周 力，高占紅，侯生珍，楊葆春，王志有，桂林生

(青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016)

黑藏羊俗稱黑裘皮羊，以生產(chǎn)黑色二毛裘皮著稱，是藏系綿羊中重要的經(jīng)濟(jì)類群[1]。當(dāng)前黑藏羊產(chǎn)業(yè)由生產(chǎn)裘皮向肉用逐步轉(zhuǎn)型，若能了解其肌纖維類型分布以及肉質(zhì)等變化規(guī)律，對于保護(hù)地方品種資源，提高農(nóng)牧民經(jīng)濟(jì)收入以及推動青海特色畜牧業(yè)發(fā)展均具有重要意義。長期以來，羊肉產(chǎn)品以高蛋白、低脂肪、低膽固醇、味道鮮美、富含維生素和礦物質(zhì)特征而備受青睞。羊肉肉質(zhì)主要受飼料種類、飼養(yǎng)方式以及遺傳因素的影響[2]，肉羊年齡也是一個重要方面[3]。研究發(fā)現(xiàn)，相對于50日齡羔羊，100日齡的羔羊肉中干物質(zhì)、總蛋白質(zhì)和粗蛋白質(zhì)含量更高，而50日齡的羔羊肉則具有更強(qiáng)的持水力[4]。其他試驗(yàn)也表明，不同年齡組間牦牛背最長肌中過氧化氫酶、總超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和總抗氧化能力差異均不顯著，但隨著年齡的增長，丙二醛含量不斷上升，4.5歲組比1.5歲組升高了53.80%[5]。由此可以看出，不同發(fā)育時期反芻動物肌肉中營養(yǎng)成分與抗氧化能力均存在一定差異性。

肌纖維類型是決定肌肉特性的重要因素，根據(jù)肌動蛋白重鏈上ATP酶對酸堿的穩(wěn)定性可以將肌纖維分成3種類型，即Ⅰ型(慢速氧化型肌纖維)、ⅡA型(快速氧化型肌纖維)和ⅡB型(快速酵解型肌纖維)[6]。王麗莎等[7]指出，不同類型的肌纖維代表著不同的結(jié)構(gòu)、功能及代謝特征。當(dāng)肌肉中氧化型肌纖維所占比例較高時，肌肉細(xì)嫩多汁，系水力強(qiáng)，肉質(zhì)也較好[8]。以土耳其地方綿羊品種為研究對象，發(fā)現(xiàn)肌纖維的形態(tài)特性，如肌纖維類型、數(shù)目和直徑會對肉品質(zhì)產(chǎn)生重要的影響[9]。日糧添加乳酸菌試驗(yàn)表明[10]，可以通過提高氧化型肌纖維的比例改善肌肉色澤，提高肌肉嫩度，繼而改善蘇尼特羊肉品質(zhì)。在肉羊上也進(jìn)一步證實(shí)，肌球蛋白重鏈基因表達(dá)水平的變化能夠反映肌纖維類型轉(zhuǎn)化的程度[11]。由此可知，肉質(zhì)特性受年齡的影響較大，且不同年齡的肌肉品質(zhì)與其肌纖維類型以及MyHCs基因的mRNA表達(dá)量差異關(guān)系密切。

目前，現(xiàn)階段有關(guān)黑藏羊的研究相對匱乏，僅有針對不同性別黑藏羊肉品質(zhì)特性的差異分析[12]?；诖?，本試驗(yàn)以自然放牧條件下的初生羔羊和成年黑藏羊?yàn)樵囼?yàn)對象，通過對其肌肉常規(guī)營養(yǎng)成分、抗氧化能力、肌纖維組織學(xué)特性及其MyHCs基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析比較，進(jìn)而為開展青海黑藏羊肉品質(zhì)相關(guān)研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

試驗(yàn)選用青海省海北州貴南縣自然放牧條件下發(fā)育正常、健康無病的初生黑藏羊公羔(平均體重(2.31±0.49)kg)和12月齡成年黑藏羊公羊(平均體重(36.58±1.26)kg)各5只。試驗(yàn)羊只屠宰后，采集其左側(cè)胴體第12～13肋骨間背最長肌，液氮保存待用。

包埋劑(日本Sakura公司)，二甲苯(廣東光華科技股份有限公司)，乙醇(天津富宇精細(xì)化工有限公司)，總抗氧化能力、丙二醛含量，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶活性試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)，RNA Prep Pure總RNA(動物組織)提取試劑盒D431，F(xiàn)astQuant cDNA第一鏈合成試劑盒(去基因組)KR106和SuperReal PreMix Color(SYBR Green)試劑盒等均購自北京天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

德國LEICA切片機(jī)(德國Leica公司)；美國Bio-Rad伯樂凝膠成像分析系統(tǒng)(北京賽百奧科技有限公司)；羅氏實(shí)時熒光定量PCR儀(北京眾力挽生物科技有限公司)；科華酶標(biāo)儀(上?？迫A生物工程有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 肌肉常規(guī)營養(yǎng)成分測定 水分(moisture)含量參照GB5009.3—2016進(jìn)行測定；粗灰分(ash)含量參照GB5009.4—2016進(jìn)行測定；粗蛋白(crude protein, CP)含量參照GB/T5009.5—2016進(jìn)行測定；粗脂肪(ether extract, EE)含量參照GB 5009.6—2016進(jìn)行測定。

1.3.2 肌肉抗氧化指標(biāo)檢測 抗氧化指標(biāo)包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性，總抗氧化能力及丙二醛含量，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.3 肌纖維組織形態(tài)學(xué)特性測定

1.3.3.1 樣品采集和制片：將樣品沿著肌纖維的橫向方向切成0.5 cm×0.5 cm×1.0 cm大小的肉樣，經(jīng)過預(yù)冷的異戊烷干燥30 s后，將肉塊放入冰凍切片機(jī)內(nèi)進(jìn)行切片(厚度約8 μm)，再利用堿孵育ATPase對黑藏羊背最長肌進(jìn)行染色。

1.3.3.2 肌纖維各項(xiàng)指標(biāo)分析：利用顯微鏡彩圖分析軟件在20×10倍下觀察并分析肌纖維組織學(xué)特性的相關(guān)指標(biāo)。每個片子隨機(jī)選取3～5個視野，使測定的肌纖維總數(shù)大于1 500根。1)肌纖維直徑(muscle fiber diameter)：測量每根肌纖維橫截面最長兩點(diǎn)距離，作為長軸，垂直于長軸的最短兩點(diǎn)距離，作為短軸，多次測量求其平均值；2)肌纖維橫切面積(muscle fiber cross-sectional area)：圈出視野內(nèi)各型肌纖維的橫截面積，測多根取其平均值；3)肌纖維密度(muscle fiber density)：計(jì)算每個視野的面積，并統(tǒng)計(jì)每個視野內(nèi)肌纖維的根數(shù)，將其換算成每平方毫米的根數(shù)；4)肌纖維數(shù)量比例(number rate of muscle fiber)：每種類型肌纖維數(shù)量除以肌纖維總數(shù)量即為肌纖維數(shù)量比例，公式如(1)所示：

(1)

5)肌纖維面積比例(area rate of muscle fiber)：每種肌纖維總面積除以總肌纖維面積即為肌纖維面積比例，公式如(2)所示：

(2)

1.3.4MyHCs基因表達(dá)量測定 利用動物組織總RNA提取試劑盒提取黑藏羊肌肉中總RNA，利用1.5%瓊脂糖和超微量核酸蛋白儀分別檢測RNA完整性、濃度和純度，將符合要求的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照SuperReal PreMix Color(SYBR Green)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。qPCR反應(yīng)體系為：1.6 μL cDNA模板，上、下游引物各0.8 μL，2×SuperReal Color PreMix 10 μL，RNase-free ddH2O 6.8 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性 15 min，95 ℃變性 10 s，60 ℃退火/延伸 30 s，40個循環(huán)。引物由上海生工生物設(shè)計(jì)合成。內(nèi)參基因(GAPDH)和目的基因(MyHCI、MyHCⅡA及MyHCⅡB)序列如表1所示。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

本研究采用2-ΔΔCt法作為目的基因表達(dá)量的分析方法[13]，試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel(2020)初步計(jì)算處理，在初生羔羊和成年羊間的數(shù)據(jù)差異作獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)”表示，以P<0.05作為顯著性判斷的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 不同生長期黑藏羊背最長肌常規(guī)營養(yǎng)成分的比較

由表2可知，相較于初生羔羊，成年羊背最長肌中水分(moisture)、灰分(ash)、粗蛋白(CP)以及粗脂肪(EE)含量差異均不顯著(P>0.05)。這說明黑藏羊肌肉中營養(yǎng)成分的含量受年齡影響較小。

表2 黑藏羊肌肉常規(guī)營養(yǎng)成分指標(biāo)分析

2.2 不同生長期黑藏羊背最長肌抗氧化能力的比較

由表3可知，與初生羔羊相比，成年羊背最長肌中總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)含量，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)以及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性差異均不顯著(P>0.05)。這表明不同發(fā)育階段對黑藏羊肌肉抗氧化能力影響不顯著。

表3 黑藏羊肌肉抗氧化指標(biāo)分析

2.3 不同生長期黑藏羊背最長肌組織形態(tài)學(xué)特性的比較

肌纖維直徑分析結(jié)果如圖1所示。初生羔羊背最長肌肌纖維直徑Ⅰ型、ⅡA型和ⅡB型均顯著小于成年羊(P<0.05)。由此可見，不同年齡階段黑藏羊肌纖維直徑Ⅰ型、ⅡA型和ⅡB型差異較大。

*表示差異顯著(P<0.05)，下同

肌纖維橫截面積分析結(jié)果如圖2所示。成年羊背最長肌肌纖維橫截面積Ⅰ型、ⅡA型和ⅡB型均顯著高于初生羔羊(P<0.05)。由此可知，不同發(fā)育時期對黑藏羊肌纖維橫截面積Ⅰ型、ⅡA型和ⅡB型具有明顯的影響。

圖2 不同生長期黑藏羊背最長肌肌纖維橫截面積的比較

肌纖維密度分析結(jié)果如圖3所示。初生羔羊背最長肌肌纖維密度Ⅰ型、ⅡA型和ⅡB型均高于成年羊，其中2組間肌纖維密度Ⅰ型、ⅡA型和ⅡB型差異顯著(P<0.05)。由此揭示，不同生長時期黑藏羊肌纖維密度Ⅰ型、ⅡA型和ⅡB型存在一定的差異。

圖3 不同生長期黑藏羊背最長肌肌纖維密度的比較

由表4可知，初生羔羊背最長?、裥图±w維數(shù)量比例顯著高于成年羊(P<0.05)。2組間黑藏羊背最長肌肌纖維ⅡA型和ⅡB型差異均不顯著(P>0.05)。據(jù)此可見，隨著黑藏羊年齡的增長，肌肉中Ⅰ型肌纖維數(shù)量比例會明顯減少。

表4 不同生長期黑藏羊背最長肌肌纖維數(shù)量比例的比較

由表5可知，成年羊背最長?、裥秃廷駻型肌纖維面積比例顯著低于初生羔羊(P<0.05)。2組間黑藏羊背最長肌肌纖維ⅡB型差異不顯著(P>0.05)，據(jù)此可知，隨著黑藏羊年齡的變化，肌肉中Ⅰ型和ⅡA型肌纖維面積比例會明顯降低。

表5 不同生長期黑藏羊背最長肌肌纖維面積比例的比較

2.4 不同生長期黑藏羊背最長肌MyHCs基因表達(dá)規(guī)律

黑藏羊MyHCs基因的表達(dá)水平如圖4所示，羔羊背最長肌中MyHCⅠ和MyHCⅡA基因的表達(dá)量顯著低于成年羊(P<0.05)，而MyHCⅡB基因的表達(dá)量則呈現(xiàn)相反的趨勢(P<0.05)。以上結(jié)果說明，不同生長期黑藏羊肌肉中MyHCs基因表達(dá)水平差異明顯。

圖4 黑藏羊MyHCs基因的表達(dá)量(n=5)

2.5 MyHCs基因表達(dá)量與肉品質(zhì)的相關(guān)性分析

通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)(表6)，水分、灰分、總抗氧化能力、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶與MyHCⅠ、MyHCⅡA正相關(guān)；與MyHCⅡB負(fù)相關(guān)，而丙二醛則表現(xiàn)相反趨勢。粗脂肪、谷胱甘肽過氧化物酶與MyHCⅠ、MyHCⅡA之間正相關(guān)，其中與MyHCⅠ顯著正相關(guān)(P<0.05)，但與MyHCIIB負(fù)相關(guān)。粗蛋白質(zhì)與MyHCⅠ、MyHCⅡA之間正相關(guān)，其中與MyHCⅡA呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，但與MyHCⅡB負(fù)相關(guān)。以上結(jié)果表明，黑藏羊背最長肌肌纖維特性與肉品質(zhì)是密切相關(guān)的。

表6 MyHCs表達(dá)量與肉品質(zhì)的相關(guān)性分析

3 討 論

3.1 不同生長期黑藏羊背最長肌常規(guī)營養(yǎng)成分的比較

水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、礦物質(zhì)和維生素等均是羊肉常規(guī)營養(yǎng)成分，其組成和含量是營養(yǎng)價值的直接體現(xiàn)[14]。其中水分含量與肌肉的多汁性關(guān)系密切，若水分含量越高，口感就越好，機(jī)體更易消化吸收?；曳趾吭蕉?，意味著肌肉中所含礦物質(zhì)元素和部分微量元素的含量也就越高[15]。本試驗(yàn)中，羔羊和成年羊背最長肌中水分和灰分含量差異不顯著。說明隨著黑藏羊年齡的增長，肌肉的多汁性以及礦物質(zhì)含量沒有發(fā)生明顯的變化。粗蛋白和粗脂肪的含量直接決定著肌肉的營養(yǎng)價值[16]。研究發(fā)現(xiàn)，3歲羊肌內(nèi)脂肪含量極顯著高于4月齡羔羊[17]。其他試驗(yàn)也表明，隨著湖羊年齡的增長，肌肉中除水分降低外，粗脂肪、粗蛋白質(zhì)、粗灰分、鈣和磷的含量逐漸增加，且成年羊與初生羔羊和斷奶羔羊間差異顯著[18]。孟凡珠等[19]也證實(shí)，在天然放牧條件下，隨著年齡的增長，蘇尼特羊臂三頭肌、股二頭肌和臀肌粗脂肪含量均顯著提高，增加了新鮮肉的風(fēng)味。以上研究結(jié)論表明，年齡對肌肉粗脂肪以及粗蛋白含量具有明顯的影響。而本試驗(yàn)卻發(fā)現(xiàn)不同生長時期黑藏羊肌肉中粗蛋白與粗脂肪含量差異不顯著，這與上述研究結(jié)論不一致，究其原因可能是品種、飼養(yǎng)環(huán)境、放牧?xí)r間以及屠宰年齡等不同造成的。

3.2 不同生長期黑藏羊背最長肌抗氧化能力的比較

一般而言，機(jī)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡中。而當(dāng)自由基生成量增加或自由基清除能力下降時，則發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)[20]。自由基能夠使組織器官受到氧化損傷，降低機(jī)體免疫力，從而導(dǎo)致疾病發(fā)生[21]。因此，測定肌肉中抗氧化能力，能夠反映黑藏羊健康狀況，為其不同生長發(fā)育階段提供理論參考。一般認(rèn)為總抗氧化能力、谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶以及丙二醛等是衡量機(jī)體抗氧化能力強(qiáng)弱的重要標(biāo)志[22]。其中總抗氧化能力是衡量機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的綜合性指標(biāo)[23]，其含量可以直接衡量黑藏羊肌肉中抗氧化防衛(wèi)能力。谷胱甘肽過氧化物酶能夠清除活性氧自由基，作為體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的主要組成部分[24]。超氧化物歧化酶作為保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整、功能完整一種重要的酶[25]。過氧化氫酶可以催化細(xì)胞內(nèi)過氧化氫分解，防止機(jī)體發(fā)生損傷[26]。而丙二醛能夠降低機(jī)體抗氧化酶的活性，反映機(jī)體脂質(zhì)氧化的程度[27]。丙二醛值越低說明肌肉脂質(zhì)氧化程度越低，抗氧化能力就越強(qiáng)[28]。同時肌肉丙二醛含量也可評價生肉新鮮程度的重要指標(biāo)。從本試驗(yàn)來看，羔羊和成年羊背最長肌抗氧化能力差異不顯著。由此可知，隨著黑藏羊年齡的增長，其抗氧化效果并未發(fā)生明顯的改變，這種現(xiàn)象在韓國本地肉牛[29]也有類似的報(bào)道。

3.3 不同生長期黑藏羊背最長肌組織形態(tài)學(xué)特性的比較

肌纖維作為骨骼肌組織的基本組成單位，其類型組成的差異是影響肌肉品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一[30]。由此可見，骨骼肌的生長發(fā)育與動物肌纖維有著密切的聯(lián)系。其生理生化特性的差異以及代謝的特征從而直接影響動物屠宰后肌肉的質(zhì)量。當(dāng)酵解型肌纖維含量高時會使肉的保水性下降，不利于改善肉質(zhì)[31]。王莉[32]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，牦牛肉Ⅰ型肌纖維比例與剪切力呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，即Ⅰ型肌纖維比例越高，剪切力越低，嫩度也就越好。在新疆褐牛與安格斯牛研究表明[33]，3、7、12、24月齡新疆褐牛Ⅰ型肌纖維密度隨著年齡的增大而減少，安格斯牛Ⅰ型肌纖維密度的變化趨勢與新疆褐牛相同，但ⅡB型肌纖維密度隨著年齡變化呈現(xiàn)無規(guī)律變化。此外發(fā)現(xiàn)，1～6歲伊犁馬隨著年齡的增大，三角肌及背闊肌部位肌纖維橫截面積、平均直徑增大，單位面積內(nèi)肌纖維的個數(shù)隨之減少，失水率變小，剪切力增加[34]。其他試驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)，犢牦牛背最長?、裥秃廷駻型肌纖維直徑顯著低于成年牦牛，ⅡB型肌纖維也呈現(xiàn)低于成年牦牛趨勢，但差異不顯著，同時犢牦牛背最長?、裥?、ⅡA型ⅡB型肌纖維橫切面積均顯著低于成年牦牛，但肌纖維密度則呈現(xiàn)相反趨勢[35]。以上研究均說明酵解型肌纖維含量與肌肉品質(zhì)呈負(fù)相關(guān)，肌纖維類型受年齡的影響較大。本試驗(yàn)得出黑藏羊在成年前可以降低酵解型纖維的比例，揭示年齡會影響黑藏羊肌纖維類型的轉(zhuǎn)化，從而影響肌肉的生長發(fā)育。另外本試驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)，粗脂肪和谷胱甘肽過氧化物酶與MyHCⅠ基因表達(dá)豐度呈顯著正相關(guān)，而粗蛋白質(zhì)與MyHCⅡA基因表達(dá)豐度亦呈顯著正相關(guān)。由此可見，肌纖維組織形態(tài)學(xué)特性與其肉品質(zhì)具有緊密的的聯(lián)系。動物出生后肌纖維數(shù)量不再發(fā)生改變，但在年齡影響下肌纖維類型卻可發(fā)生明顯的轉(zhuǎn)化[36]。在蘇尼特羊上試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MyHCⅠ、MyHCⅡA基因表達(dá)量分別與其Ⅰ型和ⅡA型肌纖維的數(shù)量比例呈正相關(guān)關(guān)系，MyHCⅡB表達(dá)量與ⅡB型肌纖維的數(shù)量比例呈正相關(guān)關(guān)系[37]，本試驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)。

4 結(jié) 論

綜上所述，在本試驗(yàn)條件下，隨著年齡的增長，黑藏羊背最長肌肌纖維類型由氧化型纖維(MyHCⅠ和MyHCⅡA)向酵解型纖維(MyHCⅡB)轉(zhuǎn)化，在一定程度上影響了機(jī)體的生長發(fā)育。