張國梁，吳 江，王佳琦，魏 巍，宋振宇，任寶瑞

(佳木斯大學口腔醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯 154002)

近年來，口腔癌癥已經(jīng)成為全球性健康難題之一[1]。我國的口腔癌主要以口腔鱗狀細胞癌為主，約占口腔癌的95%，是世界上12種最常見的口腔惡性腫瘤之一[2,3]?？谇击[狀細胞癌以分化和淋巴結轉移為特征，易出現(xiàn)區(qū)域淋巴結轉移或遠處轉移，具有明顯的高侵襲性的鱗狀上皮細胞癌[4,5]。主要發(fā)生于舌、牙齦、頰黏膜、唇黏膜、腭部、上頜竇等部位[6,7]。其中舌鱗狀細胞癌在OSCC中最常見，具有典型性特點，多發(fā)生于舌緣、舌尖、舌背部位。患者預后差，生存率低，而且OSCC晚期患者會影響咀嚼、呼吸、吞咽等口腔功能，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[8～10]。因此，研究口腔鱗癌的轉移發(fā)生機制，具有一定的臨床意義。

20世紀70年代，Kato等從子宮頸鱗狀細胞癌中分離出一種腫瘤特異性抗原，最初命名為“TA-4”，又稱為鱗狀細胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen， SCCA)，屬于內(nèi)源性蛋白酶抑制劑的SERPIN家族成員，與子宮頸鱗狀細胞癌晚期密切相關[11]。具有抑制溶酶體組織蛋白酶作用的SERPINB3，在子宮頸、食管、頭頸部、舌、肝臟等粘膜上皮鱗癌中高表達，但在上述部位的正常鱗狀上皮細胞中呈現(xiàn)不表達或低表達[12,13]。關于SERPINB3基因在口腔鱗癌轉移的研究甚少，本研究主要探討SERPINB3基因與口腔鱗狀細胞癌轉移的相關性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人舌鱗狀細胞癌細胞系(TCA8113)。含SERPINB3 shRNA的慢病毒購自Genecopoeia, 其作用靶點分別為：shRNA1: 5’-GATGAGGCAATACACATCTTT-3’；shRNA2：5’-GCACAACAGATTAAGAAGGTT-3’；shRNA3:5’-GGTAATATTGGCAGCAATACC-3’。三個質(zhì)粒中均含有嘌呤霉素抗性基因及EGFP標簽。

1.2 細胞培養(yǎng)

利用含10 %胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)TCA8113細胞。每隔3天傳代一次，以保證細胞的活性狀態(tài)。

1.3 SERPINB3基因敲低穩(wěn)轉細胞系的篩選

將TCA8113細胞按照2.0×105個細胞/孔的量接種于6孔板中，培養(yǎng)16h后，待細胞匯合度達到60%～70%時，進行SERPINB3 shRNA慢病毒轉染，具體步驟如下：

將TCA8113細胞在4℃條件下冷凍處理2h；轉染前，利用完全培養(yǎng)基將病毒稀釋至適當?shù)臐舛?每孔加入病毒4.5μL(2.08×108TU/mL)，MOI ≈ 1)，同時加入Polybrene(索萊寶，貨號：H8761)至其終濃度為5μg/mL，充分混合均勻；利用PBS對細胞清洗三次；加入上述稀釋好的含病毒顆粒的培養(yǎng)基，將細胞在37℃，5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)12h后，將培養(yǎng)基更換為新鮮的不含病毒的完全培養(yǎng)基；在37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)72h后，加入終濃度為1μg/mL的嘌呤霉素；再培養(yǎng)24h，待未轉染的細胞完全死亡后，更換培養(yǎng)基為新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)直至細胞長滿培養(yǎng)皿，即得SERPINB3基因被穩(wěn)定敲低的細胞系。

1.4 Western blotting檢測

首先收集細胞，加入含PMSF的RIPA 裂解液獲得細胞總蛋白，進行BCA定量，蛋白電泳、轉膜，5%脫脂奶粉封閉1h，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，根據(jù)ECL發(fā)光試劑盒實驗步驟進行顯影和定影，照相，并進行數(shù)據(jù)分析。選用的內(nèi)參基因為鼠抗人β- Actin (Abcam, ab6276)，兔SERPINB3抗體(Abcam, ab154971)。目標基因SERPINB3曝光、顯影后，再依次用蒸餾水處理10min，0.2 M NaOH處理10min，蒸餾水處理10min，把SERPINB3抗體剝離，之后再從封閉那步開始，然后孵育抗體β-Actin，曝光、顯影。

1.5 劃痕實驗

實驗分組為Control組和SERPINB3敲低組，將野生型TCA8113細胞系以及SERPINB3 shRNA穩(wěn)轉細胞系分別按照3.5×105個細胞/孔的量接種于6孔板，培養(yǎng)16h后，利用無菌吸頭均勻地在培養(yǎng)皿中進行劃線。利用PBS對細胞清洗3次后，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基，并分別測量0h、24h、48 h劃痕的寬度，最后根據(jù)劃痕寬度變化評估細胞遷移能力的改變，具體公式如下：

遷移率 =(0h寬度 -t時間寬度)/ 0h寬度，其中t為劃痕寬度檢測的時間點。

最后，將上述所得實驗數(shù)據(jù)利用GraphPad Prism 6.0軟件分析。

1.6 細胞遷移能力檢測實驗Transwell實驗

實驗分組為Control組和SERPINB3敲低組。實驗開始前，以1:8的比例稀釋基質(zhì)凝膠，并涂覆Transwell室底膜的上表面，室溫風干5h后，加入50μL 含0.1% BSA的無血清DMEM培養(yǎng)基并于37℃條件下孵育30min以水化基質(zhì)膠，用于后續(xù)實驗。按照4×104個細胞/孔的量分別將野生型TCA8113細胞以及SERPINB3敲低型細胞接種于Transwell小室中，其中上層培養(yǎng)液為100μL含0.1% BSA的無血清DMEM培養(yǎng)基，下層為700μL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24h后，利用醫(yī)用棉簽輕輕擦去上層細胞。PBS清洗細胞3次后，利用甲醇固定20min，并再次利用PBS對細胞清洗3次。利用0.1%的結晶紫染色10min。PBS溶液沖洗3次。然后在熒光顯微鏡下觀察。選擇不同視野進行對比，判斷SERPINB3 敲低對細胞侵襲能力的影響。最后，將上述所得實驗數(shù)據(jù)進行GraphPad Prism 6.0軟件分析。

2 結果

2.1 Western blotting檢測SERPINB3 shRNA的慢病毒轉染情況

含SERPINB3 shRNA的慢病毒轉染48h后，TCA8113細胞中SERPINB3蛋白的表達情況。在與空白對照Control組的蛋白表達對比發(fā)現(xiàn)，SERPINB3 shRNA3慢病毒質(zhì)粒能夠有效的減弱SERPINB3在TCA8113細胞中的表達。因此，后續(xù)的實驗選用SERPINB3 shRNA3穩(wěn)轉細胞系作為實驗組細胞。見圖1。

圖1 SERPINB3 shRNA的慢病毒轉染48h后SERPINB3表達

2.2 劃痕實驗結果

通過創(chuàng)傷愈合實驗確定SERPINB3 敲低對細胞遷移的影響。按照質(zhì)粒轉染后0h、24h、48h3個時間段，分別對質(zhì)粒轉染24h、48h后創(chuàng)口寬度變化比值所繪制的柱狀圖，見圖2，根據(jù)創(chuàng)面愈合大小定量分析，結果發(fā)現(xiàn)SERPINB3敲低后，細胞的創(chuàng)口愈合速度明顯受到抑制，結果證明SERPINB3的表達與舌鱗狀細胞癌的遷移有一定相關性。數(shù)據(jù)使用Graph Pad Prism軟件處理，并用平均值±標準差表示，n=3，和對照組相比，有統(tǒng)計學意義(***P<0.001)。

圖2 SERPINB3 敲低后細胞遷移能力變化(200μm，40×)

2.3 Transwell實驗

Transwell試驗是根據(jù)通過基質(zhì)凝膠的細胞數(shù)量來判斷毒性質(zhì)粒對細胞侵襲能力的影響。相同時間內(nèi)，細胞透過基質(zhì)膠的數(shù)量越少，則表明毒性質(zhì)粒對細胞的侵襲和遷移能力抑制作用越強。見圖3，顯微鏡下觀察到SERPINB3 敲低后，穿過基質(zhì)凝膠的細胞明顯比Control組細胞的數(shù)量少，從而證明SERPINB3的表達與舌鱗狀細胞癌的侵襲有一定相關性。數(shù)據(jù)使用Graph Pad Prism軟件處理，并用平均值±標準差表示，n=3，和對照組相比，有統(tǒng)計學意義(***P<0.001)。

圖3 SERPINB3敲低后細胞侵襲能力變化(50μm，200×)

3 討論

在上皮源性鱗癌癥發(fā)展過程中，SERPINB3可以抑制癌細胞凋亡，繞過細胞死亡的通路機制，促進腫瘤的生長、轉移、擴散及預后惡化。SERPINB3的重要致癌特征是誘導上皮間充質(zhì)轉化。有研究發(fā)現(xiàn)當上皮源性鱗癌細胞在缺氧環(huán)境下借助低氧誘導因子HIF-2α誘導后，發(fā)現(xiàn)SERPINB3能夠促進EMT和轉化生長因子生成，并且成為腫瘤侵襲和轉移的關鍵[14]。在子宮頸鱗狀細胞癌和食管鱗狀細胞癌中，發(fā)現(xiàn)SERPINB3的表達水平與腫瘤浸潤和淋巴結轉移的頻率相一致[15]。有研究通過向HepG2細胞系和MDCK細胞系中分別添加上調(diào)外源重組SERPINB3蛋白，發(fā)現(xiàn)SERPINB3的表達上調(diào)會導致轉染細胞出現(xiàn)細胞簇狀且連接松散，細胞形態(tài)呈細長形改變，并且證明這些改變與減少E-cadherin鈣粘蛋白和增加β-catenin平行增加相關[16]。由此可見，SERPINB3的表達上調(diào)與癌細胞的EMT密切相關，通過抑制細胞凋亡來促進細胞存活，增加細胞增殖并誘導上皮-間充質(zhì)轉化，加速癌細胞的侵襲和轉移，提高癌細胞的增殖能力。本研究提示通過shRNA基因干擾技術，發(fā)現(xiàn)SERPINB3敲低能夠抑制人舌鱗狀細胞癌的轉移，SERPINB3基因有可能成為基因治療口腔鱗癌的靶點，為建立腫瘤特異性基因調(diào)控自殺基因成為靶向毒素體系提供了實驗依據(jù)。