衛(wèi)春會,鄭自強,李浩,任志強,黃治國,鄧杰*,董玲

1(四川輕化工大學 釀酒生物技術(shù)及應用四川省重點實驗室,四川 宜賓,644000)2(四川水井坊股份有限公司,四川 成都,610036)3(中國輕工業(yè)釀酒生物技術(shù)及智能制造重點實驗室,四川 宜賓,644000)4(三門峽職業(yè)技術(shù)學院,河南 三門峽,472000)

中國白酒主要分為十二大香型,較為典型的代表為濃香型。濃香型白酒以高粱、大米等糧谷物為釀造原料,以中高溫大曲為糖化發(fā)酵劑,原料與曲混合發(fā)酵形成酒醅,酒醅發(fā)酵后,取酒糟,經(jīng)過緩火蒸餾、儲存、勾兌等釀造工藝得到風味豐富、口感獨特的濃香型白酒。白酒發(fā)酵過程中,風味微生物以酒醅為載體參與白酒釀造的糖化、產(chǎn)酒以及生香過程,進而影響成品酒的酒質(zhì)[1-3]。近年來,酒醅的理化參數(shù)、微生物群落演替以及酒醅中揮發(fā)性香氣成分受到研究者的關(guān)注[4-5]。任劍波等[6]通過對窖池不同層面酒醅中微生物的研究發(fā)現(xiàn),酒醅微生物區(qū)系存在差異；李賀賀等[7]分析了古井貢酒酒醅中的風味物質(zhì),共定性出148種揮發(fā)性香氣成分。隨著固相微萃取技術(shù)在食品發(fā)酵領(lǐng)域的普及,酒醅中揮發(fā)性香氣成分的研究愈加廣泛,而針對酒醅風味成分變化的時空差異研究有待進一步完善。

本研究以濃香型酒醅作為研究對象,通過頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(headspace solid phase microextraction-GC-MS,HS-SPME-GC-MS)定性、定量分析酒醅不同空間層中的主要呈香物質(zhì),通過主成分分析探究影響酒醅的主要風味成分,并對其重要呈香物質(zhì)及其前體物的時空遷移規(guī)律進行跟蹤監(jiān)測,以期為濃香型白酒酒醅發(fā)酵過程與白酒風味的聯(lián)系提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

酒醅樣品,取自川南某濃香型白酒廠。按窖池深度差異分為上、中、下3層,每層采用5點取樣法取樣,放入無菌袋密封,并置于4 ℃下保存,取回后樣品及時處理[8]。

1.1.2 試劑

2-辛醇、乙酸正戊酯、無水乙醇(均為色譜純)、NaCl(分析純),成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

AR2140電子天平,梅特勒托利多儀器有限公司；7890A—5975B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國 Agilent 公司；KQ5200E超聲波清洗儀,昆山市超聲儀器有限公司；ZHBF-RE旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,中環(huán)北方有限公司。

1.3 實驗方法

采用HS-SPME-GC-MS,對濃香型白酒酒醅的揮發(fā)性風味物質(zhì)進行分析。

1.3.1 樣品前處理

稱取酒醅樣品10 g,加入50 mL無水乙醇20 ℃超聲處理15 min,取浸提液進行蒸餾濃縮,蒸餾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)再次濃縮至20 mL,最后使用氮吹濃縮至5 mL備用[9-10]。

1.3.2 HS-SPME-GC-MS測定條件

萃取條件：取氮吹后的濃縮液5 mL于頂空進樣瓶。頂空進樣樣品中加入100 μL內(nèi)標溶液,將進樣瓶密封,于50 ℃恒溫平衡樣品20 min,同時使用老化后的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭萃取40 min,手動進樣分析。

色譜條件：DB-WAX(60.0 m×0.25 mm×0.25 μm)毛細管色譜柱；載氣為99.999%氦氣,進樣口溫度230 ℃；分流比20∶1；程序升溫為初始溫度40 ℃,保持1 min,7 ℃/min升到180 ℃,保持3 min；10 ℃/min升到230 ℃,保持3 min；載氣流速1 mL/min。

質(zhì)譜條件：電離電壓70 eV,離子源溫度230 ℃,四極桿溫度150 ℃,電離方式為電子電離(electron ionization,EI),質(zhì)譜掃描范圍20～500 amu,溶劑延遲3 min。

定性分析：采用NIST05a.L標準譜庫(美國 Agilent 公司)比對,通過GC-MS化學工作站進行數(shù)據(jù)分析。

定量分析：采用內(nèi)標法,使用2-辛醇、乙酸正戊酯為內(nèi)標物,通過預試驗調(diào)整內(nèi)標物濃度,確定2-辛醇質(zhì)量濃度為16.944 7 mg/mL,乙酸正戊酯質(zhì)量濃度為0.527 5 mg/mL,以2-辛醇內(nèi)標檢測酒醅中含量較多的風味物質(zhì),以乙酸正戊酯檢測酒醅中含量較低的風味物質(zhì)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

設(shè)置3組平行,每組樣品測定3次,結(jié)果采用(x±S)表示,采用SPSS 22.0數(shù)據(jù)分析軟件和NIST 8.0譜庫檢索,對呈香物質(zhì)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒醅不同空間層的風味差異分析

酒醅的風味直接決定了濃香型白酒口感質(zhì)量,原料的發(fā)酵方式?jīng)Q定了濃香型白酒窖香濃郁、綿甜爽凈、回味悠長的酒質(zhì)特點[11]。本試驗通過頂空固相微萃取處理樣品,對酒醅中主要酯類[12]、醇類[13]、酸類以及白酒有益風味因子進行分析,結(jié)果見表1。

表1 酒醅不同層面主要風味物質(zhì)分析結(jié)果

本試驗針對酒醅中含量較高的醇類、酯類、酸類和酚類物質(zhì)進行檢測,共有38種物質(zhì),其中酯類18種、醇類10種、酸類8種和4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚2種白酒有益因子。

酒醅不同層均所檢測到的物質(zhì)分別有四大酯(己酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯)、四大酸(己酸、丁酸、乙酸、乳酸)和戊酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、十六酸乙酯、異戊醇、正戊酸、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚等物質(zhì),這些風味物質(zhì)對濃香型白酒的整體風味具有較大影響。酒醅上、中、下層主要呈香物質(zhì)分別為20、32、26種,其中上、中、下層主要酯類數(shù)量分別為7、18、14種,主要醇類數(shù)量分別為7、8、5種,主要酸類數(shù)量分別為4、8、7種,以及共有的酚類物質(zhì)各2種。

醇類物質(zhì)在酒醅上、中、下層相對含量分別為1.98%、10.62%、1.13%,具體含量分別為18.54、354.70、26.14 mg/L,醇類物質(zhì)突出表現(xiàn)在中層酒醅中,包括苯乙醇、十二醇、六聚乙二醇等高級醇成分,高級醇是酒類中最主要的香味和口味物質(zhì)之一,適量的含量能使酒香味和口味協(xié)調(diào)、豐滿,高級醇具有強烈的甜香、奶香[14-15],有學者提出,苯乙醇是玫瑰香葡萄酒的特征香氣成分,具有清甜的玫瑰樣花香,可增加酒體香味,使成品酒余味回香[16-17]。

酸類物質(zhì)在酒醅上、中、下層相對含量分別為50.88%、43.27%、55.80%,具體含量分別為476.54、1 444.75、1 293.41 mg/L,酸類物質(zhì)在酒醅上層風味中占比低于酸在中、下層中的占比,而實際含量卻高于中層和下層,綜合得出,酒醅中層無論是主要風味成分種類還是在總含量上皆更為豐富,而上層則表現(xiàn)得略為單調(diào),酒醅下層中己酸及己酸乙酯含量最高,分別達220.25和441.86 mg/L,下層酒醅厭氧程度更高,更有利于己酸菌等厭氧菌在下層酒醅中代謝產(chǎn)生己酸及進一步合成濃香型白酒的主體風味物質(zhì)己酸乙酯。

酯類物質(zhì)在酒醅上、中、下層相對含量分別為46.89%、45.81%、42.79%,具體含量分別為439.17、1 529.45、989.89 mg/L,作為白酒主體風味骨架的四大酯、四大酸在酒醅不同空間層面均有所分布,其中酒醅上、中、下層中四大酯相對含量占總酯69.65%、56.23%、66.79%,在酯類物質(zhì)中占有絕對的主導地位,丁酸乙酯與己酸乙酯相對含量比值分別為0.07、0.15、0.14,有學者認為,四大酯占總酯比例較大,則酒質(zhì)好,濃香型風格突出；丁酸乙酯與己酸乙酯比值低于0.1,則酒體協(xié)調(diào),從這個角度分析,上層酒醅對白酒濃香型風格的形成和對整個酒體的品質(zhì)貢獻較大[18-19]。

此外,本研究也對愈創(chuàng)木酚等白酒有益風味因子進行了檢測。酒醅不同空間層均檢測到了4-甲基愈創(chuàng)木酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚,酒醅中層含量略高,4-甲基愈創(chuàng)木酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚含量約為5.01 mg/L,4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚具有呈香、呈味作用,在醬、濃、清、芝麻香等最具白酒代表的四大香型白酒研究中均有報道,具有普遍性,愈創(chuàng)木酚是白酒中的有益因子,具有較好的抗氧化、抗腫瘤和增強人體免疫力的作用[20-21]。

對酒醅上層、中層以及下層所檢出的38種風味成分進行主成分分析作降維處理,以得到對酒醅影響較大的主要呈香物質(zhì),進而分析其發(fā)酵過程變化規(guī)律,分析結(jié)果見圖1。

a-載荷散點圖；b-重要風味物質(zhì)

變量的載荷系數(shù)反映了變量對各主成分的影響程度,載荷系數(shù)絕對值越大,則該變量對主成分的貢獻也越大[22]。由圖1-a可知,第一主成分(PC1)單獨貢獻率為91.90%,第二主成分(PC2)單獨貢獻率為6.56%,兩者累計貢獻率為98.46%(>85.00%),具有代表意義。圖1-b為第一主成分和第二主成分綜合分析結(jié)果,得到酒醅的重要風味物質(zhì),其代表有乙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、己酸己酯、丁酸、己酸、乳酸、乙酸等。

綜合上述結(jié)果,決定對乳酸乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸乙酯及其前體酸的時空變化規(guī)律作進一步跟蹤監(jiān)測。

2.2 發(fā)酵過程酒醅風味成分變化規(guī)律反映的結(jié)果

酒醅不同層面的發(fā)酵過程受窖內(nèi)溫度、厭氧環(huán)境、微生物群落等眾多因素影響,反映結(jié)果為酒醅的風味物質(zhì)隨發(fā)酵時間變化存在差異[23-24]。本試驗監(jiān)測了濃香型不同層面的酒醅發(fā)酵過程重要風味物質(zhì)及其前體物(四大酯、四大酸)含量的變化,其結(jié)果如圖2、圖3所示。酒醅不同空間層重要呈香物質(zhì)隨時間變化存在差異,酒醅不同空間層的四大酯、四大酸整體上先增加較緩(0～15 d),中后期迅速增加至穩(wěn)定趨勢,其中,酒醅的中、下層變化較大,上層變化趨勢較緩。

a-己酸乙酯；b-丁酸乙酯；c-乙酸乙酯；d-乳酸乙酯

a-己酸；b-丁酸；c-乙酸；d-乳酸

發(fā)酵0～15 d,酒醅中己酸乙酯含量增加緩慢,15 d后中、下層己酸乙酯含量迅速增加,發(fā)酵進行到50 d后,增加趨勢放緩,酒醅上層較酒醅中下層相比,增加趨勢和中、下層相近,但增加程度明顯低于中、下層,發(fā)酵到63 d時,上層己酸乙酯含量為59.25 mg/L,中、下層質(zhì)量濃度分別為136.77和162.77 mg/L。酒醅中、下層在發(fā)酵前期乙酸乙酯含量大致趨于一致,隨后上、下層含量增加趨勢放緩,趨于穩(wěn)定,直至發(fā)酵后期,而中層乙酸乙酯含量繼續(xù)增加,至35 d達到峰值,為82.79 mg/L,隨后有所降低,發(fā)酵進行到50 d后趨于穩(wěn)定。整體上,丁酸乙酯在同一發(fā)酵過程在四大酯含量中最少,丁酸乙酯的生成和己酸乙酯的生成在前63 d呈正相關(guān),63 d后,下層中的丁酸乙酯含量有所降低。在發(fā)酵中期,乳酸乙酯含量處于較快的增加水平,35 d后,中、下層增加趨勢放緩,而上層酒醅在35～56 d乳酸乙酯含量迅速增加,隨后呈明顯下降趨勢。發(fā)酵初期,酒醅內(nèi)微生物主要起糖化作用,所需的碳源和能源物質(zhì)需要不斷補充,此時酯主要起分解作用,酯類合成較少。沈怡方[25]認為,酯的形成有3條途徑：一是酵母菌在酒精發(fā)酵時的副產(chǎn)物；二是酒醅中過量的酸經(jīng)微生物酯化形成；三是其他微生物發(fā)酵的代謝物。因此發(fā)酵前期(0～15 d),窖內(nèi)酒精含量較低,發(fā)酵中期微生物主要起產(chǎn)酒的作用,且酸類物質(zhì)含量也較低,故酒醅中酯的生成量較少,酯類的生成較緩,到發(fā)酵中后期,發(fā)酵進入產(chǎn)酯階段,微生物代謝產(chǎn)物增多,醇類以及乙酸、丁酸等合成己酸乙酯、丁酸乙酯等的前體物質(zhì)大量增多,酯類物質(zhì)開始大量生成,為白酒發(fā)酵過程提供“產(chǎn)香”作用。

酒醅不同空間層中,隨發(fā)酵時間增加，酒醅上層己酸的含量增加明顯,63 d時達到峰值,最高達366.70 mg/L和上、中層存在明顯差異,上層己酸含量在前45 d左右略高于中層,隨后下層己酸含量開始降低至平緩,中層繼續(xù)增加至發(fā)酵后期趨于穩(wěn)定,酒醅中層的乙酸、乳酸、丁酸含量進入主發(fā)酵期后,在不同發(fā)酵時間段,其三大酸含量皆高于上層和下層,其乙酸、乳酸含量分別在49 d和63 d達到峰值,分別為266.55、665.51 mg/L。有機酸的生成受到產(chǎn)酸微生物生理活動影響,隨發(fā)酵時間的進行,環(huán)境對產(chǎn)酸微生物表征為協(xié)同作用,有利于產(chǎn)酸微生物的代謝活動,促使有機酸含量上升,并進一步促使酯類合成[26-27]。窖內(nèi)微生物群落主要為乳酸菌群,故酒醅中乳酸菌代謝所產(chǎn)生的乳酸含量及合成的乳酸乙酯含量較其他有機酸及酯類物質(zhì)高,窖內(nèi)中、下層厭氧程度更高,且黃水滲透中、下層,賦予了中、下層酒醅更多的營養(yǎng)物質(zhì),更加適于己酸菌、丁酸菌等厭氧菌群的代謝繁殖,合成的酯類最終也高于酒醅上層,而在發(fā)酵前45 d,上層酒醅己酸含量累計速度較中層略高,可能是由于發(fā)酵中期中層酒醅中己酸累計量還較低,己酸主要用于合成己酸乙酯,消耗了己酸,導致發(fā)酵前、中期酒醅中層己酸含量較低,后期己酸累計量增多,滿足己酸乙酯的合成需要,故累計量繼續(xù)增加,而上層酒醅中的己酸含量隨發(fā)酵的繼續(xù)進行趨于平緩；發(fā)酵過程中,丁酸含量在四大酯中最低,可能有2種原因,一是產(chǎn)丁酸菌的繁殖代謝需要厭氧生態(tài)因子,生存條件相對苛刻;二是丁酸作為己酸代謝途徑的中間物,合成己酸消耗了丁酸,加上丁酸也被丁酸乙酯的合成所消耗,故含量處于較低水平。

3 結(jié)論

本研究采用HS-SPME-GC-MS法對濃香型白酒酒醅不同層面的主要風味物質(zhì)和發(fā)酵過程四大酯、四大酸的變化規(guī)律進行了分析。檢測分析了酒醅不同層面相對含量較高的風味物質(zhì)38種,包括酯類物質(zhì)18種、醇類物質(zhì)10種、酸類物質(zhì)8種以及2種白酒有益因子愈創(chuàng)木酚。

酒醅上、中、下層的酯類數(shù)量分別為7、18、14種,醇類數(shù)量分別為7、8、5種,酸類數(shù)量分別為4、8、7種。酒醅上層的風味物質(zhì)種類較少,但上層酒醅對白酒濃香型風格的形成和對整個酒體的品質(zhì)貢獻較大；酒醅中層無論是主要風味成分種類還是在總含量聚集了更為豐富的香氣成分；酒醅中、下層的酸和酯類物質(zhì)含量較高。

酒醅不同空間層的四大酯、四大酸整體上呈現(xiàn)先較緩增加(0～15 d),中后期呈迅速增加至穩(wěn)定的趨勢,其中,酒醅的中、下層變化趨勢較大,上層變化趨勢較緩。本研究解析了濃香型白酒發(fā)酵過程中酒醅不同層面的主要風味物質(zhì)在時間層面和空間層面的變化規(guī)律,為進一步研究固態(tài)發(fā)酵過程提供了理論依據(jù)。