王一丹，陳弟詩(shī)，向 華，張煥容，任玉鵬*

(1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都 610041；2.四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，成都 610041)

鴨甲型肝炎病毒(duck hepatitis A virus, DHAV)是小RNA病毒科家族成員，以引起鴨肝腫大、彌漫性出血和壞死為主要特征，對(duì)3周齡內(nèi)雛鴨易感性和致死率最高，也是目前OIE規(guī)定需要法定報(bào)告的疾病之一[1]。根據(jù)DHAV的基因序列特征和遺傳進(jìn)化分析，可將DHAV分為DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3三個(gè)亞型，其中DHAV-3型首次發(fā)現(xiàn)于韓國(guó)[2]。據(jù)調(diào)查，在2010-2015年，我國(guó)遼寧、山東、浙江、江蘇、福建、廣西、湖北和四川等多省來(lái)源樣本中，DHAV-1和DHAV-3總陽(yáng)性率高達(dá)91.4%(320/350)；而2013年后的流行毒株以DHAV-3為主(占比達(dá)57.1%)[3]。當(dāng)前對(duì)DHAV的防控主要依賴于對(duì)母鴨開(kāi)產(chǎn)前的免疫接種和出殼雛鴨卵黃抗體注射，但現(xiàn)有商品化的疫苗或抗體僅針對(duì)DHAV-1，對(duì)DHAV-3感染的保護(hù)效果不佳[4]，這使得養(yǎng)殖場(chǎng)鴨群一旦暴發(fā)病毒性肝炎將遭受經(jīng)濟(jì)損失。因此，對(duì)DHAV-3新型有效防治方法的研究具有必要性。

干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白(interferon-induced transmembrane proteins, IFITMs)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的位于多種組織細(xì)胞膜中，由膜蛋白受體CD225基因家族編碼的具有免疫調(diào)節(jié)和廣譜抗病毒效應(yīng)的蛋白家族[5]。IFITMs主要由機(jī)體免疫系統(tǒng)在病原模式分子刺激下產(chǎn)生的Ⅰ型干擾素通過(guò)JASK-STAT信號(hào)通路誘導(dǎo)產(chǎn)生[6]。已有研究表明，IFITMs可抑制正黏病毒、副黏病毒(如禽流感病毒)的復(fù)制[7]，阻止絲狀病毒和冠狀病毒(如COVID-19)的吸附入侵，抑制黃病毒的膜融合和內(nèi)吞作用[8]。此外，IFITMs對(duì)口蹄疫病毒和柯薩奇病毒等[9]小RNA病毒的復(fù)制也具有類似的抑制作用。因此，IFITMs有望成為一類新型、高效的抗病毒藥物。但目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于duIFITMs 是否對(duì)DHAV也具有抑制作用尚不清楚，因而深入探討duIFITMs對(duì)DHAV-3感染的抑制作用和揭示其分子機(jī)制可以為duIFITMs成為一種新型有效的抗病毒分子奠定理論基礎(chǔ)。

本研究以DHAV-3毒株對(duì) 3日齡 SPF雛鴨攻毒，通過(guò)對(duì)雛鴨肝組織中mRNA進(jìn)行高通量測(cè)序分析，并結(jié)合Real-time PCR檢測(cè)duIFITMs的表達(dá)水平變化，篩選出可能具有抗病毒作用的duIFITM家族成員，進(jìn)一步在DELC中驗(yàn)證其對(duì)DHAV-3的抑制作用，為DHAV新型防治藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和毒株

用于攻毒的3日齡雛鴨由SPF櫻桃谷鴨胚孵化，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，并在西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房飼養(yǎng)至適齡。DHAV-3 SWUNC4 株(TCID50: 10-5.34·0.2 mL-1)由西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離、保存[10]。

1.2 主要試劑材料

PrimescriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶HindⅢ、SacⅡ和pEGFP-N1購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；Gel Extraction Kit和Endo-Free Plasmid Mini Kit I購(gòu)自美國(guó)Omega Bio-Tek 公司；Applied BiosystemsTMPowerTMSYBRTMGreen預(yù)混液和PageRulerTMPrestained Protein Ladder 購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；FuGENE? HD Transfection Reagent 購(gòu)自美國(guó) Roche Applied Science 公司；Anti-GAPDH Monoclonal Antibody 購(gòu)自艾美捷科技有限公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠 IgG 購(gòu)自安諾倫(北京)生物科技有限公司；鼠抗 duIFITM1 由西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備并保存。

1.3 動(dòng)物分組及攻毒

將3日齡雛鴨按每組9羽隨機(jī)分成攻毒組和對(duì)照組。將經(jīng)過(guò)0.22 μm濾器處理后的 DHAV-3 SWUNC4 株病毒尿囊液稀釋至100 TCID50，按每羽 200 μL劑量由胸部多點(diǎn)肌肉注射方式攻毒。分別于感染后12、24和36 h剖殺攻毒組和對(duì)照組雛鴨各3只，無(wú)菌采集肝組織塊，并立即浸泡在液氮中迅速冷凍，再轉(zhuǎn)入DEPC處理且滅菌EP管，轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱備后續(xù)研究使用。

1.4 基于RNA-Seq技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析

以Trizol regeant法提取肝組織樣本中的總RNA。用核酸蛋白儀 Nanodrop 2000 測(cè)定并計(jì)算提取的核酸的OD260 nm/OD280 nm比值，驗(yàn)證RNA樣品純度和完整性。分別將感染DHAV-3 12、24 h雛鴨肝的RNA樣本送深圳華大基因科技有限公司，用Illumina MiseqTM2000技術(shù)平臺(tái)對(duì)樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

用Albacore軟件將通過(guò)RNA-seq技術(shù)得到的測(cè)序數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化和處理；用Soapnuke軟件以默認(rèn)參數(shù)對(duì)獲取片段堿基組成和質(zhì)量分析以確定原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量，濾除reads中的測(cè)序接頭和低質(zhì)量堿基，獲得clean reads用于信息分析。與參考基因組進(jìn)行比對(duì)和分析。用NOISeq統(tǒng)計(jì)差異表達(dá)基因。并設(shè)置閾值log2fold change≥-1或>1，probability>0.8 得到樣本之間的表達(dá)差異基因。GO富集分析和差異基因的KEGG pathway分析采用超幾何檢驗(yàn)和FDR矯正，F(xiàn)DR<0.05被認(rèn)為屬于顯著富集，使用Omicshare在線分析繪圖。根據(jù)pathway分析結(jié)果，重點(diǎn)篩選出免疫與炎癥相關(guān)通路上的基因。用Cytoscap軟件對(duì)所有的候選基因進(jìn)行pathway富集和圖形化分析。

1.5 差異表達(dá)基因的熒光定量PCR驗(yàn)證

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)處理和生物信息學(xué)分析結(jié)果，篩選與雛鴨抗病毒免疫和炎癥反應(yīng)相關(guān)分子(IFN-α、IFN-β、RIG-I、MDA5、IFITM1、IFITM5、IRF1、IRF3、IL-8和IL-10等)。用 Real-time PCR法分別對(duì)攻毒后12、24和36 h肝組織樣本中相關(guān)分子的mRNA含量進(jìn)行驗(yàn)證。所用引物都參考GenBank上登錄的綠頭鴨相關(guān)基因序列，利用 oligo 7軟件設(shè)計(jì)篩選，并以GAPDH基因作內(nèi)參，詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 熒光定量PCR驗(yàn)證所用引物信息

Real-time PCR反應(yīng)體系：2×SYBR Green I PCR Mix 8 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，cDNA 模板 1 μL，ddH2O 5 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min；94 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。并根據(jù)GAPDH基因擴(kuò)增結(jié)果的Ct值計(jì)算2-△△Ct值，分析基因表達(dá)的倍數(shù)差異，同時(shí)結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序比較分析。

1.6 pEGFP-duIFITM1在DELC 中的過(guò)表達(dá)

根據(jù)NCBI上綠頭鴨 IFITM1(AnasplatyrhynchosIFIM1, duIFITM1)cDNA序列作為參考(Accession number: NM_001310823.1)，在基因兩端引入HindⅢ和SacⅡ限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)和 Kozak 序列(GCCACC)，由武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司進(jìn)行基因合成，片段大小為 450 bp，預(yù)測(cè)其表達(dá)蛋白大小約 15.8 ku。合成的基因連入 pMD19-T，并測(cè)序驗(yàn)證其正確性。分別對(duì) pMD19-T-duIFITM1 和 pEGFP-N1 載體進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，反應(yīng)體系均為質(zhì)粒 8 μL，HindⅢ 1.5 μL，SacⅡ 1 μL，1.5×T+BSA Buffer 33 μL，ddH2O 6.5 μL，總體積 50 μL。將目的基因亞克隆至pEGFP-N1載體，構(gòu)建pEGFP-duIFITM1重組質(zhì)粒，并測(cè)序驗(yàn)證其正確性。

按照OMEGA公司的Endo-Free質(zhì)粒提取試劑盒相關(guān)指南提取重組質(zhì)粒。用 FuGENE? HD Transfection Reagent 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒將pEGFP和pEGFP-duIFITM1分別轉(zhuǎn)入生長(zhǎng)良好，密度約80%的DELC單層細(xì)胞，每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)三個(gè)重復(fù)，同時(shí)將脂質(zhì)體直接加入細(xì)胞孔作對(duì)照。轉(zhuǎn)染前測(cè)定質(zhì)粒濃度，將2 μg(200～400 ng·μL-1)質(zhì)粒樣本同 100 μL DMEM 混勻；用無(wú)菌Hank’s 液漂洗細(xì)胞數(shù)次，按2∶5比例，把脂質(zhì)體與質(zhì)?；靹蚋凶?0 min，按100 μL·孔-1緩慢加入細(xì)胞培養(yǎng)板；培養(yǎng) 5～6 h后將培養(yǎng)基更換為含10%小牛血清的無(wú)抗生素DMEM；轉(zhuǎn)染 24～48 h 后通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞孔中的熒光。用MTT法檢測(cè)過(guò)表達(dá)duIFITM1對(duì)DELC細(xì)胞活力的影響。

1.7 siRNA干擾 DELC中 duIFITM1的表達(dá)

用生長(zhǎng)至80%的DELC細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按照FuGENE? HD Transfection Reagent說(shuō)明書進(jìn)行操作，將轉(zhuǎn)染試劑與siRNA按照 3∶2比例混合，以O(shè)pti-MEM 培養(yǎng)基補(bǔ)足至體積55 μL，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組。以上溶液輕輕混勻，室溫放置15 min，將脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合體加入各細(xì)胞孔內(nèi)，放入37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，利用 Real-time PCR檢測(cè)duIFITM1蛋白的mRNA表達(dá)水平，篩選有效的siRNA干擾片段。duIFITM1-siRNA序列由InvitrogenTM公司合成，序列見(jiàn)表2。通過(guò)MTT法測(cè)定siRNA 干擾對(duì)DELC細(xì)胞活力的影響。

表2 duIFITM1基因的siRNA序列

1.8 熒光定量PCR驗(yàn)證DELC中duIFITM1轉(zhuǎn)錄情況

用 Real-time PCR 分別對(duì)轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和siRNA 48 h的DELC 中，duIFITM1 mRNA 進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證其轉(zhuǎn)錄情況，所用引物和反應(yīng)條件同“1.5”。

1.9 Western blot驗(yàn)證DELC中duIFITM1表達(dá)情況

將轉(zhuǎn)染48 h的DELC用無(wú)菌PBS漂洗3次，加入RIPA裂解液作用5 min；用橡膠刮刀把瓶壁細(xì)胞刮落；將細(xì)胞懸液冰浴30 min；離心收集上清液，用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒測(cè)定濃度和確定上樣量為 50 μg·孔-1。將待測(cè)樣本進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)入PVDF膜上，用5%的脫脂奶封閉3 h；用TBST 洗滌3次；分別用鼠抗 duIFITM1(1∶400)和鼠抗 GADPH(1∶2 000)作為一抗，4 ℃孵育過(guò)夜；再次TBST漂洗后，加入HRP標(biāo)記的二抗羊抗鼠 IgG(1∶2 000)，室溫孵育30 min，用 TBST清洗4次，用 ECL試劑顯色成像。

1.10 duIFITM1過(guò)表達(dá)和敲減對(duì)DELC中DHAV-3增殖的影響

按前述試驗(yàn)方法和條件將pEGFP-duIFITM1和duIFITM-siRNA分別轉(zhuǎn)染 DELC 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h棄去DMEM，用Hanks 液清洗2次，按100 TCID50接種DHAV-3 SWUNC4 株感作1 h后棄去病毒液，并用 Hanks 液清洗3次，加入維持液放入CO2培養(yǎng)箱連續(xù)觀察。分別收集接毒后24、36、48和60 h的DELC樣本并抽提 RNA。參考文獻(xiàn)中的Taqman熒光定量方法[11]檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)樣本中病毒拷貝數(shù)。同時(shí)，分別測(cè)定 48和60 h的duIFITM1過(guò)表達(dá)和敲減組樣本中 DHAV-3 的 TCID50以確定病毒滴度。將DELC細(xì)胞按104每孔鋪于96孔板中，培養(yǎng)24 h。將DHAV-3用DMEM按10倍倍比稀釋法稀釋(10-2～10-9)，各稀釋度按 0.2 mL·孔-1接入微孔板中，以Reed-Muench法計(jì)算TCID50。

2 結(jié) 果

2.1 測(cè)序結(jié)果與參考基因組的比對(duì)

對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)過(guò)濾處理后，總共得到300 M reads。通過(guò)將clean reads定位到北京鴨基因組之后，發(fā)現(xiàn)基因組的比對(duì)率為68.22%～78.24%；其中，unique 比對(duì)率為53.90%～61.25%(表3)。此外根據(jù)統(tǒng)計(jì)，所有reads的基因比對(duì)率為42.64%～49.38%。根據(jù)基因區(qū)的比對(duì)結(jié)果，作者通過(guò)RESM軟件進(jìn)行了基因的定量處理，標(biāo)準(zhǔn)化方法采用FPKM，總共檢測(cè)出14 175個(gè)編碼基因具有表達(dá)，其中，13 279～13 597個(gè)基因在單樣本中都有表達(dá)。

表3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果和參考基因的比對(duì)

2.2 差異表達(dá)基因的pathway分析

對(duì)各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)水平有顯著差異的基因進(jìn)一步作 KEGG pathway 富集分析(圖1)。其中，感染 DHAV-3 后12 和24 h 雛鴨肝中的差異表達(dá)基因相關(guān)通路數(shù)量分別為250和195條，兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣本中顯著富集的通路分別為54和20條(FDR<0.05)。此外12 h富集的通路主要集中在TNF 信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路、細(xì)胞因子互作、A型流感相關(guān)通路和TLRs相關(guān)通路等。感染24 h樣本中差異表達(dá)基因則主要富集在A型流感相關(guān)通路、氧化磷酸化過(guò)程、趨化因子相關(guān)信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路、RLRs相關(guān)通路、JAK-STAT 信號(hào)通路和TLRs相關(guān)通路等。根據(jù)KEGG pathway富集分析結(jié)果進(jìn)一步分析抗病毒免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)相關(guān)分子，從感染12和24 h表達(dá)差異基因中分別篩選出147個(gè)和64個(gè)關(guān)鍵基因。其中，duIFIITM1 和duIFITM5在12 h的log2FC值分別為5.452 669 1(P<0.05)和 3.921 245 889(P<0.05), 在24 h的log2FC值分別為10.464 801(P<0.05)和 1.793 824，這提示duIFIITM 可能在雛鴨早期感染DHAV-3過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

2.3 抗DHAV-3感染免疫相關(guān)分子的Real-time PCR驗(yàn)證

通過(guò)對(duì)duIFITM1和duIFITM5兩個(gè)家族成員的real-time PCR驗(yàn)證結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，duIFITM1在DHAV-3感染后的24和36 h分別達(dá)到對(duì)照組的4.42倍和7.14倍(P<0.01)，但 duIFITM5 的水平變化并不明顯。另外，對(duì)其他感染與免疫相關(guān)細(xì)胞因子的 Real-time PCR 法檢測(cè)結(jié)果與RNA-seq技術(shù)檢測(cè)分析結(jié)果基本相符(圖2)。對(duì)上述關(guān)鍵分子的進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在 DHAV-3 感染后的 12～24 h 與小RNA病毒識(shí)別相關(guān)的部分 PPRs 表達(dá)水平未發(fā)生顯著變化，如：RIG-I 和MDA5在 DHAV-3感染后的12和24 h樣本中始終保持在較低水平的表達(dá)，且與對(duì)照組無(wú)顯著差異，但在36 h后mRNA水平迅速上調(diào)到 4.23 倍(P<0.01)和3.61 倍(P<0.05)；對(duì)兩種Ⅰ型干擾素的檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)，IFN-α 和 IFN-β 在12和24 h的表達(dá)量與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異，直至 36 h 才分別達(dá)到對(duì)照組的 5.37 倍(P<0.01)和 2.45倍(P<0.05)。

C.對(duì)照組; V.攻毒組。*.P<0.05; **.P<0.01; ****.P<0.000 1

此外，IRF1和IRF3在介導(dǎo)TLRs和RLRs識(shí)別病原相關(guān)分子產(chǎn)生干擾素過(guò)程和抗病毒免疫相關(guān)的信號(hào)通路交互作用中發(fā)揮著重要作用[12]。本次熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示，在DHAV-3感染12 h后，IRF1和IRF3的表達(dá)水平都顯著持續(xù)上升，表明二者在病毒感染和免疫相關(guān)的分子機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

在本次驗(yàn)證過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，感染后的24 h雛鴨肝中，與炎癥反應(yīng)和組織損傷程度相關(guān)的IL-8和IL-10的mRNA水平均顯著上調(diào)(分別為對(duì)照組的6.47倍和5.69倍)，可能提示病毒感染造成的肝損傷程度在24 h即可達(dá)到較高水平，這與朱玉東等[13]對(duì)DHAV-3人工感染雛鴨誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果相符。

2.4 duIFITM1對(duì)DHAV-3 SWUNC4株在DELC中的抑制作用

2.4.1 pEGFP-duIFITM1重組真核表達(dá)載體的鑒定 對(duì)構(gòu)建好的重組pEGFP-duIFITM1質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，經(jīng)電泳觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)在4 700和450 bp處出現(xiàn)了與預(yù)測(cè)大小相一致的亮帶(圖3)。對(duì)重組質(zhì)粒序列分析并與參考基因序列(NM_001310 823.1)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果核苷酸相似性為100%，表明pEGFP-duIFITM1 構(gòu)建成功。

M.DL5000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1.pEGFP-N1空質(zhì)粒對(duì)照; 2.pEGFP-duIFITM1

2.4.2 重組真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DELC細(xì)胞 將pEGFP-duIFITM1通過(guò)脂質(zhì)體法導(dǎo)入DELC細(xì)胞中，分別在24和48 h于倒置熒光顯微鏡觀察。結(jié)果在pEGFP和pEGFP-duIFITM1轉(zhuǎn)染組均可觀察到清晰的綠色熒光蛋白出現(xiàn)，且duIFITM1基因的引入對(duì)pEGFP綠色熒光的強(qiáng)度沒(méi)有明顯的影響，由此間接證明重組質(zhì)粒被成功轉(zhuǎn)入DELC細(xì)胞，同時(shí)載體蛋白在細(xì)胞中獲得良好的表達(dá)(圖4)。

圖4 pEGFP-IFITM1在DELC中的表達(dá)(bar=100 μm)

2.4.3 duIFITM1過(guò)表達(dá)和siRNA干擾的熒光定量PCR驗(yàn)證 分別收集轉(zhuǎn)染 pEGFP-N1 和 pEGFP-duIFITM1 后 48 h 的 DELC，反復(fù)凍融3次后，Real-time PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后的DELC樣本中，duIFITM1蛋白的mRNA水平顯著高于pEGFP-N1空質(zhì)粒組(P<0.01)，pEGFP-duIFITM1 被成功轉(zhuǎn)入鴨胚肝原代細(xì)胞且高效表達(dá)(圖5A)。

以GAPDH為內(nèi)參基因，Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比duIFITM1-siRNA1、duIFITM1-siRNA2和duIFITM1-siRNA3下調(diào)duIFITM1表達(dá)量分別為 60.6%、55.0%和54.4%，因此，duIFITM1-siRNA1干擾效果更好(P<0.01)(圖5B)，后續(xù)研究選用duIFITM1-siRNA1作為干擾片段。

A.過(guò)表達(dá)；B.siRNA干擾; **.P<0.01

2.4.4 duIFITM1過(guò)表達(dá)和siRNA干擾的Western blot驗(yàn)證 分別刮取轉(zhuǎn)染空載體和 pEGFP-duIFITM1后48 h的DELC細(xì)胞進(jìn)行 SDS-PAGE和Western blot驗(yàn)證，以GADPH 蛋白為內(nèi)參。在 pEGFP-duIFITM1 轉(zhuǎn)染組樣品泳道出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的條帶(15.8 ku)，同時(shí)GADPH內(nèi)參蛋白(36 ku)條帶也清晰可見(jiàn),且表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定。上述結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了duIFITM1在DELC中的成功表達(dá)(圖6A、B)。

用Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染duIFITM1-siRNA1對(duì)DELC細(xì)胞中duIFITM1蛋白表達(dá)情況的影響。結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組，siRNA片段可以有效降低duIFITM1蛋白表達(dá)水平。同時(shí)GADPH內(nèi)參蛋白穩(wěn)定表達(dá)(圖6C、D)。

A、B.過(guò)表達(dá)；C、D.siRNA干擾；A.pEGFP-IFITM1組出現(xiàn)目的條帶；B.GADPH內(nèi)參蛋白；C.si-IFITM1 干擾組目的蛋白表達(dá)量下降；D.GADPH內(nèi)參蛋白

2.4.5 過(guò)表達(dá)和干擾duIFITM1對(duì)DELC活力的影響 細(xì)胞活力測(cè)定結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染 duIFITM1-siRNA、pEGFP-N1和pEGFP-duIFITM1的DELC細(xì)胞在12、24、48、60和72 h等5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OD值均未出現(xiàn)明顯變化，表明上述轉(zhuǎn)染過(guò)程不會(huì)抑制DELC細(xì)胞的活力(圖7)。

圖7 DELC細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的活力測(cè)定

2.5 duIFITM1對(duì)DHAV-3 SWUNC4株在DELC中的抑制作用

分別在過(guò)表達(dá)和siRNA干擾duIFITM1的DELC中接種DHAV-3 SWUNC4株，對(duì)接毒后24、36、48和60 h的細(xì)胞樣本中的病毒核酸含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表4。在接毒后48和60 h，pEGFP-N1組和duIFITM1-siRNA組病毒含量均顯著高于pEGFP-duIFITM1轉(zhuǎn)染組(P<0.01)；同樣，對(duì)48和60 h樣本中病毒滴度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)duIFITM1組病毒lgTCID50·0.2 mL-1值顯著高于pEGFP-N1對(duì)照組(圖8A)。上述結(jié)果證明過(guò)表達(dá)duIFITM1對(duì)DHAV-3在DELC增殖具有明顯的抑制作用。但duIFITM1-siRNA組各時(shí)間點(diǎn)病毒核酸拷貝數(shù)和滴度均與NC組相比沒(méi)有顯著差異(圖8B)，表明降低duIFITM1表達(dá)量不能直接影響DHAV-3在宿主細(xì)胞中的增殖，這也可能與DELC中duIFITM1本底表達(dá)水平較低有關(guān)。

A.duIFITM1過(guò)表達(dá)細(xì)胞中病毒滴度變化；B.duIFITM1干擾細(xì)胞中病毒滴度變化。**.P<0.01

表4 duIFITM1過(guò)表達(dá)和干擾細(xì)胞中DHAV-3含量的變化

3 討 論

根據(jù)IFITMs家族蛋白基因的分子特征及相關(guān)功能目前主要被劃分成了三個(gè)亞家族[14]。第一個(gè)亞家族主要包含在人類發(fā)現(xiàn)的所有與免疫相關(guān)的IFITMs家族蛋白(IFITM1、IFITM2和IFITM3)以及和人IFITMs直系同源的鼠IFITM6和IFITM7[15]。IFITM2和IFITM3基因具有高度的相似性，IFITM1則獨(dú)立形成一個(gè)小分支[16]。IFITM5和IFITM10分別屬于IFITMs的第二個(gè)亞家族和第三個(gè)亞家族，IFITM5在成骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和脾細(xì)胞中產(chǎn)生[17]。近年研究發(fā)現(xiàn)IFITMs多個(gè)家族成員對(duì)不同的病原具有抑制作用[18]，且對(duì)某些病毒的抑制過(guò)程十分迅速，但具體分子機(jī)制尚未明確。如：IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5和IFITM6可通過(guò)與病毒包膜蛋白或入侵相關(guān)蛋白相互作用有效抑制IAV、MARV、EBOV和SARS病毒的入侵[19-20]。IFITM1可抑制HCV在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制[21]。而IFITM1可以在膜融合、內(nèi)吞和核內(nèi)體等多環(huán)節(jié)介導(dǎo)宿主抗CSFV反應(yīng)[22]。部分IFITMs還可能通過(guò)與氧固醇結(jié)合蛋白結(jié)合調(diào)節(jié)膽固醇運(yùn)輸作用，使膽固醇遷入晚期內(nèi)體進(jìn)而阻斷病毒的融合[18]。上述研究表明，IFITMs可能成為新型高效的抗病毒分子?；谶@一思路，本研究采用RNA-seq技術(shù)對(duì)DHAV-3 SWUNC4株感染雛鴨肝臟中mRNA進(jìn)行高通量測(cè)序，并結(jié)合相關(guān)生物信息學(xué)軟件對(duì)獲得的所有轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)感染早期雛鴨肝中的duIFIITM1 和duIFITM5轉(zhuǎn)錄水平明顯升高，這提示duIFIITM 可能在雛鴨早期感染DHAV-3過(guò)程中發(fā)揮重要作用。經(jīng)Real-time PCR驗(yàn)證結(jié)果表明，duIFITM1在DHAV-3感染后的24和36 h顯著上調(diào)，分別為對(duì)照組的4.42倍和7.14倍(P<0.01)，而duIFITM5在24和36 h表達(dá)量沒(méi)有明顯變化，這一趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果相符，提示duIFITM1是DHAV-3感染早期發(fā)揮抗病毒作用的主要干擾素誘導(dǎo)蛋白家族成員之一。隨后，本研究在DELC細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染pEGFP-duIFITM1和duIFITM1-siRNA，構(gòu)建duIFITM1過(guò)表達(dá)和敲減細(xì)胞模型，以驗(yàn)證duIFITM1對(duì)DHAV-3可能存在的抑制作用。結(jié)果顯示，經(jīng)Real-time PCR和Western blot試驗(yàn)驗(yàn)證表明duIFITM1在DELC中獲得穩(wěn)定高效表達(dá)；又分別測(cè)定過(guò)表達(dá)和敲減duIFITM1的DELC中，不同時(shí)間點(diǎn)病毒滴度和核酸含量變化。結(jié)果表明，在接毒后48和60 h，在duIFITM1過(guò)表達(dá)細(xì)胞中DHAV-3滴度及核酸量與pEGFP-N1對(duì)照組和duIFITM1-siRNA組差異顯著(P<0.01)，證明過(guò)表達(dá) duIFITM1 對(duì)DHAV-3 在DELC 增殖具有明顯的抑制作用。

此外，本研究通過(guò)高通量測(cè)序分析共獲得多個(gè)與抗DHAV-3免疫反應(yīng)相關(guān)分子和信號(hào)通路；其中TLRs分子表達(dá)上調(diào)和相關(guān)通路的富集出現(xiàn)在感染后12 h，RLRs信號(hào)通路相關(guān)分子的富集出現(xiàn)在24 h。目前，TLRs、RLRs和NLRs三類家族蛋白已被證實(shí)為小RNA病毒分子識(shí)別的主要PPRs[23]；據(jù)此推測(cè)在感染早期 DHAV-3可能存在某種分子逃避機(jī)制使病毒相關(guān)PAMPs在感染初期不能大量激活RLRs，從而為病毒在宿主機(jī)體的潛伏和增殖創(chuàng)造條件；另一種可能是，病毒采取了某種干擾策略抑制了除 TLRs 外的其他兩種 PRRs 的識(shí)別或相關(guān)通路的激活，從而增強(qiáng)病毒對(duì)宿主的侵襲力。類似的抑制作用在 DHAV-1 的感染分子機(jī)制研究中已被證實(shí)，如：DHAV-1 感染 24 h后 RIG-I 和 MDA5 的表達(dá)水平均顯著下調(diào)，提示病毒對(duì) RLRs 具有抑制作用[24]。本研究進(jìn)一步對(duì)表達(dá)差異顯著的12個(gè)免疫和炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵分子進(jìn)行了Real-time PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，在 DHAV-3 感染12～24 h 樣本中RIG-I 和 MDA5 的mRNA維持在較低水平，但36 h的表達(dá)量顯著上升，這間接印證了關(guān)于病毒早期感染過(guò)程中存在逃避RLRs識(shí)別機(jī)制的假設(shè)，也表明DHAV-3對(duì)宿主的感染過(guò)程更傾向于選擇免疫逃避策略而非類似 DHAV-1的免疫抑制。通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)還發(fā)現(xiàn)感染早期 RIG-I 和 MDA5 的表達(dá)水平較低與 IFN-α/IFN-β 早期表達(dá)滯后的變化趨勢(shì)一致。目前研究已表明，RLRs 對(duì) PAMP的識(shí)別后激活 IRF3 和 NF-κB 的磷酸化過(guò)程是Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的重要分子機(jī)制之一，結(jié)合本研究結(jié)果，作者認(rèn)為 DHAV-3感染早期IFN-α 和 IFN-β 的產(chǎn)生相對(duì)滯后與 RIG-I 和 MDA5 分子保持較低的表達(dá)水平有關(guān)。另一方面，兩種干擾素表達(dá)水平變化與duIFITM1顯著上升的趨勢(shì)并不一致，這提示DHAV-3感染早期duIFITM1可能還受到其他細(xì)胞因子或蛋白的調(diào)節(jié)。當(dāng)前已有研究發(fā)現(xiàn)，除干擾素外，IL-6和抑癌蛋白M也可誘導(dǎo)部分IFITMs的表達(dá)上調(diào)[25]。進(jìn)一步深入探索duIFITM1誘導(dǎo)因子類型及其水平變化可能為以其作為新型抗病毒分子提供幫助。

4 結(jié) 論

首次證實(shí)duIFITM1抑制DHAV-3在DELC增殖，豐富了IFITMs抗病毒研究的相關(guān)資料，為以此開(kāi)發(fā)新型抗病毒藥物奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)，對(duì)雛鴨機(jī)體早期抗病毒免疫的多個(gè)關(guān)鍵分子的表達(dá)水平變化規(guī)律進(jìn)行了系統(tǒng)研究和分析，為DHAV-3感染與免疫的分子機(jī)制深入探索提供重要參考。