蔡為民，李文靜，王樂(lè)樂(lè)，蘇丁澤陽(yáng)，朱 玉，劉丹丹，許金俊，陶建平

(揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009)

雞球蟲(chóng)病是由艾美耳球蟲(chóng)(Eimeria)寄生于雞腸道引起的一種寄生性原蟲(chóng)病，給全球養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。雞球蟲(chóng)生活史包括裂殖生殖、配子生殖和孢子生殖三個(gè)階段，孢子生殖形成的孢子化卵囊被雞食入后，在腸道內(nèi)釋放子孢子，子孢子侵入腸黏膜上皮細(xì)胞進(jìn)行裂殖生殖，接著進(jìn)行配子生殖，最后形成卵囊。卵囊隨糞便排出體外，在外界環(huán)境中進(jìn)行孢子生殖，形成具有感染性的孢子化卵囊[3]。因此，卵囊是球蟲(chóng)在宿主間傳播的重要形式。球蟲(chóng)卵囊有一堅(jiān)韌的卵囊壁，主要由來(lái)自大配子成壁體上的配子體蛋白[3-4]。毒害艾美耳球蟲(chóng)配子體抗原EnGAM22是卵囊壁的前體蛋白，在本實(shí)驗(yàn)室前期研究中對(duì)該抗原基因進(jìn)行了克隆與原核表達(dá)，重組蛋白免疫雞后對(duì)毒害艾美耳球蟲(chóng)(Eimerianecatrix)感染有一定的免疫保護(hù)力[5]。但該蛋白如何參與卵囊壁的形成尚不清楚。單克隆抗體具有高特異性和靈敏性，與免疫熒光、免疫電鏡等技術(shù)結(jié)合可將目的抗原在蟲(chóng)體中定位，是研究寄生蟲(chóng)蟲(chóng)體細(xì)微結(jié)構(gòu)和發(fā)育分子機(jī)制的重要檢測(cè)工具，對(duì)寄生蟲(chóng)病的免疫治療與機(jī)理研究具有重大意義[6]。迄今，關(guān)于雞球蟲(chóng)配子體蛋白單克隆抗體的研究較少，Krücken等[7]和Wiedmer等[8]研究發(fā)現(xiàn)針對(duì)EtGAM56單克隆抗體E2E5可以干擾柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的發(fā)育，但有關(guān)E.necatrix單克隆抗體尚未見(jiàn)報(bào)道，因此本研究以原核表達(dá)的重組配子體抗原rEnGAM22免疫BALB/c小鼠制備單克隆抗體，并應(yīng)用單抗進(jìn)行天然蛋白的蟲(chóng)體定位。研究結(jié)果可為球蟲(chóng)卵囊壁形成機(jī)制研究提供工具，也為雞球蟲(chóng)多肽和新型疫苗分子的設(shè)計(jì)及診斷試劑的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、細(xì)胞、蟲(chóng)株

重組菌株pET-28a(+)-Engam22/BL21由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院張小榮老師惠贈(zèng)；毒害艾美耳球蟲(chóng)(Eimerianecatrix)、柔嫩艾美耳球蟲(chóng)(E.tenella)、堆型艾美耳球蟲(chóng)(E.acervulina)、巨型艾美耳球蟲(chóng)(E.maxima)均由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院寄生蟲(chóng)病學(xué)教研室建株并定期傳代保種。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALB/c與ICR小鼠，購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。黃羽雞，購(gòu)自江蘇省海門(mén)市京海肉雞集團(tuán)公司，雛雞孵出后即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)在無(wú)球蟲(chóng)卵囊污染的籠具和環(huán)境中，飼喂不添加抗球蟲(chóng)藥物的全價(jià)飼料，雞自由采食。

1.3 主要試劑

High Affinity Ni-Charged Resin親和純化層析柱、Protein G純化介質(zhì)購(gòu)自金斯瑞生物科技公司；HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG購(gòu)自BBI公司；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(6×)、TMB顯色液均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；QuickAntibody-Mouse 3 W、腹水專用佐劑和小鼠單抗Ig類亞型鑒定用酶標(biāo)二抗均購(gòu)自北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司；PEG1500購(gòu)自Sigma公司；硝酸纖維素膜購(gòu)自默克公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)自Tanon公司；FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG購(gòu)自KPL公司；小牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自上海生工生物有限公司；Brofdrod蛋白定量試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。鼠抗rEnGAM22多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備保存。

1.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化及鑒定

參照劉丹丹[5]的方法大量制備rEnGAM22蛋白，并經(jīng)Western blot鑒定其與抗毒害艾美耳球蟲(chóng)康復(fù)血清反應(yīng)特異性。重組蛋白經(jīng)不同濃度尿素透析復(fù)性純化后，存于-80 ℃冰箱備用。

1.5 間接ELISA檢測(cè)方法的建立

采用方陣滴定法確定重組抗原rEnGAM22的最佳包被濃度，并測(cè)定小鼠血清抗體效價(jià)。將重組抗原rEnGAM22用碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)從4 μg·mL-1倍比稀釋到0.125 μg·mL-1包被酶標(biāo)板，4 ℃過(guò)夜后用1% BSA封閉液封閉；用PBS將待檢血清以及陰性血清從1∶200倍比稀釋到1∶25 600，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，用PBS按照1∶20 000倍稀釋(說(shuō)明書(shū)推薦倍數(shù))；TMB顯色液37 ℃避光作用15 min，2 mol·L-1H2SO4終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD450 nm值。當(dāng)待檢血清OD450 nm值/陰性血清OD450 nm值≥2.1(即P/N ≥ 2.1)，判定為陽(yáng)性。選擇小鼠待檢血清孔OD450 nm值接近于1.0且P/N值最大時(shí)，待檢孔的抗原包被濃度為最佳包被濃度[9]。

1.6 動(dòng)物免疫與單抗制備

取重組抗原rEnGAM22與Quick Antibody-Mouse 3W免疫佐劑1∶1混合后，免疫3只BALB/c小鼠，20 μg·只-1，100 μL·只-1，腿部肌內(nèi)注射；首免后第二周進(jìn)行第二次免疫，第三周進(jìn)行眼眶后靜脈叢采血，建立ELISA方法并檢測(cè)小鼠血清抗體效價(jià)。效價(jià)合格后加強(qiáng)免疫，隨后第3天取小鼠脾制備脾細(xì)胞，參照馬琰等[10]的方法將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按照1∶10混合后加入PEG1500誘導(dǎo)細(xì)胞融合；用建立的ELISA方法進(jìn)行3次陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的篩選，用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行4次亞克隆，最終獲得能穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞。將稀釋好的1×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞腹腔注射10周齡提前致敏的BALB/c小鼠，接種后第7天小鼠腹圍變大，行動(dòng)遲緩，用無(wú)菌注射器針頭抽取小鼠腹水，用Protein G親和層析柱純化小鼠腹水單抗。

1.7 單克隆抗體效價(jià)測(cè)定以及亞型鑒定

用建立的ELISA方法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞上清以及小鼠腹水單抗效價(jià)檢測(cè)。設(shè)置陰、陽(yáng)性小鼠血清對(duì)照孔，雜交瘤細(xì)胞上清用PBS從1∶100開(kāi)始倍比稀釋，腹水單抗首孔用PBS從1∶1 000開(kāi)始倍比稀釋。單克隆抗體的亞型鑒定選用北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司酶標(biāo)二抗即用套裝，操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.8 單克隆抗體的特異性鑒定

1.8.1 雞球蟲(chóng)天然配子體蛋白提取物的制備 將毒害艾美耳球蟲(chóng)(2×104)、柔嫩艾美耳球蟲(chóng)(2×104)、堆型艾美耳球蟲(chóng)(1×105)、巨型艾美耳球蟲(chóng)(5×104)孢子化卵囊分別經(jīng)嗉囊接種30日齡無(wú)球蟲(chóng)感染的黃羽雞，分別在感染后卵囊出現(xiàn)的前5 h，每隔1 h剖殺感染球蟲(chóng)的雞，打開(kāi)腸腔，刮取腸黏膜涂片，用生物顯微鏡(10×40倍)觀察小腸或盲腸中配子體的數(shù)量，直至出現(xiàn)大量配子體時(shí)，剖殺全部試驗(yàn)雞，取出腸道，剖開(kāi)腸腔后棄內(nèi)容物，用預(yù)冷PBS沖洗腸道黏膜，用手術(shù)刀片刮取腸黏膜。將腸黏膜在冰浴中超聲裂解(功率30%，超聲2 s，間隙3 s，30 min)，用Broadford蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，分裝保存-80 ℃冰箱備用。

1.8.2 特異性鑒定 將重組抗原rEnGAM22，毒害艾美耳球蟲(chóng)、柔嫩艾美耳球蟲(chóng)、巨型艾美耳球蟲(chóng)、堆型艾美耳球蟲(chóng)天然配子體蛋白提取物加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液煮沸10 min后離心，取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳；轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，轉(zhuǎn)印結(jié)束后置于含30 g·L-1BSA封閉液中4 ℃過(guò)夜；雜交瘤細(xì)胞上清原液為一抗，室溫孵育50 min；二抗為HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，用30 g·L-1BSA封閉液按1∶25 000倍稀釋(說(shuō)明書(shū)推薦倍數(shù))，室溫孵育40 min；ECL顯色，Tanon5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果并掃描拍照。

1.9 EnGAM22蛋白在蟲(chóng)體中的定位

雛雞感染毒害艾美耳球蟲(chóng)144和156 h后分別撲殺，取盲腸黏膜組織涂布于載玻片上，自然干燥后用預(yù)冷的甲醇作用10 min；隨后用0.1% Triton X室溫作用10 min，100 g·L-1山羊血清封閉1 h；一抗為雜交瘤細(xì)胞上清，37 ℃孵育1 h；二抗為FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG，用100 g·L-1山羊血清按1∶100倍稀釋(說(shuō)明書(shū)推薦倍數(shù))，37 ℃孵育1 h；滴加抗熒光淬滅液，封片，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 獲得并鑒定重組抗原rEnGAM22

純化復(fù)性后的重組抗原rEnGAM22在約29 ku處有一單一條帶(圖1A)。經(jīng)Western blot分析重組抗原rEnGAM22在29 ku處能與抗毒害艾美耳球蟲(chóng)康復(fù)血清發(fā)生特異性反應(yīng)(圖1B)，而組氨酸標(biāo)簽蛋白未發(fā)生反應(yīng)。經(jīng)過(guò)透析復(fù)性濃縮后，重組抗原濃度為1.8 g·L-1。

M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.rEnGAM22蛋白；2.組氨酸標(biāo)簽蛋白；3.rEnGAM22蛋白

2.2 間接ELISA方法測(cè)定免疫小鼠血清抗體效價(jià)

間接ELISA方陣滴定結(jié)果表明，當(dāng)重組抗原質(zhì)量濃度為0.125 μg·mL-1，血清稀釋度為1∶25 600時(shí)，陽(yáng)性血清OD450 nm值最接近1.0，且P/N 值最大，確定重組抗原rEnGAM22的最佳包被濃度為0.125 μg·mL-1，小鼠血清抗體效價(jià)均達(dá)到1∶10 000以上，加強(qiáng)免疫第3 天取小鼠脾制備脾細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞融合。

2.3 獲得穩(wěn)定的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株

待融合細(xì)胞長(zhǎng)至底面積的1/3時(shí)，用建立好的ELISA方法進(jìn)行陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的篩選并及時(shí)對(duì)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行亞克隆，4次亞克隆之后獲得兩株能穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為2F3和3D3。將雜交瘤細(xì)胞連續(xù)傳代并收集細(xì)胞上清，用間接ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞上清抗體效價(jià)，結(jié)果表明復(fù)蘇后的雜交瘤細(xì)胞仍能穩(wěn)定分泌抗體，說(shuō)明雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定性較好。

2.4 腹水的純化

采用Protein G親和層析純化法純化小鼠腹水，純化后的腹水單抗均可見(jiàn)1條大小為50 ku的重鏈以及1條大小為25 ku的輕鏈，未見(jiàn)其他雜帶，表明腹水單抗純化效果較好(圖2)。

M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.純化后2F3腹水單抗；2.純化后3D3腹水單抗

2.5 單克隆抗體效價(jià)測(cè)定以及亞類鑒定

將純化的重組抗原rEnGAM22包被酶標(biāo)板，測(cè)定雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清、腹水效價(jià)以及鑒定抗體亞類。腹水單抗效價(jià)明顯高于細(xì)胞上清效價(jià)，單抗2F3和3D3亞型分別為IgG2a和IgG2b(表1)。

表1 單抗的效價(jià)和亞類鑒定

2.6 球蟲(chóng)天然配子體蛋白提取物的濃度測(cè)定及定量

用Broadford蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，毒害艾美耳球蟲(chóng)天然配子體蛋白提取物濃度為1.69 g·L-1，柔嫩艾美耳球蟲(chóng)為1.68 g·L-1，堆型艾美耳球蟲(chóng)為2.02 g·L-1，巨型艾美耳球蟲(chóng)為1.47 g·L-1。

2.7 單克隆抗體的特異性鑒定

2.7.1 對(duì)重組抗原進(jìn)行特異性識(shí)別 Western blot結(jié)果顯示，單抗2F3和3D3均能特異性識(shí)別重組抗原rEnGAM22，大小在29 ku左右，而不與組氨酸標(biāo)簽蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)(圖3)。

M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.重組抗原rEnGAM22；2.組氨酸標(biāo)簽蛋白

2.7.2 對(duì)毒害艾美耳球蟲(chóng)天然配子體蛋白特異性識(shí)別 Western blot結(jié)果顯示，單抗2F3和3D3均能特異性識(shí)別毒害艾美耳球蟲(chóng)配子體約37 ku大小的天然目的蛋白(圖4A、B)，而鼠抗rEnGAM22多抗識(shí)別的天然目的蛋白條帶大小在35～37 ku之間(圖4C)，表明單抗2F3和3D3能特異性識(shí)別蟲(chóng)體中天然的rEnGAM22抗原。

M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.配子體蛋白提取物

2.7.3 對(duì)異種雞球蟲(chóng)天然配子體蛋白特異性識(shí)別 Western blot結(jié)果顯示，單抗2F3和3D3均不能識(shí)別柔嫩、堆型、巨型艾美耳球蟲(chóng)天然配子體蛋白(圖5A、B)，而用鼠抗rEnGAM22多抗檢測(cè)時(shí)，在柔嫩、堆型、巨型艾美耳球蟲(chóng)配子體蛋白提取物中均出現(xiàn)小于17 ku的非特異性條帶(圖5C)，表明單抗2F3和3D3的特異性較鼠抗rEnGAM22多抗要好。

M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.柔嫩艾美耳球蟲(chóng)；2.堆型艾美耳球蟲(chóng)；3.巨型艾美耳球蟲(chóng)

2.8 EnGAM22蛋白在毒害艾美耳球蟲(chóng)蟲(chóng)體中定位

以兩株單抗為一抗，對(duì)配子體蛋白EnGAM22進(jìn)行蟲(chóng)體內(nèi)定位(圖6)。結(jié)果顯示，配子體蛋白EnGAM22定位在大配子體的成壁體與卵囊的卵囊壁(圖6h～k)，未出現(xiàn)在第三代裂殖子(圖6g)，表明EnGAM22蛋白參與卵囊壁的形成。

a～f.光鏡下的第三代裂殖子(MZ)、卵囊(O)、配子體(GAM)；g～l.免疫熒光定位結(jié)果；m～r.蟲(chóng)體自發(fā)熒光。g、h、i.McAb 2F3；j.McAb 3D3；k.鼠抗rEnGAM22多抗；l.小鼠陰性血清

3 討 論

高純度的免疫原是制備單克隆抗體的關(guān)鍵[11]，天然蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜[12]，難以達(dá)到較高純度，而原核表達(dá)的重組抗原易獲得且表達(dá)量和純度較高，因此本研究選擇用重組抗原rEnGAM22作為免疫原制備單克隆抗體。pET-28a(+)原核表達(dá)載體中組氨酸標(biāo)簽蛋白雖然為小分子量多肽，但可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗組氨酸標(biāo)簽蛋白的抗體[13]。為此，在本研究中篩選第一次陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞時(shí)采用平行對(duì)照，即將重組抗原rEnGAM22以及組氨酸標(biāo)簽蛋白同時(shí)作為檢測(cè)原，用建立的間接ELISA方法篩選雜交瘤細(xì)胞，而且在單克隆抗體的特異性鑒定中將組氨酸標(biāo)簽蛋白作為對(duì)照進(jìn)行單克隆抗體的特異性驗(yàn)證，以確保準(zhǔn)確篩選出分泌特異性抗體的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞。結(jié)果成功制備了兩株抗配子體抗原EnGAM22單克隆抗體2F3和3D3，亞型分別為IgG2a、IgG2b，特異性強(qiáng)，純化后腹水效價(jià)分別為1∶256 000、1∶64 000。

用單抗2F3和3D3以及鼠抗rEnGAM22多抗對(duì)雞球蟲(chóng)配子體蛋白提取物進(jìn)行Western blot檢測(cè)時(shí)，兩株單抗在毒害艾美耳球蟲(chóng)配子體蛋白提取物中僅檢測(cè)到一大小為37 ku的特異性條帶，在柔嫩、堆型與巨型艾美耳球蟲(chóng)配子體蛋白提取物中未檢出任何條帶，而鼠抗rEnGAM22多抗在毒害艾美耳球蟲(chóng)配子體蛋白提取物中檢測(cè)到大小為35～37 ku的3條帶，在柔嫩、堆型與巨型艾美耳球蟲(chóng)配子體蛋白提取物中檢到小于17 ku的非特異條帶，這一結(jié)果表明單抗2F3和3D3的特異性較鼠抗rEnGAM22多抗要強(qiáng)。此外，EnGAM22蛋白按其基因序列推導(dǎo)的理論分子量為21.38 ku[14]，但用單抗2F3和3D3檢測(cè)毒害艾美耳球蟲(chóng)配子體蛋白提取物，檢測(cè)到的EnGAM22天然蛋白分子量為37 ku，這一現(xiàn)象同樣見(jiàn)于巨型艾美耳球蟲(chóng)配子體蛋白EmGAM82和EmGAM56、以及柔嫩艾美耳球蟲(chóng)配子體蛋白EtGAM22，究其原因可能是球蟲(chóng)配子體蛋白中存在不尋常氨基酸組成所致[15]。

球蟲(chóng)卵囊壁為一雙層結(jié)構(gòu)，主要有蛋白質(zhì)和脂類組成，在蛋白質(zhì)分子間有二酪氨酸鍵交聯(lián)，故卵囊壁可自發(fā)藍(lán)色熒光[16]。球蟲(chóng)配子體蛋白是卵囊壁的前體蛋白，在配子生殖階段特異性表達(dá)[3]。Wiedmer等[17]用抗大鼠E.nieschulzi大配子體的單克隆抗體鑒定出一種富含酪氨酸的糖蛋白EnGAM82，并定位于Ⅱ型成壁體上。本研究用單抗2F3和3D3對(duì)配子體蛋白EnGAM22進(jìn)行蟲(chóng)體內(nèi)定位時(shí)，在第三代裂殖子中未檢測(cè)出蛋白，而在發(fā)育中的配子體和卵囊中均檢測(cè)出蛋白，且蛋白均定位在配子體的成壁體和卵囊壁上，與用鼠抗rEnGAM22多抗定位結(jié)果一致，也與劉丹丹等[14]的研究結(jié)果相一致，顯示EnGAM22蛋白參與卵囊壁的形成，這也表明單抗2F3和3D3可用作研究卵囊壁形成機(jī)制的分子工具。

單克隆抗體與多克隆抗體相比，具有無(wú)限量生產(chǎn)、高度的特異性和均一性等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于球蟲(chóng)新基因和新抗原篩選、發(fā)育過(guò)程與致病機(jī)理探索、疾病診斷和預(yù)防治療等方面的研究[18]。Wallach等[19]用抗配子體蛋白EmGAM56的單抗被動(dòng)免疫雛雞，可對(duì)巨型艾美耳球蟲(chóng)感染產(chǎn)生一定免疫保護(hù)力，與非免疫對(duì)照組相比，免疫雞的卵囊產(chǎn)量減少40%～50%。Karim等[20]用柔嫩艾美耳球蟲(chóng)卵囊壁蛋白制備的單抗(C11B9F3)免疫的雛雞，與非免疫對(duì)照組相比，免疫雞感染同種球蟲(chóng)—柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的卵囊產(chǎn)量降低42%～54%，感染異種球蟲(chóng)—巨型艾美耳球蟲(chóng)的卵囊產(chǎn)量降低35%。本研究研制的單抗2F3和3D3是否具有被動(dòng)免疫保護(hù)作用有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

成功制備了兩株抗毒害艾美耳球蟲(chóng)配子體抗原EnGAM22單克隆抗體2F3和3D3，其亞型分別為IgG2a和IgG2b，特異性強(qiáng)；用單抗免疫熒光定位結(jié)果顯示，EnGAM22蛋白參與卵囊壁的形成，表明單抗2F3和3D3可用作研究卵囊壁形成機(jī)制的分子工具。