張樂樂, 鄒強(qiáng), 田雅楠, 呂春暉, 鄭詩(shī)怡, 姜廣峻, 高龍坤,侯玉平, 王凱

1. 魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 山東 煙臺(tái) 264025;

2. 煙臺(tái)市科技創(chuàng)新促進(jìn)中心, 山東 煙臺(tái) 264003;

3. 魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 山東 煙臺(tái) 264025

海馬(Hippocampusspp.)具有很高的經(jīng)濟(jì)、觀賞和藥用價(jià)值(劉國(guó)信 等, 2006), 是我國(guó)二級(jí)保護(hù)動(dòng)物、國(guó)際華盛頓公約指定保護(hù)物種(Lourie et al,1999)。作為海洋生態(tài)環(huán)境的旗艦物種(Lourie et al,2004; Cohen et al, 2017), 野生海馬資源已瀕臨枯竭(Ternes et al, 2016)。加之中藥材市場(chǎng)對(duì)海馬的需求量持續(xù)增加, 導(dǎo)致海馬價(jià)格持續(xù)攀升。我國(guó)廣東、廣西、福建、海南、浙江和山東等省份都出現(xiàn)了海馬養(yǎng)殖的報(bào)道(呂軍儀 等, 2001; 鄧鋼 等, 2005; Lin et al, 2008, 2010; Li et al, 2015; Wang et al, 2016,2017), 養(yǎng)殖熱潮逐漸興起。

過去30 年, 盡管全世界水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)有了很大的提升, 但細(xì)菌性疾病的發(fā)生限制了集約化養(yǎng)殖的進(jìn)一步發(fā)展(Pérez-Sánchez et al, 2018)。海馬養(yǎng)殖業(yè)也面臨同樣的挑戰(zhàn)。養(yǎng)殖過程中, 尤其在越冬后和交配間隔期, 細(xì)菌感染誘發(fā)的腸炎是導(dǎo)致親本和幼齡海馬大量死亡的主要原因(Wang et al, 2016; Qin et al,2017, 2018), 嚴(yán)重影響海馬的交配效率及成活率,最終導(dǎo)致產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益下滑。因此, 細(xì)菌性腸炎病原的分離、鑒定, 發(fā)病機(jī)理的探索, 以及構(gòu)建相應(yīng)的防控體系, 成為提升海馬工廠化養(yǎng)殖效率的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

目前已報(bào)道的海馬細(xì)菌性病原超過20 種, 其中大部分能夠誘發(fā)海馬腸炎。上述病原多發(fā)現(xiàn)于水族養(yǎng)殖環(huán)境中, 發(fā)病機(jī)制尚不明確(Balcázar et al, 2010;Harikrishnan et al, 2010; LePage et al, 2012)。我國(guó)作為世界上最早嘗試海馬工廠化繁育且現(xiàn)有養(yǎng)殖量最大的國(guó)家, 近年來才剛開展細(xì)菌疾病研究, 尤其是細(xì)菌性腸炎的相關(guān)研究(Li et al, 2015; Qin et al,2018; Wang et al, 2016, 2020c; Shao et al, 2019)。目前只是對(duì)海馬工廠化養(yǎng)殖過程中的細(xì)菌病原種類和危害有了初步了解, 發(fā)病機(jī)制以及防治方法方面的研究仍然十分缺乏。我們前期從海馬腸道中分離出一種細(xì)菌性腸炎致病菌——遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tardaYT1), 并構(gòu)建了海馬細(xì)菌性腸炎的研究模型(Wang et al, 2020c), 為探究病原對(duì)海馬腸道菌群的影響提供了研究基礎(chǔ)。

本研究擬以國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖量最大的線紋海馬(Hippocampus erectus)為研究對(duì)象, 利用上述研究模型, 并結(jié)合16S rDNA 高通量測(cè)序技術(shù), 探討E.tardaYT1 侵染對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)、多樣性、豐度及功能的影響, 為海馬細(xì)菌性腸炎致病機(jī)制的深入探索提供理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

所有線紋海馬(H. erectus)取樣按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南的要求進(jìn)行操作。試驗(yàn)方案得到了魯東大學(xué)倫理研究委員會(huì)的批準(zhǔn)。五月齡健康線紋海馬(體重3.86±0.023g、體長(zhǎng)9.58±0.037cm) 購(gòu)自威海銀澤生物科技股份有限公司, 在魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院海洋生物養(yǎng)殖中心的智能海水養(yǎng)殖系統(tǒng)室中繼續(xù)飼養(yǎng),并以塑料植物作為附著基。養(yǎng)殖系統(tǒng)是具有機(jī)械和生物過濾、紫外線滅菌、蛋白分離和連續(xù)充氣功能的中央循環(huán)系統(tǒng)。養(yǎng)殖用水鹽度為31.5‰±0.5‰, 溫度為25.5±0.5℃, pH 為8.2±0.1。為避免交配對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響, 試驗(yàn)前將雌、雄海馬分開暫養(yǎng)2 周。每天投喂冰凍糠蝦3 次(08:00, 12:00 和16:00), 喂食后2h 吸出殘留的飼料和糞便。

1.2 病原人工感染

注射試驗(yàn)共使用20 只海馬, 將海馬分成4 組,每組包含5 只海馬。將活化后長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的E.tardaYT1 離心, 用魚類專用生理鹽水 PSS(physiological saline solution)稀釋重懸制成濃度為107個(gè)·mL-1的菌液備用。將100μL PSS (對(duì)照組: Con)和制備好的菌液(脅迫組: ET)分別注射到海馬的腹腔后, 將其放回養(yǎng)殖缸中, 關(guān)閉循環(huán)水系統(tǒng), 此后每天早上投餌2h 后將海馬轉(zhuǎn)入新養(yǎng)殖缸中飼養(yǎng), 重復(fù)上述操作直至第21 天取樣前。

1.3 樣本采集

取樣前一晚停止投餌, 取樣前時(shí)先用魚安定tricaine methanesulfonate (MS-222) (Sigma-Aldrich,Australia)麻醉處理海馬, 隨后用解剖刀和鑷子取出完整腸道并將其置于凍存管中, 迅速放入液氮中。取樣結(jié)束后, 將所有凍存管從液氮中取出, 立即放入提前準(zhǔn)備好的干冰中, 打包寄往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行后續(xù)測(cè)序。每組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均進(jìn)行5 次有效生物重復(fù)。

1.4 DNA 提取和測(cè)序

海馬腸道樣本在冰上做均質(zhì)處理, 使用十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyltrimethylammonium bromide, CTAB)法, 參考李煥宇等(2017)的具體步驟, 提取海馬腸道菌群基因組DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳分析總基因組DNA 的質(zhì)量和完整性, 并借助超微量分光/熒光光度計(jì)(DS-11FX/FX+, 美國(guó))鑒定DNA 質(zhì)量。使用338F (5′-ACTCCTACGGGAG GCAGCAG-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWT CTAAT-3′)引物擴(kuò)增所有樣品的16S rDNA 的V3 和V4 區(qū)。PCR 產(chǎn)物使用QuantiFluor?-ST 藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega 公司, 北京)進(jìn)行定量和純化, 之后按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求, 進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。PCR 產(chǎn)物混合物用凝膠提取試劑盒純化。根據(jù)操作說明, 使用 TruSeqTMDNA 樣品制備試劑盒(Illumina, USA)生成測(cè)序文庫(kù)。上機(jī)測(cè)序前, 需要先采用Agilent High Sensitivity DNA Kit 對(duì)文庫(kù)在Agilent Bioanalyzer 上進(jìn)行質(zhì)檢。然后采用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit 在Promega QuantiFluor熒光定量系統(tǒng)上對(duì)文庫(kù)定量。最后, 在 Illumina-HiSeq 平臺(tái)上對(duì)該文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序, 并產(chǎn)生250bp 的成對(duì)末端讀序。

1.5 生物信息學(xué)和統(tǒng)計(jì)分析

采用Illumina-HiSeq 平臺(tái)對(duì)群落DNA 片段進(jìn)行雙端(Paired-end)測(cè)序。所有讀序都根據(jù)其唯一的條形碼進(jìn)行排序。使用FLASH 軟件讀取合并重疊的雙端配對(duì)序列(Mago? et al, 2011)。使用QIIME 軟件包對(duì)序列分解和質(zhì)量篩選(Caporaso et al, 2010)。使用UCHIME 算法去除嵌合體序列(Edgar et al, 2011)。使用QIIME 軟件, 調(diào)用UCLUST 這一序列比對(duì)工具(Edgar, 2010), 對(duì)前述獲得的序列按97%的序列相似度進(jìn)行歸并和分類單元 OTU (operational taxonomic units)劃分, 去除豐度值低于全體樣本測(cè)序總量0.001%的OTU (Bokulich et al, 2013), 并將去除了稀有OTU 的序列作為該OTU 的代表序列進(jìn)行進(jìn)一步分析。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式呈現(xiàn), 并采用SPSS 23.0 進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)分析,p<0.05 被認(rèn)為是有顯著性差異,p<0.01 被認(rèn)為是有極顯著性差異。使用QIIME 軟件, 對(duì)OTU 豐度矩陣中每個(gè)樣本的序列總數(shù)在不同深度下隨機(jī)抽樣, 以每個(gè)深度下抽取到的序列數(shù)及其對(duì)應(yīng)的OTU 數(shù)繪制顯示物種豐富度的稀疏曲線。使用QIIME 軟件包對(duì)群落豐富度指數(shù)(ACE 和Chao)、多樣性指數(shù)(Shannon 和Simpson)和覆蓋率(Good’s coverage)的值進(jìn)行計(jì)算(Caporaso et al, 2010)?；赪eihted-UniFrac 距離矩陣計(jì)算的β多樣性指數(shù), 采用主坐標(biāo)分析法(PCoA)(Lozupone et al, 2006), 比較了健康海馬和脅迫組海馬的腸道菌群結(jié)構(gòu)。使用Pearson 相關(guān)分析以評(píng)估腸道菌群與功能預(yù)測(cè)之間的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 16S rDNA 測(cè)序概述及E. tarda YT1 侵染對(duì)海馬腸道菌群α 和β 多樣性的影響

從6 個(gè)測(cè)序樣品中總共得到的有效序列數(shù)目為399424 條, 每個(gè)樣品平均含有28918 條。其中有效堿基數(shù)有169130238bp, 每個(gè)樣品的序列平均長(zhǎng)度為423.44bp (表1)。這些序列以97%的相似性水平聚集到906 個(gè)OTUs , 分別屬于25 門、55 綱、148目、260 科、483 屬(圖1 a)。6 個(gè)樣品的OTUs 稀釋曲線在右側(cè)變平坦, 趨于飽和(圖1b)。

圖1 Edwardsiella tarda YT1 侵染前后海馬腸道菌群16S rDNA 測(cè)序分析a. OTU 統(tǒng)計(jì); b. 基于OTUs 繪制的稀釋曲線。Con 為PBS 注射對(duì)照組; ET 為E. tarda YT1 脅迫組Fig. 1 Basic analysis of 16S rDNA sequencing of intestinal microbiota during Edwardsiella tarda YT1 infection of Hippocampus erectus. (a) OTU statistics; (b) Rarefaction curves of OTUs of intestinal microbiota of sampled seahorses

表1 樣本信息統(tǒng)計(jì)表Tab. 1 Statistics of sequencing data from each sample

如圖2 所示, 對(duì)照組共鑒定出635 個(gè)OTU, 脅迫組鑒定出522 個(gè)OTU, 兩組共有的OTU 有251個(gè)。β多樣性分析發(fā)現(xiàn), 對(duì)照組與脅迫組海馬腸道菌群組成結(jié)構(gòu)區(qū)別明顯。α多樣性指數(shù)分析顯示, 兩組間Shannon 和Simpson 指數(shù)存在顯著差異(p<0.05),ACE 和Chao 兩個(gè)指數(shù)沒有顯著性差異(表2)。

表2 遲鈍愛德華氏菌的侵染對(duì)海馬腸道菌群α 多樣性的影響Tab. 2 Effects of Edwardsiella tarda YT1 infection on α diversity of intestinal microbiota of lined seahorses

圖2 Edwardsiella tarda YT1 侵染對(duì)海馬腸道菌群組成結(jié)構(gòu)的影響a. OUT 水平Venn 圖; b. 腸道菌群的PCoA 加權(quán)分析。Con 為PBS 注射對(duì)照組; ET 為E. tarda YT1 脅迫組Fig. 2 Effect of Edwardsiella tarda YT1 infection on composition and structure of intestinal microbiota of lined seahorse. (a)The diagram of Venn at OUT level; (b) PCoA of weighted UniFrac distance matrices of intestinal microbiota

2.2 E. tarda YT1 侵染對(duì)門和屬水平海馬腸道菌群組成和相對(duì)豐度的影響

如圖3 所示, 對(duì)照組和脅迫組腸道中共檢測(cè)到12個(gè)相對(duì)豐度>0.1%的門。對(duì)照組中變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)相對(duì)豐度均超過4%, 為優(yōu)勢(shì)菌門。脅迫組中變形菌門(Proteobacteria)相對(duì)豐度達(dá)到97%, 占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。與對(duì)照組相比, 脅迫組中變形菌門(Proteobacteria)顯著增多(p<0.05), 而放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)顯著減少(p<0.05)。

圖3 Edwardsiella tarda YT1 侵染對(duì)海馬腸道菌群(門水平)相對(duì)豐度的影響Con 為PBS 注射對(duì)照組; ET 為E. tarda YT1 脅迫組。*表示兩組有顯著性差異(p<0.05)Fig. 3 Effect of Edwardsiella tarda YT1 infection on relative abundance of intestinal microbiota (relative abundance > 0.1%) at phylum level of lined seahorse (* p <0.05)

通過屬水平腸道菌群的相對(duì)豐度對(duì)比發(fā)現(xiàn): 對(duì)照組和脅迫組中相對(duì)豐度超過1%的屬共有22 個(gè)(圖4); 對(duì)照組中相對(duì)豐度超過1%的屬有20 個(gè), 相對(duì)豐度由高到低依次為嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、羅氏菌屬(Rothia)、動(dòng)球菌屬(Planococcus)、青枯菌屬(Ralstonia)、谷氨酸桿菌屬(Glutamicibacter)、球菌屬(Macrococcus)、魯杰氏菌屬(Ruegeria)、微小桿菌屬(Exjguobacterium)、阿赫蘭氏菌屬(Ahrensia) 、 別樣玫瑰變色菌屬(Aliiroseovarius) 、 伯克氏菌屬(Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia) 、 不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、鼠尾菌屬(Muricauda)、鏈球菌屬(Streptococcus)、未分類-衣原體(unclassified-Chlamydiales)、未標(biāo)注-生絲微菌科(norank-Hyphomicrobiaceae)、葡萄球菌屬(Staphylococcus) 和未標(biāo)注- 根瘤菌(norank-Rhizobiaceae); 脅迫組中相對(duì)豐度超過1%的屬有9個(gè), 相對(duì)豐度由高到低依次為愛德華氏菌屬(Edwardsiella) 、 弧菌屬(Vibrio) 、 嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、谷氨酸桿菌屬(Glutamicibacter)、羅氏菌屬(Rothia)、魯杰氏菌屬(Ruegeria)、鼠尾菌屬(Muricauda)和未標(biāo)注-根瘤菌(norank-Rhizobiaceae)。

圖4 Edwardsiella tarda YT1 侵染對(duì)海馬腸道菌群(屬水平)相對(duì)豐度的影響內(nèi)、外圈分別顯示腸道菌群在屬水平的相對(duì)豐度與名稱。Con 為PBS 注射對(duì)照組; ET 為E. tarda YT1 脅迫組Fig. 4 Comparison of intestinal microbiota between healthy and diseased seahorses at genus level (relative abundance > 1%)by circular representation. The inner and outer circular diagrams show the relative abundance of intestinal microbiota at genus level and name, respectively

通過屬水平腸道菌群相對(duì)豐度的差異分析, 發(fā)現(xiàn)7 個(gè)相對(duì)豐度較高且病原侵染前后相對(duì)豐度差異明顯的菌屬有愛德華氏菌屬、嗜冷桿菌屬、動(dòng)球菌屬、谷氨酸桿菌屬、羅氏菌屬、青枯菌屬與動(dòng)球菌屬(圖5a)。定量分析顯示, 脅迫組中愛德華氏菌屬的相對(duì)豐度極顯著增多(p<0.01), 而冷桿菌屬與羅氏菌屬呈極顯著性降低(p<0.01), 動(dòng)球菌屬與球菌屬呈顯著性降低(p<0.05)(圖5b)。

圖5 Edwardsiella tarda YT1 侵染對(duì)腸道中優(yōu)勢(shì)菌群相對(duì)豐度的影響a. 基于線性判別分析效應(yīng)(LEfSe)繪制的海馬腸道微生物群落的物種群落結(jié)構(gòu)圖, 圖中字母指代菌屬見圖b。不同顏色節(jié)點(diǎn)表示在對(duì)應(yīng)組別中顯著富集, 且對(duì)組間差異存在顯著影響的微生物類群; 淡黃色節(jié)點(diǎn)表示在不同分組中均無顯著差異或?qū)M間差異無顯著影響的微生物類群。節(jié)點(diǎn)大小顯示了物種的豐度; b. 差異明顯的屬的定量分析。*表示p<0.05, **表示p<0.01。Con 為PBS 注射對(duì)照組;ET 為E. tarda YT1 脅迫組Fig. 5 Comparison of dominant intestinal microbiota between healthy and diseased seahorses. (a) Species community structure diagram of gut microbiomes of the seahorse by linear discriminant analysis effect size (LEfSe); (b) Quantitative analysis of genus (* p<0.05, ** p<0.01). The node’s size displays the abundance of the species

2.3 E. tarda YT1 侵染對(duì)海馬腸道菌群功能的影響

通過對(duì)比腸道菌群功能的差異發(fā)現(xiàn), 對(duì)照組與脅迫組間差異最顯著(p<0.05)的功能主要聚焦在細(xì)菌趨化性、鞭毛組裝、ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶系統(tǒng)、核糖體、RNA 降解與核苷酸剪切修復(fù)、脂肪酸生物合成和脂多糖生物合成等方面(圖6)。病原脅迫后, 細(xì)菌趨化性、鞭毛組裝、ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶系統(tǒng)和脂多糖生物合成途徑的活性顯著上調(diào)(p<0.05), 而核糖體、RNA 降解、核苷酸剪切修復(fù)和脂肪酸生物合成途徑的活性顯著降低(p<0.05)。

圖6 Edwardsiella tarda YT1 侵染對(duì)海馬腸道菌群功能的影響Con 為PBS 注射對(duì)照組; ET 為E. tarda YT1 脅迫組Fig. 6 Functional differences of intestinal microbiota during Edwardsiella tarda YT1-induced enteritis in lined seahorses

通過對(duì)比海馬腸道菌群的相對(duì)豐度與功能相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn), 病原菌和正常腸道優(yōu)勢(shì)菌群相對(duì)豐度的改變與腸道菌群功能活性的變化存在顯著相關(guān)性(圖7)。愛德華氏菌屬的相對(duì)豐度與細(xì)菌趨化、鞭毛組裝、ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶系統(tǒng)和脂多糖生物合成途徑的活性顯著正相關(guān)(p<0.05), 而與脂肪酸生物合成、核苷酸剪切修復(fù)、RNA 降解和核糖體的活性顯著負(fù)相關(guān)(p<0.05); 動(dòng)球菌屬和谷氨酸桿菌屬的相對(duì)豐度與核糖體、核苷酸剪切修復(fù)、RNA 降解和脂肪酸生物合成途徑的活性顯著正相關(guān)(p<0.05),與細(xì)菌趨化、鞭毛組裝途徑的活性極顯著負(fù)相關(guān)(p<0.001); 嗜冷桿菌屬的相對(duì)豐度與脂肪酸生物合成、核苷酸剪切修復(fù)途徑的活性顯著正相關(guān)(p<0.05),與脂多糖生物合成、ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶系統(tǒng)的活性極顯著負(fù)相關(guān)(p<0.001); 羅氏菌屬與ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性顯著負(fù)相關(guān)(p<0.05); 青枯菌屬的相對(duì)豐度與脂多糖生物合成、磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶系統(tǒng)、細(xì)菌趨化和鞭毛組裝途徑的活性顯著負(fù)相關(guān)(p<0.05); 球菌屬的相對(duì)豐度與脂多糖生物合成、磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶系統(tǒng)途徑的活性存在顯著負(fù)相關(guān)(p<0.05)。

圖7 病原侵染過程中海馬腸道優(yōu)勢(shì)菌屬與功能的相關(guān)性分析紅色代表優(yōu)勢(shì)菌屬與功能呈正相關(guān), 藍(lán)色代表負(fù)相關(guān)。*表示p<0.05, **表示p<0.01, ***表示p<0.001。圖上方的聚類分析表示腸道優(yōu)勢(shì)菌屬共分為兩大支, 其中Edwardsiella 為一支, 其他優(yōu)勢(shì)屬為一支Fig. 7 Correlation between relative abundance of dominant genera and functions of intestinal microbiota during Edwardsiella tarda YT1-induced enteritis in lined seahorses (* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001)

3 討論與結(jié)論

腸道菌群結(jié)構(gòu)對(duì)于宿主抵抗外源生物的侵染至關(guān)重要(Lozupone et al, 2012; Nowarski et al, 2017; Zhou et al, 2020)。魚的胃腸道中定居著超過10 億種以細(xì)菌為主的微生物, 與魚類建立相互作用、相互影響的關(guān)系(Robertson et al, 2018)。當(dāng)宿主與腸道菌群之間的動(dòng)態(tài)平衡遭到破壞, 則會(huì)導(dǎo)致或促進(jìn)疾病的發(fā)生(Hayakawa et al, 2016; Tran et al, 2018; Xiong et al,2019)。本研究中,E. tardaYT1 侵染能降低線紋海馬腸道菌群OTU 水平的多樣性, 并改變其組成結(jié)構(gòu)(圖2和表 2), 這與病原感染誘發(fā)大海馬(Hippocampus kuda)、斑馬魚(Danio rerio)、草魚(Ctenopharyngodon idellus)和圓口銅魚(Coreius guichenoti)中細(xì)菌性腸炎的研究結(jié)果一致(Li et al, 2016; Yang et al, 2017; Tran et al, 2018; Wang et al, 2020b), 表明細(xì)菌病原侵染可以通過降低魚類腸道菌群的多樣性和改變其組成結(jié)構(gòu),從而打破腸道菌群的平衡。

變形菌門是魚類中最豐富的細(xì)菌門, 其相對(duì)豐度的增加與腸道炎癥和宿主免疫監(jiān)管有關(guān)(Roeselers et al, 2011; Shin et al, 2015; Yang et al,2017; Tyagi et al, 2019)。厚壁菌門可以調(diào)節(jié)魚類的免疫反應(yīng)(Zhang et al, 2015)。擬桿菌門與碳水化合物代謝有關(guān)(Xu et al, 2003; Kamada et al, 2012)。而放線菌門是腸道菌群中最普遍的成員(Wu et al,2012a)。本研究中,E. tardaYT1 的侵染顯著增加變形菌門相對(duì)豐度(p<0.01)的同時(shí), 能顯著減少放線菌門、厚壁菌門和擬桿菌門海馬腸道固有菌群的相對(duì)豐度(p<0.05)(圖3)。這與草魚、銅魚和斑馬魚患細(xì)菌性腸炎后門水平菌群豐度變化的結(jié)果一致(Li et al, 2016; Yang et al, 2017; Tran et al, 2018)。上述細(xì)菌病原同屬變形菌門, 這可能是導(dǎo)致變形菌門相對(duì)豐度增加的主要原因。另有研究發(fā)現(xiàn), 無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)感染斑馬魚顯著增加腸道梭桿菌門相對(duì)豐度的同時(shí), 明顯減少了變形菌門、厚壁菌門和放線菌門的相對(duì)豐度(Zhang et al,2019)。上述結(jié)果提示, 病原侵染誘發(fā)魚類細(xì)菌性腸炎過程中, 致病菌相對(duì)豐度的增加可以抑制腸道內(nèi)固有菌群的豐度, 打破菌群的動(dòng)態(tài)平衡。

腸道核心菌群的豐度和功能對(duì)于維持魚類內(nèi)穩(wěn)態(tài)和健康具有重要意義(Frank et al, 2007; Clemente et al, 2012)。目前已報(bào)道的魚類腸道固有菌屬有嗜冷桿菌屬、芽孢桿菌屬(Bacillus)、動(dòng)球菌屬、谷氨酸桿菌屬、不勞蒂亞屬(B l a u t i a)和乳球菌屬(Lactococcus)(Wu et al, 2012b; Liu et al, 2020; Wang et al, 2020b)。嗜冷桿菌屬作為一種潛在的水產(chǎn)養(yǎng)殖益生菌, 可以提高魚類的生長(zhǎng)性能與消化酶活性,上調(diào)免疫相關(guān)基因的表達(dá), 對(duì)抗細(xì)菌原體侵染(Caipang et al, 2010; Yang et al, 2011; Makled et al,2017); 動(dòng)球菌屬和谷氨酸桿菌屬與代謝途徑密切相關(guān)(Buschke et al, 2011), 其中動(dòng)球菌屬參與脂類合成途徑, 該途徑衍生的牛血清蛋白具有抗菌、免疫調(diào)節(jié)作用(Waghmode et al, 2020), 產(chǎn)生的生物表面活性劑可以抑制致病生物(Manikandan et al, 2017);谷氨酸桿菌屬可以促進(jìn)纖維素、半纖維素的消化,有助于提高宿主的消化和吸收功能(Wang et al,2020a)。本研究發(fā)現(xiàn),E. tardaYT1 侵染顯著增加愛德華氏菌屬相對(duì)豐度的同時(shí)(p<0.01), 明顯降低了海馬腸道固有菌群中嗜冷桿菌屬、動(dòng)球菌屬、谷氨酸桿菌屬、羅氏菌屬、青枯菌屬與球菌屬的相對(duì)豐度(圖5), 提示上述菌屬的豐度和功能可能對(duì)于維持海馬腸道的內(nèi)穩(wěn)態(tài)具有重要作用。另有研究表明病原侵染大海馬、斑馬魚以及珍珠龍膽石斑魚腸道后,明顯減少了嗜冷桿菌屬、動(dòng)球菌屬、不勞蒂亞屬、谷氨酸桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)和發(fā)光桿菌屬(Photobacterium)等腸道固有菌群的相對(duì)豐度(Li et al, 2016; Yang et al, 2017; Deng et al, 2020)。由上可知, 致病菌可能通過減少魚類腸道固有菌群的豐度, 改變其結(jié)構(gòu)與功能, 誘導(dǎo)菌群和功能失調(diào),促進(jìn)疾病發(fā)生(Xiong et al, 2015; Li et al, 2019; Liu et al, 2020)。

研究表明, 脂多糖生物合成與病原菌毒力相關(guān)因子有關(guān)(Yu et al, 2016); 細(xì)菌趨化性在動(dòng)物-細(xì)菌間的相互作用和病原感染的各個(gè)階段都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用(Hammer et al, 2003; Williams et al,2007; Erhardt, 2016; Matilla et al, 2018)。ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與營(yíng)養(yǎng)、維生素和代謝物的吸收有關(guān)(Petryszyn et al, 2018); 磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶系統(tǒng)在調(diào)控運(yùn)輸、代謝和基因表達(dá)方面具有重要作用(Miyata et al, 2013;Rivera-Pérez et al, 2019), 在病原菌侵染過程中參與刺激生物膜的形成、聚集運(yùn)動(dòng)和誘導(dǎo)細(xì)菌的定植(Gao et al, 2019)。本研究中,E. tardaYT1 侵染后細(xì)菌趨化性、鞭毛組裝、ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶系統(tǒng)和脂多糖生物合成功能活性顯著上調(diào), 而且上述功能活性與條件致病菌愛德華氏菌屬的豐度呈顯著正相關(guān)(p<0.05)(圖4～圖6), 這表明E. tardaYT1可能通過趨化作用、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)和毒力效應(yīng)與腸道固有菌群競(jìng)爭(zhēng), 致使腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能的內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡, 促進(jìn)疾病發(fā)生。腸道固有菌群能通過執(zhí)行不同的功能抵御病原的侵染(Purchiaroni et al,2013)。核糖體參與免疫信號(hào)過程, 具有抗炎作用(Zhou et al, 2015); RNA 降解與疾病的監(jiān)測(cè)密切相關(guān)(Sohrabi-Jahromi et al, 2019); 脂肪酸生物合成為各種代謝提供能量, 在病原體防御中起重要作用(Lim et al, 2017)。本研究中,E. tardaYT1 侵染后海馬腸道固有菌群中發(fā)揮核心作用的嗜冷桿菌屬、動(dòng)球菌屬和谷氨酸桿菌屬的豐度與核糖體、RNA 降解、核苷酸剪切修復(fù)和脂肪酸生物合成功能活性顯著正相關(guān)(p<0.05), 且均在病原侵染后明顯下調(diào), 提示上述核心菌群在海馬腸道病原的監(jiān)測(cè)和防御中發(fā)揮著重要的功能。本研究結(jié)果提示,E. tardaYT1 侵染可能通過自身的趨化作用、毒力效應(yīng)和營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)等手段降低海馬腸道菌群多樣性, 改變腸道菌群的組成結(jié)構(gòu), 抑制海馬腸道核心菌群的相對(duì)豐度和功能, 并誘發(fā)腸炎。綜合分析、考量魚類中已有的報(bào)道、海馬自身特征, 以及安全和可持續(xù)發(fā)展等因素, 益生菌(probiotics)、益生元(prebiotics)、天然抗菌化合物(natural antimicrobial compounds)、細(xì)菌的群體感應(yīng)(quorum sensing)和遺傳育種(genetic breeding)等制劑和技術(shù)在海馬工廠化養(yǎng)殖過程中細(xì)菌性疾病,尤其是細(xì)菌性腸炎防控中的應(yīng)用潛力巨大。

綜上所述, 本研究探討了E. tardaYT1 感染對(duì)線紋海馬腸道菌群的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 與其他魚類相似,E. tardaYT1 感染海馬后可以從不同的水平改變腸道菌群的多樣性、結(jié)構(gòu)組成和豐度。究其原因,E. tardaYT1 可能一方面通過其豐度的增加, 另一方面通過其毒力、趨化和營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)作用的發(fā)揮, 誘導(dǎo)海馬腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能的失調(diào), 進(jìn)而誘發(fā)腸炎。