種共生關(guān)系，協(xié)同增強(qiáng)牙齒表面菌斑生物膜的毒性。白色念珠菌細(xì)胞壁可提供更豐富的Gtfs結(jié)合位點(diǎn)，明顯提高變異鏈球菌的不溶性胞外多糖產(chǎn)量，從而提供大量碳源且增強(qiáng)變異鏈球菌在釉質(zhì)表面的黏附定植，加速齲病的進(jìn)展[18]。上述研究均證明白色念珠菌與變異鏈球菌之間存在協(xié)同共生效應(yīng)，但也有研究持不同觀點(diǎn)。Willems等[19]發(fā)現(xiàn)在雙菌種生物膜中白色念珠菌可主動(dòng)調(diào)節(jié)變異鏈球菌產(chǎn)酸引起的pH值降低，延緩礦物質(zhì)的丟失來預(yù)防齲病。因此，這種細(xì)菌-真菌的共生關(guān)系是否促進(jìn)生物膜毒力增強(qiáng)目前尚無定論，有待進(jìn)一步的研究進(jìn)行闡明。

本課題組將重水同位素標(biāo)記和單細(xì)胞拉曼技術(shù)相結(jié)合，并提出新的定量指標(biāo)即MIC-MA衡量藥物對細(xì)胞代謝活性的影響，在不依賴細(xì)胞培養(yǎng)、不改變細(xì)胞組分的基礎(chǔ)上，快速、定量、無損地完成目標(biāo)微生物實(shí)時(shí)代謝活性的評價(jià)[15]。該技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于評價(jià)抗菌劑對細(xì)菌、真菌代謝活性的影響，普適性評價(jià)亦證實(shí)該技術(shù)手段敏感度高且省時(shí)的獨(dú)特優(yōu)勢[17]。Tao等[16]報(bào)道變異鏈球菌UA159在≤30%重水中，生長未受到明顯抑制，且該菌活躍代謝重水并通過拉曼圖譜檢測。因此本研究選取不影響實(shí)驗(yàn)菌株生長又能產(chǎn)生明顯重水峰的重水濃度，即30%作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的默認(rèn)濃度。

為評估NaF對變異鏈球菌的抑菌效能，筆者通過肉湯稀釋法和重水拉曼技術(shù)確定了NaF對變異鏈球菌的MIC及MIC-MA。結(jié)果顯示在MIC濃度的藥物刺激作用下細(xì)菌生長雖然受到抑制，但代謝抑制程度僅達(dá)72.8%，仍存在部分代謝活性，這一現(xiàn)象的出現(xiàn)是由于大部分細(xì)胞只是進(jìn)入了NGMA的狀態(tài)[20]，這種狀態(tài)往往會(huì)增加細(xì)菌感染性疾病治療的難度，是導(dǎo)致感染復(fù)發(fā)的關(guān)鍵。而在基于重水拉曼技術(shù)的MIC-MA濃度下，細(xì)菌的生長和代謝在一定時(shí)間內(nèi)均被完全抑制。重水拉曼技術(shù)立足于細(xì)胞代謝活性角度可對藥物作用效能做出精確的判定和評估，在細(xì)菌耐藥性研究方面有重要意義。

本研究通過建立細(xì)菌-真菌互作模型，研究白色念珠菌對變異鏈球菌代謝活性和耐藥性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，白色念珠菌上清液的加入在一定程度上提高了變異鏈球菌的代謝活性，并且降低其對NaF的藥物敏感性。但是當(dāng)NaF的濃度足夠高時(shí)（4×MIC、5×MIC），混合體系中的變異鏈球菌的代謝活性同樣可得到完全的抑制，并在一定時(shí)間內(nèi)未見恢復(fù)代謝活性。這也從單細(xì)胞藥物評價(jià)層面證實(shí)了白色念珠菌和變異鏈球菌之間的協(xié)同關(guān)系，細(xì)菌-真菌的相互作用可以使微生物對抗菌劑的敏感性發(fā)生變化。有研究支持白色念珠菌可分解碳水化合物產(chǎn)生乙酸等短鏈羧酸，支持酸性環(huán)境的形成從而有利于S.mutans的生長。另外白色念珠菌可產(chǎn)生水解酶、磷脂酶、酸性蛋白酶等細(xì)胞外酶，釋放到培養(yǎng)基中產(chǎn)生催化作用[21]，這與本研究結(jié)果一致。因此了解這種特殊的相互作用有助于理解口腔感染性疾病的發(fā)生、發(fā)展、疾病本質(zhì)，從而開發(fā)新的治療策略，有針對性的預(yù)防和治療口腔感染性疾病[22]。本研究發(fā)現(xiàn)即使混合體系測定的MIC-MA同樣遠(yuǎn)低于臨床局部涂氟所用NaF濃度，即2%。這是由于目前實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是在實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)條件下獲得的，而菌斑生物膜的微生物群落存在更加錯(cuò)綜復(fù)雜的信息傳遞和能量轉(zhuǎn)換[23]。后續(xù)重水拉曼技術(shù)將致力于評價(jià)多菌種生物膜對于抗菌劑的反應(yīng)，為減少耐藥菌株的產(chǎn)生，更好地指導(dǎo)臨床用藥奠定基礎(chǔ)。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。