林琪 林昱 謝云德 馬忠雄

福建醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔黏膜科，福建省口腔疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州350002

直接或間接修復(fù)體的粘接強(qiáng)度影響修復(fù)的遠(yuǎn)期效果，釉質(zhì)的粘接通過酸蝕等途徑較易獲得令人滿意的粘接強(qiáng)度，但牙本質(zhì)的粘接效果較差，提升牙本質(zhì)粘接強(qiáng)度是口腔臨床工作面臨的重要挑戰(zhàn)。

近年來，餌激光家族中新型的摻鉺鉻釔鋁石榴石激光（Erbium，Chromium:Yttrium-Scandium-Gallium-Garnet，Er，Cr:YSGG，λ=2.78μm）憑借其安全、快速、精確等顯著的牙體硬組織作用優(yōu)勢(shì)成為研究熱點(diǎn)[1]。文獻(xiàn)[2-3]報(bào)道，激光輻照時(shí)，其波長(zhǎng)能夠被牙體組織中水、羥磷灰石（hydroxyapatite，HA）和膠原纖維吸收而產(chǎn)生消融作用，表層牙體硬組織及其中的水分被迅速加熱，其中的水被瞬間蒸發(fā)，水蒸氣在輻照區(qū)域?qū)е戮植績(jī)?nèi)膨脹，當(dāng)膨脹力量超過牙體結(jié)構(gòu)的晶體結(jié)合力時(shí)，牙體結(jié)構(gòu)發(fā)生消融破壞[4]。當(dāng)選用較短脈寬鉺激光并伴隨噴水冷卻情況下輻照硬組織時(shí)，輻照區(qū)域產(chǎn)生的熱量很少傳播到鄰近正常牙體組織，但隨著激光能量的增高，激光光能引起輻照區(qū)域溫度升高使組織內(nèi)壓力增大，在提高硬組織消融效率的同時(shí)還會(huì)影響輻照區(qū)域組織發(fā)生局部物理、化學(xué)性能改變；更高劑量下進(jìn)行激光輻照，可能引起組織熔融改變。但激光熱機(jī)械消融的過程對(duì)牙本質(zhì)表面理化性質(zhì)造成的影響仍缺乏研究，激光輻照可能引起組織熔融改變，影響組織表面形貌及理化性能，從而改變后續(xù)粘接修復(fù)。

激光照射對(duì)牙本質(zhì)粘接強(qiáng)度的影響各持所見，過往研究[5]顯示，Er，Cr:YSGG激光有助于提高牙本質(zhì)粘接強(qiáng)度，也有研究[6]表明該激光對(duì)牙本質(zhì)粘接強(qiáng)度是負(fù)面的影響。因此，有必要從更微觀的角度來探討激光對(duì)牙本質(zhì)表面粘接界面的影響。通常的檢測(cè)手段都是用粘接力、剪切力實(shí)驗(yàn)來證明激光對(duì)粘接強(qiáng)度的影響，或是簡(jiǎn)單的用掃描電鏡圖來解釋激光照射增加牙體表面粗糙度，從而增強(qiáng)粘接效果。本研究運(yùn)用原子力顯微鏡（atomic force microscopy，AFM）研究人牙本質(zhì)在6.18～11.1 J·cm-2的Er，Cr:YSGG激光輻照前后，牙本質(zhì)HA晶體微納米結(jié)構(gòu)、形貌的改變，同時(shí)可通過測(cè)量得到樣品表面的三維圖像，以及其硬度、彈性、摩擦力、粗糙度等物理特性，運(yùn)用能譜儀（energy-dispersive spectroscope，EDS）分析有機(jī)成分的改變，并探討相應(yīng)的變化趨勢(shì)，以期對(duì)后續(xù)粘接劑的改良或激光專用型粘接劑的使用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 激光設(shè)備

本研究所用激光設(shè)備是波長(zhǎng)為2.78μm的Er，Cr:YSGG激光（BioLaser Technology，BioLaser，美國(guó)），該激光最大輸出功率：6.0 W，輸出能量范圍：0.25～6.0 W（步進(jìn)0.25 W調(diào)節(jié)），激光通過光纖直徑750μm，脈寬150μs，脈沖頻率為20 Hz。

1.2 樣本制備

選取10 d內(nèi)拔除的無齲、無損傷、無脫礦及無發(fā)育不良的人第三磨牙共12顆（患者年齡在18～30歲，經(jīng)患者知情同意），清潔并儲(chǔ)存于4℃含0.5%氯胺T溶液中備用。用低速金剛石切片刀垂直于牙體長(zhǎng)軸在水冷卻下切除冠部1/3釉質(zhì)及牙根，再垂直于牙體長(zhǎng)軸切取1.0 mm厚度的牙本質(zhì)片，每顆牙齒獲得1個(gè)牙本質(zhì)片。每個(gè)牙本質(zhì)片用水砂紙逐步打磨，序列拋光（600、800、1 000、1 200、1 500、2 000目），最后布絨高度拋光，超聲波清洗。

采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)方法，將樣本分成12個(gè)區(qū)組，每個(gè)牙本質(zhì)片按順序均勻取5個(gè)部位，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分配，分別選取0（空白組）、6.18、8.04、9.89、11.1 J·cm-2不同光劑量，激光通過光纖直徑750μm的Tip進(jìn)行傳輸，Tip離樣品的距離為1 mm，脈寬150μs，脈沖頻率為20 Hz，步控電機(jī)光學(xué)臺(tái)控制掃描速度為1 mm·s-1，在氣/水比例為60%/70%的噴霧下激光束垂直于樣品表面進(jìn)行面掃描。

1.3 AFM相位成像分析

將樣本常規(guī)干燥，按照區(qū)組分別標(biāo)記，應(yīng)用AFM（NanoScopeⅢa Multimode，Veeco，美國(guó)）的相位成像技術(shù)，通過輕敲模式掃描過程中振動(dòng)微懸臂的相位變化來檢測(cè)激光照射部位，得出的phase圖用于分析牙本質(zhì)表面有機(jī)物、無機(jī)物比例的變化，并對(duì)牙本質(zhì)表面粗糙度（Rq值）進(jìn)行測(cè)量。

1.4 AFM微納米形貌結(jié)構(gòu)觀察

室溫下使用AFM對(duì)激光照射部位牙本質(zhì)表面顆粒形貌進(jìn)行觀察，采用輕敲模式成像，探針材料為硅，微懸臂的共振頻率為300 kHz，彈性系數(shù)為40 N·m-1，圖片像素采集點(diǎn)為256×256，掃描頻率為1.5 Hz。

1.5 EDS成分分析

樣本按照區(qū)組分別標(biāo)記，用EDS（Pheonix 60S，EDAX，美國(guó)）進(jìn)行微區(qū)化學(xué)成分分析。EDS所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的方差分析及多個(gè)樣本均數(shù)間多重比較的LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 激光照射前后牙本質(zhì)有機(jī)/無機(jī)成分檢測(cè)

不同能量激光照射部位牙本質(zhì)表面phase圖見圖1，無機(jī)相顆粒襯度較高（黃白色部分高襯度像為無機(jī)質(zhì)），有機(jī)相襯度低（灰黑色部分低襯度像為有機(jī)質(zhì)），相鄰的高襯度顆粒間有低襯度像包繞，高襯度與低襯度像相互交織，彼此連接緊密。激光照射前，高襯度部分占大范圍，低襯度部分占小范圍（圖1a）；激光照射后，低襯度部分范圍減少，高襯度部分的相對(duì)比例增加，相鄰的高襯度顆粒間連接緊密（圖1b～e）。phase結(jié)果表明隨著激光強(qiáng)度增強(qiáng)，表面有機(jī)物被消融數(shù)量增加，露出無機(jī)物表面，即有機(jī)質(zhì)所占的比例減少，無機(jī)質(zhì)所占比例進(jìn)一步增加。

圖1 不同能量密度激光照射后牙本質(zhì)表面phase圖Fig 1 Phasediagram of dentin surfacewith different Er，Cr:YSGGlaser irradiation

2.2 激光照射前后牙本質(zhì)表面粗糙度測(cè)量

利用軟件對(duì)進(jìn)一步對(duì)不同激光照射部位牙本質(zhì)表面粗糙度進(jìn)行測(cè)量。經(jīng)Kruskal-WallisH檢驗(yàn)分析，各組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)不同能量密度與粗糙度之間做Spearman秩相關(guān)分析，結(jié)果顯示激光照射能量與粗糙度呈正相關(guān)，且相關(guān)性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說明激光照射強(qiáng)度的增強(qiáng)能明顯增加牙本質(zhì)表面的粗糙度（圖2）。

圖2 不同能量密度激光照射與牙本質(zhì)表面粗糙度的關(guān)系Fig 2 The roughness of dentin surface with different Er，Cr:YSGG laser irradiation

2.3 激光照射前后牙本質(zhì)納米顆粒形貌觀察

利用NanoScope（R）Ⅲ5.30r1軟件對(duì)不同激光照射部位牙本質(zhì)樣本進(jìn)行三維處理，獲得激光輻照部位牙本質(zhì)HA納米顆粒的AFM形貌圖。在1μm尺度下獲得牙本質(zhì)表面的納米顆粒見圖3。激光照射前，牙本質(zhì)表面納米顆粒界限較為清晰，排列緊密，顆粒大小均一（圖3a）；不同能量密度的激光輻照后，牙本質(zhì)表面部分納米顆粒相互團(tuán)聚，顆粒大小不均一，但仍可見清晰的納米顆粒形態(tài)，未見完全融合、增大的納米顆粒（圖3b～e）。

圖3 1μm尺度下牙本質(zhì)表面納米顆粒AFM圖Fig 3 AFM images of dentine surface at 1μm scale

在650 nm尺度下，激光照射前，HA晶體呈顆粒狀，暴露的HA顆粒大小較均勻，暴露端為半球形，顆粒間鑲嵌排列且較緊密（圖4a）。激光照射后，部分納米HA顆粒相互團(tuán)聚，堆垛狀成簇排列，顆粒大小不均一，但仍可見顆粒間存在界限（圖4b～e）。

圖4 650 nm尺度下牙本質(zhì)表面納米顆粒AFM圖Fig 4 AFM images of dentine surface at 650 nm scale

2.4 表面元素分析

EDS測(cè)試結(jié)果顯示牙本質(zhì)中除了主要的Ca、P、O、C元素外，還含有微量元素Na、Mg、Cl。不同激光照射部位C、O、Ca、P、Na、Mg元素及C/Ca、Ca/P比值（重量比）改變趨勢(shì)見圖5。

圖5 不同能量密度激光照射前后牙本質(zhì)表面化學(xué)成分變化Fig 5 Chemical composition of dentine samples with different Er，Cr:YSGGlaser irradiation

采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)資料的方差分析，結(jié)果顯示Er，Cr:YSGG激光照射后不同處理組牙本質(zhì)表面元素總體均數(shù)不全相等（P＜0.05）。故進(jìn)一步進(jìn)行多個(gè)樣本均數(shù)間多重比較的LSD檢驗(yàn)（表1），結(jié)果顯示激光照射后牙本質(zhì)表面C、O、Na元素及C/Ca比值下降，Ca、P元素及Ca/P比值上升，與空白組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但4種不同能量密度間激光照射后C、O、Ca、P、Na元素及C/Ca、Ca/P比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。說明Er，Cr:YSGG激光輻照會(huì)造成牙本質(zhì)表面C、O、Na元素及C/Ca比值下降，Ca、P元素及Ca/P比值上升。激光照射對(duì)各處理組間Mg元素的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明Er，Cr:YSGG激光輻照不會(huì)引起牙本質(zhì)表面Mg元素的改變。

表1 不同處理組間的牙本質(zhì)表面化學(xué)成分差異性比較Tab 1 Comparison of chemical composition of dentin surface between different treatment groups ±s

表1 不同處理組間的牙本質(zhì)表面化學(xué)成分差異性比較Tab 1 Comparison of chemical composition of dentin surface between different treatment groups ±s

注：各處理組間均數(shù)的LSD法多重比較結(jié)果用上標(biāo)字母表示，每行中上標(biāo)字母相同者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），字母不同者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

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3 討論

3.1 Er，Cr:YSGG激光照射后牙本質(zhì)有機(jī)物及表面成分改變

探討牙本質(zhì)有機(jī)膠原對(duì)粘接強(qiáng)度的影響時(shí)，早期的研究一直著眼于牙本質(zhì)粘接混合層的形成方面。1982年Nakabayashi等[7]首次提出混合層概念，即酸蝕處理后牙本質(zhì)表面脫礦，暴露出膠原纖維，粘接劑單體滲入該膠原纖維網(wǎng)中聚合反應(yīng)后，生成的聚合物與膠原纖維相互纏繞在一起，形成了一個(gè)機(jī)械固位層。粘接樹脂和牙本質(zhì)表面暴露膠原纖維在分子水平相互交聯(lián)，構(gòu)成了樹脂-牙本質(zhì)粘接強(qiáng)度的機(jī)械力學(xué)來源。隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)化學(xué)作用是另一種重要的粘接力來源，膠原蛋白也起重要作用。Betancourt等[8]認(rèn)為，膠原中的游離胺基、亞胺基、羥基和羧基，均可為粘接劑與牙本質(zhì)的化學(xué)結(jié)合提供活性基團(tuán)，粘接劑與這些離子、基團(tuán)形成絡(luò)合或螯合鍵、離子鍵以及共價(jià)鍵，產(chǎn)生牢固的結(jié)合力。

膠原纖維的結(jié)構(gòu)完整性及理化性能對(duì)粘接強(qiáng)度和持久度具有重要作用。然而，Sheth等[9]研究發(fā)現(xiàn)，膠原纖維溫度耐受能力較差，人牙本質(zhì)表面溫度為60～80℃時(shí)，牙本質(zhì)膠原纖維即開始變性、凝固或壞死；當(dāng)溫度達(dá)100～300℃時(shí)，牙表面脫水，蛋白質(zhì)和脂類等有機(jī)物發(fā)生碳化。上述改變將明顯影響復(fù)合修復(fù)材料的粘接強(qiáng)度。本實(shí)驗(yàn)phase結(jié)果表明Er，Cr:YSGG激光照射牙本質(zhì)表面有機(jī)質(zhì)的減少，推測(cè)激光照射導(dǎo)致表層膠原纖維在瞬間的高熱高壓作用下發(fā)生變性、凝固，這樣的變化不利于后續(xù)良好粘接強(qiáng)度的獲得。有研究[10]表明，粘接時(shí)酸蝕處理可以增大塌陷膠原纖維束之間的空隙，促進(jìn)粘接樹脂滲透，在一定程度上恢復(fù)膠原纖維的原有網(wǎng)狀空間結(jié)構(gòu)。激光處理后牙本質(zhì)再使用磷酸酸蝕可恢復(fù)膠原纖維網(wǎng)混合層的形成，提高激光蝕刻后牙本質(zhì)的粘接效果[11]。因此，激光照射后對(duì)牙本質(zhì)有機(jī)質(zhì)的損傷，可以通過輔助使用酸蝕處理的方法得以彌補(bǔ)，進(jìn)而弱化激光輻照處理對(duì)后期粘接強(qiáng)度的影響。同時(shí)，激光照射前后牙本質(zhì)表面粗糙度增加，有助于提高后期的粘接強(qiáng)度。

EDS測(cè)試數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示激光輻照后C/Ca比例明顯下降，但各能量密度之間C/Ca比變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，此結(jié)果與phase結(jié)果說明，能量密度在6.18～11.1 J·cm-2之間，采用Er，Cr:YSGG激光輻照牙本質(zhì)會(huì)引起牙本質(zhì)表面的有機(jī)質(zhì)分解，且在6.18 J·cm-2能量密度下就足以引其上述反應(yīng)。EDS結(jié)果中，Ca、P元素的明顯升高提示激光照射后牙本質(zhì)表面的溶解度下降，可能在一定程度上增強(qiáng)牙本質(zhì)表面抗酸性，此與Resende等[12]的研究結(jié)果一致。激光照射使牙體硬組織成分發(fā)生改變，有機(jī)物、碳酸鹽及水含量減少，并導(dǎo)致牙本質(zhì)溶解性降低，抗酸性增強(qiáng)。然而牙本質(zhì)溶解性降低、抗酸性增強(qiáng)是否會(huì)影響牙體修復(fù)時(shí)粘接劑與牙體組織間的滲透、聚合仍有待進(jìn)一步的研究。

3.2 Er，Cr:YSGG激光照射后牙本質(zhì)表面納米微形貌改變

鉺激光消融牙體硬組織的機(jī)制為：激光輻照牙體組織時(shí)，在短時(shí)間內(nèi)表層牙體硬組織及其中的水分被迅速加熱，其中的水被瞬間蒸發(fā)，水蒸氣在輻照區(qū)域?qū)е戮植績(jī)?nèi)膨脹，當(dāng)膨脹力量超過牙體結(jié)構(gòu)的晶體結(jié)合力時(shí)，牙體結(jié)構(gòu)發(fā)生消融破壞[13]。上述微爆效應(yīng)從激光照射的瞬間便開始，一直持續(xù)到激光能量下降。牙體硬組織消融點(diǎn)經(jīng)歷了碳化、熔融、粗糙、熔化、重結(jié)晶、彈坑狀形成等過程，并在牙本質(zhì)表面形成類似于經(jīng)酸侵蝕后的不規(guī)則坑狀結(jié)構(gòu)[14]。根據(jù)Lin等[15]的研究，CO2激光照射過程中發(fā)生了牙本質(zhì)晶體的重結(jié)晶及晶體尺寸的增大。Nd:YAG激光也得到了類似的結(jié)果[16]。HA晶體有相當(dāng)比例的離子位于晶體的表面或接近表面，有不同的理化活性，晶體的形態(tài)改變有可能影響表層硬組織的化學(xué)穩(wěn)定性及與粘接材料的作用模式和效果。本研究結(jié)果證實(shí)在6.18～11.1 J·cm-2能量密度下，Er，Cr:YSGG激光輻照產(chǎn)生的熱機(jī)械過程會(huì)造成牙本質(zhì)表面納米晶體的團(tuán)聚，但未見到明顯的納米微形貌的改變。同時(shí)，該激光即使在6.18 J·cm-2能量密度下輻照牙本質(zhì)，都會(huì)造成有機(jī)質(zhì)的減少。

綜上所述，應(yīng)用Er，Cr:YSGG激光在6.18、8.04、9.89、11.1 J·cm-2的能量密度下輻照人牙本質(zhì)，均會(huì)造成牙本質(zhì)表面有機(jī)質(zhì)所占的比例減少，無機(jī)質(zhì)所占比例相對(duì)增加。說明在此強(qiáng)度下，有機(jī)質(zhì)逐漸被燒灼破壞、無機(jī)質(zhì)含量升高。在微納米晶體形貌方面，激光照射會(huì)造成牙本質(zhì)HA納米顆粒相互團(tuán)聚，但仍可見顆粒間存在清晰的界限及納米顆粒形態(tài)，未見完全融合、增大的納米顆粒。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。