姚延祿,曹寧,周新麗

(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院,上海,200093)

食品安全引起的疾病影響人類健康和生命,會(huì)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[1]。其中最為常見的食源性致病菌為大腸桿菌、單增李斯特氏菌和沙門氏菌。根據(jù)《世界衛(wèi)生報(bào)告》,全世界每年約有1/10的人因食物污染而生病,每年約有180萬人因食源性疾病而死亡[2]。目前已有多種食源性致病菌的檢測(cè)方法,廣泛應(yīng)用的有傳統(tǒng)菌落分離的培養(yǎng)方法、免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)法等。其中,分子生物學(xué)檢測(cè)方法中的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop mediated isothermal amplification,LAMP)技術(shù)僅需要一個(gè)恒溫平臺(tái),便能將樣品進(jìn)行高效、快速的核酸擴(kuò)增反應(yīng),達(dá)到檢測(cè)數(shù)量[3],具有檢測(cè)時(shí)間短、靈敏性高和檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)。但由于預(yù)處理時(shí)間長(zhǎng),需要專業(yè)的檢測(cè)人員操作,不易在現(xiàn)場(chǎng)及基層推廣。

微流控技術(shù)是將傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室的基本功能整合到僅有幾平方厘米的芯片上,僅通過pL或μL體積的微量流體,便能實(shí)現(xiàn)生化分析的各個(gè)步驟。此方法具有微型化、集成化、高通量、自動(dòng)化的優(yōu)勢(shì),為實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、低成本的生化分析提供了經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便的檢測(cè)技術(shù)途徑。目前微流控檢測(cè)芯片已廣泛應(yīng)用于血液檢測(cè)[4]、藥物篩選[5]、核酸分析[6]、水質(zhì)分析[7]及食品檢測(cè)[8]等方面。

LAMP與微流控技術(shù)相結(jié)合,使病原菌檢測(cè)更加快速、便捷。DOU等[9]使用聚二甲基硅氧烷與紙基結(jié)合的微型設(shè)備在LAMP反應(yīng)后,使用便攜式紫外線筆燈照射LAMP產(chǎn)物,可快速檢測(cè)腦膜炎奈瑟氏球菌。此設(shè)備雖然成本較低,但是并不能實(shí)現(xiàn)高通量以及多樣本的檢測(cè),而且在檢測(cè)一些需要繁瑣的DNA分離和純化程序時(shí),就顯得尤為不足。LUO等[10]研發(fā)出的一種微流控多重電化學(xué)LAMP芯片,檢測(cè)精度高,但是分析末端電信號(hào)的電化學(xué)檢測(cè)器價(jià)格貴,且不具備高通量樣品檢測(cè)的能力。LIU等[11]研發(fā)出具有完全集成化的LAMP分析高通量液滴微流體系統(tǒng),使用液滴技術(shù)結(jié)合磁珠在聚四氟乙烯毛細(xì)管進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)?？赏瑫r(shí)處理多個(gè)樣品耗時(shí)短臨床敏感性特異性高,但此微流體平臺(tái)需要外部設(shè)備微流體泵來控制液體流量,并需要輔助檢測(cè)器進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。

綜上,需要外部設(shè)備來控制液體、檢測(cè)器價(jià)格高、高通量樣品檢測(cè)能力是制約微流控技術(shù)用于食源性致病菌快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的原因。離心式微流控芯片能夠通過離心力沿微流體通道泵送液體,無需復(fù)雜流體驅(qū)動(dòng)設(shè)備,僅需使用普通的電機(jī)便能實(shí)現(xiàn)微流體的驅(qū)動(dòng),逐漸受到關(guān)注。顯色結(jié)果將通過智能手機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集及計(jì)算,方便快捷適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[12]。

本文基于LAMP設(shè)計(jì)制作出一種離心式微流控芯片,用于大腸桿菌、沙門氏菌和單增李斯特氏菌的3種食源性致病菌的快速可視化檢測(cè)。首先,建立芯片上的LAMP反應(yīng)體系并對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,其次,通過離心式微流控平臺(tái)實(shí)現(xiàn)食源性致病菌多樣本、多指標(biāo)的核酸等溫?cái)U(kuò)增及可視化檢測(cè),最后對(duì)基于LAMP的離心式微流控芯片法檢測(cè)多種食源性致病菌的特異性及靈敏性進(jìn)行確認(rèn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：光學(xué)級(jí)聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate,PMMA)板材,日本三菱；光學(xué)級(jí)雙面膠,東莞富印膠粘科技有限公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,青島海博；LB肉湯培養(yǎng)基,上海博微；DP705磁珠提取試劑盒,天根生化科技有限公司；B600001 Taq DNA聚合酶,上海生工。

菌株：大腸桿菌(ATCC 43895)、單增李斯特氏菌(ATCC 19117)，北京生物保藏中心；甲型副傷寒沙門氏菌(IQCC 10518)，上海保藏生物技術(shù)中心。

1.2 儀器與設(shè)備

VLS2.30二氧化碳激光雕刻機(jī),美國(guó)UNIVERSAL；TBK508芯片貼合機(jī),深圳市深旺達(dá)科技有限公司；YQ-620C超聲波清洗機(jī),上海易凈超聲波儀器有限公司；DW-86L828型超低溫保存箱,青島海爾科技有限公司；HD850超凈臺(tái),江蘇杰森博生物科技有限公司；GHP-9160恒溫培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ST16低溫離心機(jī),北京賽默飛科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 檢測(cè)原理

采用LAMP作為食源性致病菌的檢測(cè)方法,使用羥基萘酚藍(lán)(hydroxy naphthol blue,HNB)作為芯片上LAMP反應(yīng)的金屬離子指示劑,HNB在高濃度的 Mg2+中呈現(xiàn)紫羅蘭色；隨著LAMP反應(yīng)的進(jìn)行,Mg2+濃度降低,失去Mg2+的HNB變成天藍(lán)色,而陰性對(duì)照仍為紫羅蘭色,陰性和陽(yáng)性結(jié)果差異明顯[13]。

基本檢測(cè)過程：將3種不同致病菌的引物預(yù)存儲(chǔ)在芯片上,再將芯片放置在自制的恒溫離心式微流控平臺(tái)上;使用移液槍添加樣品緩沖液,通過再調(diào)節(jié)不同的離心速度,使樣品進(jìn)入檢測(cè)腔進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增,發(fā)生顯色反應(yīng);用手機(jī)放在固定光源固定高度的拍攝點(diǎn)進(jìn)行拍照,對(duì)顯色溶液進(jìn)行RGB值對(duì)比。

1.3.2 芯片的設(shè)計(jì)與制作

芯片材質(zhì)均為PMMA,由蓋板、通道層、池體層及底板4層組成,厚度分別為0.5、0.8、2.1及0.5 mm,其三維結(jié)構(gòu)如圖1-a所示。蓋板層主要包括進(jìn)樣孔及通氣孔；通道層主要包括進(jìn)樣腔、等分腔、廢液腔、檢測(cè)腔(1a,1b,1c,1d)、毛細(xì)管閥等結(jié)構(gòu)；池體層主要包括進(jìn)樣腔、等分腔、廢液腔、檢測(cè)腔(1a,1b,1c,1d)、微通道等結(jié)構(gòu)組成,各腔室具有固定的體積,分別為100、25、25及25 μL,如圖1-b所示。與底板進(jìn)行密封鍵合,鍵合完成后芯片實(shí)物如圖1-c所示,芯片由5個(gè)相同的單元組成,能夠同時(shí)執(zhí)行20個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)。芯片設(shè)計(jì)5 °的偏心結(jié)構(gòu),目的是使流體流入4個(gè)相同的等分腔進(jìn)行等分,并將多余樣品流入到廢液腔內(nèi)。

a-離心式微流控芯片三維結(jié)構(gòu);b-反應(yīng)單元結(jié)構(gòu)示意圖;c-離心式微流控芯片實(shí)物圖

芯片制作采用二氧化碳激光雕刻法。采用Solidworks軟件設(shè)計(jì)出芯片的三維立體結(jié)構(gòu)圖,并將立體結(jié)構(gòu)分成3層平面圖,包括頂層、通道層及底層；將各層的結(jié)構(gòu)圖形傳輸至激光雕刻機(jī),進(jìn)行平面加工,選擇向量打印參數(shù)分別為：功率60 W,速度20 s,PPI 1000進(jìn)行雕刻,得到二維的PMMA芯片；將雕刻完成的微流控芯片放入等離子超聲波清洗器中清洗3次,功率100 W,清洗15 min,放入烘箱中烘干30 min；將烘干后的芯片模型置于真空貼合機(jī)中,設(shè)置鍵合參數(shù)為真空度100 kPa、鍵合壓力4.2 kg/cm2、鍵合時(shí)間10 min,將3層結(jié)構(gòu)對(duì)齊后進(jìn)行壓裝；將芯片結(jié)構(gòu)放入除泡室中,設(shè)置除泡壓力為7.5 kg/cm2、除泡10 min,即獲得最終芯片。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)平臺(tái)的搭建

為實(shí)現(xiàn)離心式微流控芯片上的流體控制、等溫?cái)U(kuò)增及檢測(cè)功能,設(shè)計(jì)并制作出一套離心式微流控核酸等溫?cái)U(kuò)增裝置,總體結(jié)構(gòu)如圖2所示。該裝置主要由3個(gè)模塊組成,分別為離心模塊、加熱模塊及手機(jī)成像檢測(cè)模塊。該裝置能夠搭載不同設(shè)計(jì)原理的離心式微流控芯片,可實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)速控制離心、溫度控制、可視化檢測(cè),具有較好的便攜性和集成性。平均溫度誤差范圍在±1 ℃,電機(jī)轉(zhuǎn)速?gòu)牡退傧蚋咚俚倪^程中,誤差能夠控制在±10 r/min,微流控芯片中的試劑可以順利通過設(shè)計(jì)的微通道,實(shí)現(xiàn)等溫核酸擴(kuò)增及檢測(cè)。

圖2 離心式微流控核酸等溫?cái)U(kuò)增裝置示意圖

1.3.4 離心式芯片的流體流動(dòng)過程

在芯片鍵合之前,將4 μL的引物加入到每個(gè)反應(yīng)腔中,并在低溫冷凍干燥箱中干燥約40 min。在芯片使用前,進(jìn)樣孔及通氣孔均用硅膠膜密封,以避免樣品污染。從進(jìn)樣孔添加定量樣品及LAMP緩沖液于進(jìn)樣腔內(nèi),再將離心式芯片固定到離心系統(tǒng)的旋轉(zhuǎn)電機(jī)的芯軸上。調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速,旋轉(zhuǎn)方向?yàn)槟鏁r(shí)針、旋轉(zhuǎn)時(shí)間為15 s,測(cè)試流體分布的1次、2次離心速度。設(shè)定旋轉(zhuǎn)速度從0 r/min開始,每增加100 r/min測(cè)試1次,當(dāng)離心速度能將樣品及緩沖液等分到偏心結(jié)構(gòu)的4個(gè)獨(dú)立腔體,并將多余樣品流入到廢液腔內(nèi),得到1次離心速度。當(dāng)毛細(xì)管閥引起的毛細(xì)管力無法承受離心壓力時(shí),樣品通過毛細(xì)管閥進(jìn)入反應(yīng)腔,得到2次離心速度。最終,當(dāng)被檢測(cè)樣品進(jìn)入檢測(cè)腔后,使用硅膠密封貼將進(jìn)樣孔及通氣孔密封,以防止液體蒸發(fā)形成氣溶膠污染。

1.3.5 芯片上LAMP反應(yīng)體系的建立

采用New England Biolabs試劑盒,配合大腸桿菌、單增李斯特氏菌及甲型副傷寒沙門氏菌等菌種的特異性引物進(jìn)行核酸擴(kuò)增,驗(yàn)證所建立芯片上LAMP反應(yīng)體系的可行性。將提取的模板DNA作為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%的源性成分DNA。LAMP反應(yīng)試劑盒體系：10×ThermoPol 緩沖液、6 mmol/L MgSO4、1.4 mmol/L dNTP premix、1.6 μmol/L FIP/BIP、0.2 μmol/L F3/B3、40 U Bst DNA聚合酶、1 μL DNA模板及200 μmol/L的HNB溶液。

使用Primer Explorer V4軟件(http://www.primerexplorer.jp/e/)為每種目標(biāo)食源性致病菌設(shè)計(jì)了4種LAMP引物。有學(xué)者設(shè)計(jì)了4條特異性引物用于LAMP,包括2條內(nèi)引物(FIP/BIP),2條外引物(F3/B3)[14-15],大腸桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌及沙門氏菌的LAMP引物分別如表1～表3所示。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。

表1 大腸桿菌的LAMP引物

表2 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的LAMP引物

表3 沙門氏菌的LAMP引物

1.3.6 芯片上LAMP實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

為了進(jìn)一步優(yōu)化芯片上的可視化檢測(cè)體系,采用上述芯片對(duì)濃度為1×109CFU/mL大腸桿菌菌懸液提取核酸作為模板。芯片上LAMP反應(yīng)試驗(yàn)溫度選擇65 ℃恒溫60 min,選取終濃度為4、6、8、10 mmol/L的Mg2+緩沖液進(jìn)行實(shí)驗(yàn),探索對(duì)Mg2+濃度LAMP的影響；選用HNB濃度為120、150和200 μmol/L的HNB溶液進(jìn)行試驗(yàn),挑選顯色反應(yīng)可視化最明顯的反應(yīng)參數(shù)。

1.3.7 圖像處理

為了提高顏色分析的可靠性,將不同引物下反應(yīng)腔的顏色變化的結(jié)果,用基于RGB的圖像處理方法進(jìn)行表征。將手機(jī)拍攝的顯色區(qū)域的圖片導(dǎo)入Image J軟件中,隨機(jī)選取3個(gè)20×20的像素點(diǎn),分析R、G、B 3個(gè)通道的直方圖,分別記錄R、G、B值,最后計(jì)算3個(gè)像素點(diǎn)R、G、B平均值。

使用RGB圖像處理的方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果的顏色變化進(jìn)行定量分析,計(jì)算出45個(gè)陰性反應(yīng)G/R的平均比率為0.91,180個(gè)陽(yáng)性反應(yīng)G/R的平均比率為1.233,因此G/R陰性與陽(yáng)性之差為0.323；計(jì)算出B/R的45個(gè)陰性反應(yīng)的平均比率為1.44,180個(gè)陽(yáng)性反應(yīng)的平均比率為1.75,因此B/R陰性與陽(yáng)性之差為0.31；計(jì)算出G/B的30個(gè)陰性反應(yīng)的平均比率為0.67,180個(gè)陽(yáng)性反應(yīng)的平均比率為0.71,因此G/B陰性與陽(yáng)性之差為0.04。從陽(yáng)性和陰性反應(yīng)之差的數(shù)值來看,G/R和B/R大于G/B,因此選取使用G/R和B/R值作為區(qū)分陰性陽(yáng)性的標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.8 芯片上檢測(cè)多種食源性致病菌的特異性

在芯片的3個(gè)單元進(jìn)行檢測(cè),圖1-b中檢測(cè)腔1a～1c分別預(yù)存儲(chǔ)大腸桿菌、單增李斯特氏菌、沙門氏菌的引物,1d為冷凍干燥ddH2O陰性對(duì)照組。在1、2、3單元中分別添加僅含有大腸桿菌、單增李斯特氏菌、沙門氏菌的核酸緩沖液；按照1.3.5所述反應(yīng)體系,進(jìn)行LAMP擴(kuò)增,驗(yàn)證一塊芯片上同時(shí)分別檢測(cè)3種病原菌的可能性。

在芯片的4個(gè)單元進(jìn)行檢測(cè)。將3種菌種的核酸緩沖液兩兩混合得到的3種混合核酸緩沖液分別添加至芯片的前3個(gè)單元中,4單元中添加含有3種菌的混合核酸緩沖液,按照1.3.5所述反應(yīng)體系,在離心式微流控芯片上進(jìn)行LAMP擴(kuò)增,驗(yàn)證是否能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出多種病原菌,即微流控芯片檢測(cè)是否具有特異性。

1.3.9 芯片上3種食源性致病菌的敏感性

在兩塊芯片的9個(gè)反應(yīng)單元對(duì)3種食源性致病菌的敏感性進(jìn)行測(cè)試。用上述3種食源性致病菌的核酸混合液,按照10倍濃度梯度進(jìn)行稀釋,得到10～109copies/μL,加入到9個(gè)反應(yīng)單元的進(jìn)樣腔中,根據(jù)顯色結(jié)果,分析不同食源性致病菌核酸的檢測(cè)限。

2 結(jié)果與分析

2.1 離心式芯片的流體流動(dòng)過程驗(yàn)證結(jié)果

離心式微流控芯片中液體流動(dòng)過程如圖3所示,離心式微流控芯片的加樣狀態(tài)如圖3-a所示,將LAMP試劑及DNA樣品加載到離心式微流控芯片中。

a-加樣狀態(tài)；b-低速離心狀態(tài)；c-高速離心狀態(tài)

在300 r/min下,LAMP試劑開始流入偏心等分通道中進(jìn)行等分。在900 r/min時(shí)候,低速離心狀態(tài)如圖3-b所示,溶液充滿等分腔,多余液體流入廢液腔。在速度調(diào)節(jié)至2 300 r/min時(shí)候,高速離心狀態(tài)如圖3-c所示,毛細(xì)管閥被激活,等分完成后LAMP試劑進(jìn)入檢測(cè)腔與引物混合,開始DNA擴(kuò)增。在DNA擴(kuò)增之前,使用硅膠膜進(jìn)行密封,以防止等溫?cái)U(kuò)增過程中液體蒸發(fā)、損失及氣溶膠性污染。

2.2 芯片上LAMP實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化結(jié)果

當(dāng)Mg2+終濃度為4、6、8、10 mmol/L時(shí),大腸桿菌完成LAMP反應(yīng)后的顯色結(jié)果,如圖4所示。由圖可以看出,在Mg2+終濃度8 mmol/L時(shí),藍(lán)色和紫色的區(qū)分程度最高,因此選取實(shí)驗(yàn)所用Mg2+濃度為8 mmol/L。

a-4 mmol/L；b-6 mmol/L；c-8 mmol/L；d-10 mmol/L

當(dāng)HNB濃度為120、150和200 μmol/L時(shí),大腸桿菌完成LAMP反應(yīng)后的顯色結(jié)果,如圖5所示。由圖可以看出,在HNB濃度為200 μmol/L時(shí),藍(lán)色和紫色的區(qū)分程度最高,因此選取實(shí)驗(yàn)所用HNB濃度為200 μmol/L。

a-120μmol/L；b-150μmol/L；c-200μmol/L

2.3 芯片上多種食源性致病菌的特異性檢測(cè)

為了證明離心式微流控芯片能夠同時(shí)進(jìn)行多種食源性致病菌的檢測(cè),采用大腸桿菌、單增李斯特氏菌、沙門氏菌進(jìn)行LAMP反應(yīng),進(jìn)行多重檢測(cè)。

在圖6-a中1單元中添加僅含有大腸桿菌核酸緩沖液,1a中顏色由紫羅蘭色變?yōu)樗{(lán)色,其他區(qū)域均無顏色變化；在圖6-a中2單元中添加僅含有單增李斯特氏菌核酸緩沖液,結(jié)果顯示,僅1b發(fā)生顏色變化,其他區(qū)域均無顏色變化；在圖6-a中3單元中添加僅含有沙門氏菌核酸緩沖液,結(jié)果顯示,僅1c發(fā)生顏色變化,其他區(qū)域均無顏色變化。結(jié)果表明該芯片能夠檢測(cè)出單一菌株。

在圖6-b中1單元添加含有大腸桿菌及單增李斯特氏菌的混合核酸緩沖液,僅1a與1b發(fā)生由顏色變化,其他區(qū)域均無顏色變化；圖6-b中2單元添加含有大腸桿菌及沙門氏菌的混合核酸緩沖液,僅1a與1c發(fā)生顏色變化,其他區(qū)域均無顏色變化；圖6-b中3單元添加含有單增李斯特氏菌及沙門氏菌的混合核酸緩沖液,僅1b與1c發(fā)生顏色變化,其他區(qū)域均無顏色變化；圖6-b中4單元添加含有大腸桿菌、單增李斯特氏菌及沙門氏菌的混合核酸緩沖液,在1a～1c區(qū)域發(fā)生顏色變化,陰性對(duì)照組無顏色變化。綜上所述,3組引物均對(duì)靶細(xì)胞具有特異性,并且沒有發(fā)生引物混合物溶液和所得DNA擴(kuò)增子的蒸發(fā)而產(chǎn)生污染問題,證明可以在單個(gè)離心式微流控芯片上進(jìn)行3種食源性致病菌的檢測(cè)。

a-一種食源性致病菌的檢測(cè)；b-多種食源性致病菌的檢測(cè)；c-一種食源性致病菌G/R與B/R的關(guān)系；d-多種食源性致病菌G/R與B/R的關(guān)系

最終對(duì)可視化數(shù)據(jù)進(jìn)行RGB圖像處理的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,結(jié)果如圖6-c、圖6-d所示。從1種食源性致病菌G/R與B/R的關(guān)系可以看出,1a,2b,3c可以確定為陽(yáng)性反應(yīng)結(jié)果,其余為陰性反應(yīng)結(jié)果。從芯片上有多種食源性致病菌G/R與B/R的關(guān)系可以看出,1單元1a,1b為陽(yáng)性,2單元2a、2c為陽(yáng)性,3單元3b、3c為陽(yáng)性,4單元4a、4b、4c均為陽(yáng)性。此結(jié)果與可視化結(jié)果相同,說明能夠用G/R和B/R的數(shù)值能夠有效區(qū)分陰性和陽(yáng)性,離心式微流控芯片方法可以進(jìn)行3種食源性致病菌的同時(shí)檢測(cè),且特異性良好。

2.4 芯片上3種食源性致病菌的敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將3種濃度為10～109copies/μL食源性致病菌的核酸混合液分別加入9個(gè)反應(yīng)單元的進(jìn)樣腔,在離心式微流控芯片上進(jìn)行LAMP擴(kuò)增后結(jié)果如圖7所示。圖7-a中在1～5區(qū)域中均有顏色變化,陰性對(duì)照組無顏色變化。圖7-b中在1～2區(qū)域中發(fā)生顏色變化,陰性對(duì)照組無顏色變化。在3～4區(qū)域中1a、1b及1c區(qū)域及陰性對(duì)照組均無顏色變化。當(dāng)濃度≤102copies/μL時(shí),不能檢測(cè)出來,離心式芯片上3種食源性致病菌的檢測(cè)限為103copies/μL。

通過RGB圖像處理的方法進(jìn)行驗(yàn)證,圖7-c～圖7-e分別表示大腸桿菌、單增李斯特氏菌及沙門氏菌G/R與B/R的關(guān)系,當(dāng)3種菌的濃度為102和10 copies/μL時(shí),檢測(cè)結(jié)果都出現(xiàn)在陰性區(qū),3種菌的濃度≥103copies/μL時(shí),檢測(cè)結(jié)果都出現(xiàn)在陽(yáng)性區(qū),說明3種食源性致病菌的檢測(cè)限為103copies/μL。RGB圖像處理結(jié)果與可視化結(jié)果相同,這表明用G/R和B/R的數(shù)值區(qū)分陰性和陽(yáng)性結(jié)果具有較高的準(zhǔn)確率。

a-濃度為105-109 copies/μL的敏感性檢測(cè);b-濃度為10～104 copies/μL的敏感性檢測(cè);c-大腸桿菌G/R與B/R的關(guān)系;d-單增李斯特氏菌的G/R與B/R的關(guān)系;e-沙門氏菌的G/R與B/R的關(guān)系

2.5 方法對(duì)比

將本文提出的離心式微流控LAMP等溫?cái)U(kuò)增方法與已報(bào)道的LAMP擴(kuò)增方法進(jìn)行對(duì)比。呂觀等[16]建立了金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌O157∶H7的實(shí)時(shí)熒光LAMP檢測(cè)方法。通過配制完整的LAMP反應(yīng)體系,對(duì)目標(biāo)質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),在熒光定量 PCR儀上設(shè)置反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；65 ℃,15 s,65 ℃;45 s,45個(gè)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增,然后取25 μL反應(yīng)產(chǎn)物和5 μL 6×載樣緩沖液混合后2%凝膠電泳檢測(cè),測(cè)得沙門氏菌質(zhì)粒的靈敏度為1.91×102copies/μL,金黃色葡萄球菌質(zhì)粒的靈敏度為2.72×102copies/μL,大腸桿菌O157∶H7的質(zhì)粒靈敏度為2.28×102copies/μL。此方法使用EP管在PCR儀中進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增,凝膠成像系統(tǒng)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè),整個(gè)檢測(cè)過程耗時(shí)長(zhǎng),操作步驟繁多,不便于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。LUO等[10]研發(fā)出一種微流控多重電化學(xué)LAMP芯片,將芯片置于智能恒溫加熱板上在63 ℃下進(jìn)行擴(kuò)增,通過數(shù)字光纖耦合的光學(xué)傳感器系統(tǒng)進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)鑒定結(jié)核分枝桿菌、流感嗜血桿菌和肺炎克雷伯菌,檢測(cè)限分別為28、17、16 copies/μL。此檢測(cè)方法靈敏度很高,但需要昂貴的檢測(cè)設(shè)備,不便于推廣。上述研究中的檢測(cè)過程都需要專門的檢測(cè)設(shè)備,包括凝膠成像系統(tǒng)、光學(xué)傳感器等。本文提出的離心式微流控LAMP等溫?cái)U(kuò)增體系在檢測(cè)靈敏度方面還有一定的提升空間,但此方法通過離心力沿微流體通道泵送液體,不需要復(fù)雜流體驅(qū)動(dòng)設(shè)備,僅需使用普通的電機(jī)便能實(shí)現(xiàn)微流體的驅(qū)動(dòng)；其次,整個(gè)檢測(cè)過程不需要專門的檢測(cè)設(shè)備,將顯色結(jié)果通過智能手機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集及計(jì)算,區(qū)分陽(yáng)性反應(yīng)和陰性反應(yīng),實(shí)驗(yàn)條件更加方便,適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；此外,可以同時(shí)進(jìn)行5種樣品的3種食源性致病菌的檢測(cè),大大提高了檢測(cè)的通量。離心式微流控芯片法與ELISA法及實(shí)時(shí)熒光定量PCR法相比較,反應(yīng)條件簡(jiǎn)單僅需恒定溫度,便能快速擴(kuò)增目的基因,敏感性與實(shí)時(shí)熒光定量PCR法相當(dāng),且基于LAMP的離心式微流控芯片具有反應(yīng)時(shí)間短,試劑消耗量少,易于集成等優(yōu)勢(shì),具有實(shí)現(xiàn)核酸提取、擴(kuò)增、檢測(cè)集成化、自動(dòng)化的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

3 結(jié)論

本文基于LAMP技術(shù)檢測(cè)原理,設(shè)計(jì)了離心式微流控檢測(cè)芯片,并通過對(duì)LAMP實(shí)驗(yàn)中的Mg2+濃度以及HNB濃度進(jìn)行優(yōu)化,使得可視化檢測(cè)結(jié)果更加明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在900 r/min轉(zhuǎn)速下,微流控芯片中溶液充滿等分腔,多余液體流入廢液腔,在2 300 r/min轉(zhuǎn)速下,毛細(xì)管閥被激活,LAMP試劑進(jìn)入檢測(cè)腔與引物混合,進(jìn)行核酸擴(kuò)增。用羥基酚藍(lán)染料作為指示劑,通過肉眼觀察芯片上的顏色變化從紫羅蘭色到天藍(lán)色,結(jié)合LAMP反應(yīng)的結(jié)果,使用RGB的數(shù)據(jù)處理與可視化結(jié)果進(jìn)行對(duì)比,能夠更加準(zhǔn)確的區(qū)分陽(yáng)性反應(yīng)和陰性反應(yīng)。采用離心式微流控檢測(cè)芯片對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌和單增李斯特氏菌進(jìn)行檢測(cè),能夠在60 min內(nèi)完成,并且該芯片具有良好的特異性及敏感性,檢測(cè)限為103copies/μL。本研究還存在一定的局限性,如未考慮實(shí)際食源性致病菌檢測(cè)的食品基質(zhì),且通過顯色反應(yīng)得出的檢測(cè)結(jié)果精度還不夠高,僅在現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的半定量分析。后續(xù)研究還可以將核酸提取及核酸擴(kuò)增集成到一張芯片上,達(dá)到核酸提取、擴(kuò)增、檢測(cè)的集成化、自動(dòng)化。