羅 靜，董 玲，趙 馳，劉鈺穎，郭云建，李 露，李艷琳，陳 旺，楊國華，楊 永，李治華,*，朱永清,*

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，四川 成都 610066；2.郫都區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村和林業(yè)局，四川 成都 611730；3.成都鑫鴻望食品有限公司，四川 成都 611730；4.四川省丹丹郫縣豆瓣集團(tuán)股份有限公司，四川 成都 611730）

郫縣豆瓣醬因產(chǎn)于四川成都郫縣而得名，至今已有300多年的歷史，是四川乃至全國重要的一種傳統(tǒng)發(fā)酵食品，被譽(yù)為“川菜之魂”[1-2]。其制作工藝主要包括制辣椒、制瓣和后熟發(fā)酵3 個階段，由蠶豆（Vicia fabaL.）（四川又稱胡豆）、辣椒（Capsicum annuumL.）、面粉和食鹽按一定比例經(jīng)較長時間自然發(fā)酵而成[3]。

細(xì)菌對郫縣豆瓣獨特風(fēng)味品質(zhì)的形成起重要作用[4-6]。研究表明，郫縣豆瓣醬發(fā)酵過程主要細(xì)菌有芽孢桿菌、乳酸菌、葡萄球菌等，芽孢桿菌是郫縣豆瓣發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌群之一，對郫縣豆瓣醬的品質(zhì)風(fēng)味起關(guān)鍵作用[7]。有學(xué)者對芽孢桿菌影響大醬品質(zhì)進(jìn)行了深入研究，有利于韓國大醬過程化控制和品牌提升[8-10]。然而，作為類似產(chǎn)品，目前還鮮有研究郫縣豆瓣醬中芽孢桿菌尤其是耐鹽芽孢桿菌系統(tǒng)進(jìn)化和特性的報道。

近年來，發(fā)酵食品中存在的抗生素基因引起了全球廣泛關(guān)注，其中存在的抗生素基因和耐藥基因可能被人體通過食物攝入體內(nèi)，產(chǎn)生耐藥性，影響人體健康[11-12]。芽孢桿菌作為郫縣豆瓣發(fā)酵過程優(yōu)勢菌群之一，對其抗生素耐藥性分析能為郫縣豆瓣發(fā)酵菌株的選擇以及相應(yīng)風(fēng)險評估提供科學(xué)指導(dǎo)。

本研究結(jié)合宏基因組和純培養(yǎng)方法，對郫縣豆瓣醬中已分離到的芽孢桿菌進(jìn)行進(jìn)化關(guān)系研究，并對代表性菌株進(jìn)行產(chǎn)酶能力和抗生素特性分析，以期加深對郫縣豆瓣醬乃至傳統(tǒng)高鹽發(fā)酵食品中芽孢桿菌多樣性的認(rèn)識，同時為豆瓣醬中芽孢桿菌的評價和后續(xù)利用提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

郫縣豆瓣醬為郫都區(qū)豆瓣生產(chǎn)廠商制作；土壤微生物提取試劑盒、細(xì)菌DNA基因提取試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

平板計數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）培養(yǎng)基：胰蛋白胨5 g/L、酵母浸粉2.5 g/L、葡萄糖1 g/L、瓊脂15 g/L；平板計數(shù)肉湯（plate count broth，PCB）培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、葡萄糖2 g/L；MH（Mueller-Hinton）瓊脂：牛肉粉6 g/L、可溶性淀粉1.5 g/L、酸水解酪蛋白17.5 g/L、瓊脂17 g/L；淀粉培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化鈉5 g/L、可溶性淀粉2 g/L、瓊脂15 g/L；脫脂牛奶培養(yǎng)基：脫脂奶粉15 g/L、瓊脂15 g/L、牛肉膏5 g/L、蛋白胨10 g/L。

1.1.3 藥敏紙片

藥敏紙片均購買于杭州微生物試劑有限公司。分別為：氨芐西林（10 μg/片）、卡那霉素（30 μg/片）、氯霉素（30 μg/片）、四環(huán)素（30 μg/片）、紅霉素（15 μg/片）、復(fù)方新諾明（（23.75 μg SMZ＋1.25 μg TMP）/片）、吉他霉素（15 μg/片）、苯唑西林（1 μg/片）、克林霉素（2 μg/片）、鏈霉素（10 μg/片）、青霉素（10 μg/片）、新霉素（30 μg/片）。

1.2 儀器與設(shè)備

GI100DS高壓滅菌鍋 美國Zealway公司；DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；5804R高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀美國Bio-Rad公司；超低溫冰箱、生物安全柜 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 郫縣豆瓣醬宏基因組DNA提取、測序及微生物物種分類分析

郫縣豆瓣醬宏基因組DNA提取使用生工生物工程（上海）股份有限公司的土壤微生物提取試劑盒提取完成，操作步驟參考說明書，提取完成后使用1%瓊脂糖凝膠電泳確定DNA的完整性。郫縣豆瓣醬宏基因組DNA的文庫構(gòu)建與測序由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。宏基因組物種分類采用Kraken2軟件進(jìn)行[13]，數(shù)據(jù)庫采用MiniKraken2_v2_8GB_201904（http://ccb.jhu.edu/software/kraken2/index.shtml?t=downloads）。Kraken2是一個基于k-mer算法的高精度序列分類軟件，序列中的每個k-mer被映射到數(shù)據(jù)庫中包含該k-mer基因組的最低共同祖先（lowest common ancestor，LCA），使用k-mers的精確比對，Kraken2能夠快速準(zhǔn)確地將測序reads進(jìn)行物種分類。分類結(jié)果和豐度計算采用bracken進(jìn)行。

1.3.2 菌株分離與純化

參照Barus等[14]的方法并略作修改，具體如下：稱取5 g豆瓣醬樣品，加入25 mL無菌生理鹽水混勻制成樣液，將樣液用生理鹽水10 倍梯度稀釋，分別取10－2、10－3、10－4、10－5四個梯度的稀釋液50 μL均勻涂布在PCA瓊脂培養(yǎng)基上，將涂布好的培養(yǎng)基置于恒溫培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取不同形態(tài)單菌落接種在PCB液體培養(yǎng)基中增菌24 h，用接種環(huán)蘸取菌液劃線接種在PCA固體培養(yǎng)基上，連續(xù)3 次分離純化，挑取單個菌落于PCB培養(yǎng)基中增菌培養(yǎng)，在PCB培養(yǎng)基（含25%甘油）中保存于－80 ℃。

1.3.3 菌株16S rDNA測序鑒定

1.3.3.1 菌株DNA提取

使用生工生物工程（上海）股份有限公司的細(xì)菌提取試劑盒。

1.3.3.2 菌株基因序列的PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增體系：正向序列引物27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；反向序列引物1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT；PCR體系共為50 μL，其中2×TaqPCR MasterMix 25 μL、水19 μL、DNA模板2 μL、引物27F與引物1492R各2 μL。

PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸60 s；30 個循環(huán)；72 ℃末端延伸5 min。擴(kuò)增結(jié)束后，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分析結(jié)果。

1.3.3.3 測序及進(jìn)化樹構(gòu)建

將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行雙端測序分析，得到的序列采用BioEdit拼接獲得16S rDNA全長序列，在EZBioCloud（https://www.ezbiocloud.net/）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，比對結(jié)果未分類部分在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上重新比對分析，結(jié)果為芽孢桿菌的菌株構(gòu)建進(jìn)化樹，首先采用Clustal X 2.0對拼接后的全長序列進(jìn)行比對，得到*.aln格式的文件，并采用MEGA 6，分析相似性與親緣關(guān)系[15]。

1.3.4 代表性菌株產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶分析

分別在PCA瓊脂培養(yǎng)基中加入0%、5%、10%的NaCl，將1.3.2節(jié)鑒定為芽孢桿菌到的菌株活化后取50 μL涂布到PCA培養(yǎng)基中，隨后用接種環(huán)挑取單菌落分別接種到上述含NaCl培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，記錄菌株生長情況，將生長良好的芽孢桿菌繼續(xù)進(jìn)行產(chǎn)酶能力研究。

產(chǎn)蛋白酶菌株篩選實驗參照Barus等[14]的方法，挑選29 株代表菌株用接種環(huán)取單菌落分別接種到NaCl含量為0%、5%和10%的脫脂牛奶培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，分別測定菌株的菌落直徑與透明圈直徑，依據(jù)菌落與透明圈直徑比值判斷菌株在不同鹽分中的產(chǎn)蛋白酶能力。

產(chǎn)淀粉酶菌株篩選實驗參照Tallapragada等[16]的方法，分別在含0%、5%和10% NaCl的淀粉培養(yǎng)基上用接種環(huán)接種29 株代表菌株，37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，采用盧戈氏碘液染色產(chǎn)生透明圈，測量菌株的菌落直徑與透明圈直徑并計算比值（D/d），以此判斷在不同NaCl含量下菌株的產(chǎn)淀粉酶能力。

1.3.5 代表性菌株抗生素耐藥性評價

抗生素耐藥實驗根據(jù)美國臨床和實驗標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦的K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行操作。挑取單個菌落于生理鹽水中，制成麥?zhǔn)蠞岫葹?.5的菌懸液，取50 μL菌懸液用滅菌徹底的涂布棒均勻涂布于MH瓊脂培養(yǎng)基平板表面，將抗生素紙片貼在涂布有菌液的MH瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h后測定抑菌圈直徑。實驗結(jié)果按照WS/T 639—2018《抗菌藥物敏感性試驗的技術(shù)要求》要求判定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用Excel軟件處理，圖形繪制采用Origin軟件，MEGA 6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 郫縣豆瓣醬中芽孢桿菌相對豐度

采用宏基因組測序分析郫縣豆瓣醬中微生物物種分類情況，其中芽孢桿菌分類結(jié)果如表1所示。宏基因組測序共鑒定出24 種芽孢桿菌，其中蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）占到細(xì)菌總數(shù)的51.36%，占芽孢桿菌總數(shù)的97.75%。根據(jù)宏基因組物種分類結(jié)果，對郫縣豆瓣醬中的芽孢桿菌進(jìn)行分離鑒定并開展后續(xù)研究，以期為郫縣豆瓣醬中芽孢桿菌的認(rèn)識提供基礎(chǔ)。

表1 郫縣豆瓣醬中芽孢桿菌相對豐度Table 1 Relative abundance of Bacillus in Pixian broad bean paste %

2.2 郫縣豆瓣醬中芽孢桿菌鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

圖1 郫縣豆瓣醬中芽孢桿菌的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Phylogenetic tree of Bacillus in Pixian broad bean paste

依據(jù)在EZBioCloud（https://www.ezbiocloud.net/）數(shù)據(jù)庫的比對結(jié)果，有66 株為芽孢桿菌，分別屬于14 個種（其中1 株unclassified），結(jié)果如表2所示。為更明確顯示所分離菌株的分類學(xué)地位和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，對66 株芽孢桿菌使用MEGA 6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，使用最大似然法統(tǒng)計分類，可聚為3 類，第1類主要為B. australimaris、B. safensis、B. pumilus、B. altitudinis、B. cereus、B. horneckiae、B. aryabhattai，第2類主要為B. velezensis、B. subtilis，第3類主要為B. licheniformis、B. paralicheniformis、B. haynesii、B. oryzaecorticis，結(jié)果見圖1?？梢钥闯鲔h豆瓣醬中的芽孢桿菌具有豐富的多樣性。結(jié)合表型性狀，從中選擇29 株作為代表菌株進(jìn)行產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶以及抗生素耐藥實驗。

表2 芽孢桿菌16S rDNA序列鑒定結(jié)果Table 2 Identification of Bacillus by 16S rDNA sequencing

2.3 產(chǎn)蛋白酶能力評價

圖2 不同NaCl含量培養(yǎng)基中芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶（a）和淀粉酶（b）菌株占比Fig. 2 Percentages of protease-producing (a) and amylase-producing (b)strains of Bacillus in media with different salt contents

如圖2a所示，29 株受試菌株在0% NaCl培養(yǎng)基上共有21 株菌能產(chǎn)蛋白酶，占72%，然而，5% NaCl脫脂牛奶培養(yǎng)基上僅有6 株菌能產(chǎn)蛋白酶，占21%，10% NaCl脫脂牛奶培養(yǎng)基上僅有5 株菌能產(chǎn)蛋白酶，占17%，其中CR27（B. cereus）、LY13、LY3（B. velezensis）、CR29、CR31（B. licheniformis）在0%～10% NaCl中均能夠產(chǎn)生蛋白酶，具體為CR27在0%～10% NaCl中D/d范圍為1.92～1.13，LY13為2.44～1.25，LY3為1.58～1.20，CR29為1.60～1.25，CR31為1.67～1.15（表3），隨著NaCl含量的增加，芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶能力逐漸降低，表明NaCl能夠抑制芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶能力。

表3 0%～10% NaCl條件下芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶能力（以D/d值表示）Table 3 D/d value for protease-producing ability of Bacillus at different salt contents

2.4 產(chǎn)淀粉酶能力評價

29 株典型芽孢桿菌在不同NaCl含量培養(yǎng)基中產(chǎn)淀粉酶菌株占比不一，結(jié)果如圖2b所示。13 株在0% NaCl條件下能產(chǎn)淀粉酶，9 株在5% NaCl環(huán)境能產(chǎn)淀粉酶，僅有5 株能在10% NaCl含量培養(yǎng)基中產(chǎn)淀粉酶。同時，在0%～10% NaCl條件下耐鹽菌株LY3、LY13（B. velezensis）、WB48（B. subtilis）、CR29、CR31（B. licheniformis）均能夠產(chǎn)生淀粉酶，具體為LY13在0%～10% NaCl中D/d范圍為3.00～1.67，WB48為1.37～1.19，LY3為3.60～1.67，CR29為1.67～1.20，CR31為2.33～1.33（表4）。說明NaCl能夠抑制芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶能力，且NaCl含量越高，抑制作用越強(qiáng)。

表4 0%～10% NaCl條件下芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶能力（以D/d值表示）Table 4 D/d value for amylase-producing ability of Bacillus at different salt contents

2.5 芽孢桿菌抗生素耐藥性實驗

采用K-B紙片擴(kuò)散法對29 株受試菌株進(jìn)行抗生素耐藥性檢測，氨芐西林、卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、紅霉素、復(fù)方新諾明、吉他霉素、苯唑西林、克林霉素、鏈霉素、青霉素、新霉素共12 種抗生素的耐藥性，檢測結(jié)果見表5。

從郫縣豆瓣中分離得到的芽孢桿菌對氨芐西林（19/29）、卡那霉素（2/29）、四環(huán)素（3/29）、氯霉素（3/29）、紅霉素（11/29）、復(fù)方新諾明（2/29）、吉他霉素（1/29）、苯唑西林（11/29）、克林霉素（18/29）、鏈霉素（2/29）、青霉素（18/29）均表現(xiàn)不同程度的耐藥，對新霉素（0/29）全部表現(xiàn)出敏感。29 株芽孢桿菌的耐藥情況為氨芐西林＞青霉素＞克林霉素＞苯唑西林＞紅霉素＞四環(huán)素＞氯霉素＞鏈霉素=復(fù)方新諾明=卡那霉素＞吉他霉素＞新霉素。

大多數(shù)芽孢桿菌表現(xiàn)出多重抗生素耐藥性，結(jié)果如表6所示。不同芽孢桿菌對抗生素的耐受情況不一，大多對氨芐西林（66%）、青霉素（62%）和克林霉素（62%）耐受。WB91（B. haynesii）、CR27（B. cereus）、WB104（B. paralicheniformis）、WB1（B. aryabhattai）具有較強(qiáng)的抗生素耐藥性，LJ34（unclassified）、LJ1（B. australimaris）對12 種抗生素均敏感。

表5 芽孢桿菌抗生素耐藥性實驗結(jié)果Table 5 Analysis of Bacillus antibiotic resistance

表6 芽孢桿菌多重抗生素耐藥性Table 6 Multiple antibiotic resistance of Bacillus

3 討 論

郫縣豆瓣醬是在開放的環(huán)境中自然發(fā)酵而形成的具有獨特風(fēng)味品質(zhì)的發(fā)酵食品，其獨特風(fēng)味主要是在后熟階段形成[17-18]。芽孢桿菌是郫縣豆瓣發(fā)酵階段的優(yōu)勢菌群之一[19-21]，在改善食品風(fēng)味和提高品質(zhì)方面有一定積極作用[22]。董丹等[5]從發(fā)酵2 個月的豆瓣中分離得到的芽孢桿菌屬占到總分離菌株數(shù)量的49%；Li Zhihua等[23]通過PCR和變性梯度凝膠電泳相結(jié)合的方法和高通量測序在不同品牌郫縣豆瓣中均發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌。但是目前郫縣豆瓣醬中菌株水平的分類還鮮見詳細(xì)報道。本實驗采用宏基因組測序分析郫縣豆瓣醬中微生物，共鑒定到24 種芽孢桿菌，而采用純培養(yǎng)分離方法結(jié)合16S rDNA全長基因?qū)h豆瓣醬中芽孢桿菌進(jìn)行鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析，共分離到66 株芽孢桿菌，分屬于13 個種，代表性菌株構(gòu)建的分子進(jìn)化樹表明郫縣豆瓣醬中分離到的芽孢桿菌主要分為3 大類，豐富了對郫縣豆瓣醬中芽孢桿菌的認(rèn)識。

前人研究表明，芽孢桿菌具有的產(chǎn)酶能力，是郫縣豆瓣風(fēng)味和呈色的重要來源[24-25]。已有文獻(xiàn)報道郫縣豆瓣中多種芽孢桿菌具有產(chǎn)生淀粉酶與蛋白酶能力，如B. subtilis、B. licheniformis、B. safensis、B. cereus等[5]。除豆瓣醬外，多種發(fā)酵食品中芽孢桿菌也具有相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)酶能力，如納豆中芽孢桿菌蛋白酶活性很高，因此芽孢桿菌被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品品質(zhì)的提升[26-27]。本研究發(fā)現(xiàn)，B. licheniformis（CR29、CR31）與B. velezensis（LY3、LY13）在10% NaCl條件仍能同時產(chǎn)生兩種酶，而B. cereus（CR27）僅產(chǎn)生蛋白酶，B. subtilis（WB48）僅產(chǎn)生淀粉酶。另外，研究發(fā)現(xiàn)隨著NaCl含量增加，芽孢桿菌產(chǎn)酶能力逐漸下降，NaCl含量不斷增加對酶類的產(chǎn)生有抑制作用，這與醬油曲霉的研究結(jié)果類似，低含量NaCl對蛋白酶有激活作用，而高含量NaCl對蛋白酶起抑制作用[28]。因此，在保證食用安全和風(fēng)味的前提下，適當(dāng)降低郫縣豆瓣后熟NaCl含量，將有利于發(fā)揮芽孢桿菌的產(chǎn)酶能力，促進(jìn)微生物產(chǎn)酶代謝活動，從而有可能縮短發(fā)酵周期。

抗生素導(dǎo)致的食品安全問題已經(jīng)引起全球廣泛關(guān)注，耐藥性菌株有可能通過腸道傳遞耐藥基因，從而影響人體健康[29]。Jeong等[11]對韓國發(fā)酵大豆食品中分離到的38 株B. licheniformis進(jìn)行檢測，63%菌株對氯霉素耐藥，100%的菌株對克林霉素和鏈霉素耐藥，50%對紅霉素耐藥，66%對卡那霉素耐藥，而本實驗郫縣豆瓣中B. licheniformis僅對上述抗生素中克林霉素100%耐藥，20%對紅霉素耐藥，表明郫縣豆瓣中的B. licheniformis對抗生素更敏感，差異可能跟原料和發(fā)酵環(huán)境有關(guān)。董丹等[30]從郫縣豆瓣中分離出B. cereus，對鏈霉素、青霉素G、卡那霉素、四環(huán)素、克林霉素、紅霉素、氯霉素等出現(xiàn)耐藥，而對氨芐西林等敏感，同樣地，李研東[31]研究表明蠟樣芽孢桿菌對卡那霉素、四環(huán)素、青霉素等藥物耐受。而本實驗中B. cereus對氨芐西林、紅霉素、復(fù)方新諾明、苯唑西林、克林霉素、青霉素均耐藥，原因可能是生產(chǎn)車間環(huán)境和發(fā)酵工藝存在差異。本研究29 株芽孢桿菌對不同抗生素耐藥性表現(xiàn)不一，對氨芐西林和青霉素耐藥率最高，對新霉素敏感，分析芽孢桿菌的抗生素耐藥性為郫縣豆瓣醬的風(fēng)險評估提供理論基礎(chǔ)。