許 寫，石東風(fēng)，吳嘉韻，吳圣龍,2，王海飛,2，吳正常,2*，包文斌,2*

(1.揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 江蘇省動物遺傳繁育與分子設(shè)計重點實驗室，揚州 225009；2.揚州大學(xué) 教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實驗室，揚州 225009)

m6A廣泛存在于各種真核生物mRNA和非編碼RNA中，m6A修飾可以功能性地調(diào)節(jié)真核生物的基因轉(zhuǎn)錄表達，從mRNA在細胞核中的加工到在細胞質(zhì)的翻譯和降解，m6A幾乎影響到了動物mRNA代謝的每個階段[1-2]。此外，m6A參與了多種生物學(xué)過程，如干細胞分化、細胞分裂、配子發(fā)生和生物節(jié)律等，以及多種疾病的發(fā)生，包括腫瘤、肥胖和不育等[3]。研究發(fā)現(xiàn)，m6A甲基化修飾在病毒復(fù)制周期中扮演不同角色，在病毒的侵染復(fù)制過程中具有重要調(diào)控作用[4]，同時m6A在免疫系統(tǒng)及其在宿主病原體相互作用中也發(fā)揮作用[5]。相比于人和小鼠，畜禽m6A對重要性狀的調(diào)控作用及其機制研究還不夠深入，關(guān)于豬m6A甲基化修飾的研究主要集中在脂肪沉積[6-7]、脂質(zhì)代謝[8]、卵巢顆粒細胞發(fā)育[9]、多功能干細胞分化[10]和肝發(fā)育[11]等方面，由此表明，m6A甲基化修飾正在成為目前畜禽遺傳領(lǐng)域RNA表觀遺傳學(xué)研究的一個新方向。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)又稱嘔吐毒素，是鐮刀菌的代謝產(chǎn)物之一，是目前農(nóng)產(chǎn)品及飼料中污染率和超標(biāo)率最高的一種霉菌毒素[12-13]。DON易于在人和動物體內(nèi)傳播，主要改變腸道營養(yǎng)吸收、屏障功能和免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)腸道病變[14-15]。腸道是豬機體抵御嘔吐毒素侵害的第一道屏障，霉菌毒素可以直接通過激活細胞信號通路影響腸道黏蛋白的表達，還可以破壞黏液層及緊密連接，有利于病原菌等有害物質(zhì)入侵，激活細胞信號通路或間接影響細胞因子的水平[16]。在涉及到豬腸上皮細胞系(IPEC-J2)的研究中表明，當(dāng)IPEC-J2細胞受到DON的誘導(dǎo)會導(dǎo)致氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，最終會加速細胞的凋亡并使其功能受損[17-18]。然而，迄今為止關(guān)于DON誘導(dǎo)的IPEC-J2細胞中的m6A發(fā)生變化的研究相對較少。研究發(fā)現(xiàn)，METTL3介導(dǎo)m6A修飾在免疫細胞的分化和功能分工上扮演著非常重要的角色，敲除METTL3基因會抑制CD4+T細胞分化，進而引起小鼠腸炎[19]；METTL3通過激活NF-κВ信號通路促進LPS刺激的巨噬細胞活化和炎癥反應(yīng)[20]。

本研究在課題組前期構(gòu)建的嘔吐毒素感染豬小腸上皮(IPEC-J2)細胞研究模型(終濃度為1 μg·mL-1，作用時間48 h)基礎(chǔ)上，探究豬m6A甲基化酶METTL3基因表達水平變化與DON誘導(dǎo)豬小腸上皮細胞損傷的相關(guān)性，以期為今后開展METTL3基因功能及其在抵抗DON損傷的育種工作中應(yīng)用提供參考依據(jù)，為今后細致研究RNA甲基化修飾在仔豬抵抗脫氧雪腐鐮刀菌烯醇損害調(diào)控中的作用機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品及材料

豬腸上皮細胞系(IPEC-J2)由本實驗室保存；人腎上皮細胞系293T購自廣州吉妮歐生物科技有限公司；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)購自美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清(FBS)購自Gibco公司；動物RNA抽提試劑盒(離心柱式)及細胞周期檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR熒光定量試劑盒及細胞增殖檢測試劑均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；ANNEXIN V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒及活性氧檢測試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；甲基化轉(zhuǎn)移酶METTL3基因干擾siRNA及慢病毒均購自蘇州吉瑪基因股份有限公司。

1.2 豬腸上皮細胞系IPEC-J2及人腎上皮細胞系293T細胞培養(yǎng)

將IPEC-J2細胞和人腎上皮細胞系293T細胞以1×106個·孔-1的密度接種于6孔板內(nèi)；使用DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清(FBS)和1%抗生素(10 kU·mL-1青霉素、10 mg·mL-1鏈霉素)組成的完全培養(yǎng)液，將細胞放置在恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃，50 mL·L-1CO2)進行培養(yǎng)。

1.3 siRNA瞬轉(zhuǎn)及干擾效率鑒定

IPEC-J2以5×104個·孔-1的密度接種到12孔板中，待融合度達到60%左右進行細胞轉(zhuǎn)染。每孔的轉(zhuǎn)染體系：向100 μL jetPRIME Buffer加入2 μL siRNA和3 μL jetPRIME reagent，輕輕吹打混勻，室溫孵育15 min。將轉(zhuǎn)染混合物加入孔中，每組3個重復(fù)。24 h后提取細胞RNA檢測METTL3 mRNA表達。

1.4 慢病毒包裝干擾載體

293T細胞接種到15 cm培養(yǎng)皿中至細胞融合度60%左右，挑選上述干擾效率最高的siRNA序列，利用Gateway重組技術(shù)將干擾載體克隆到慢病毒載體上。將重組慢病毒載體和包裝質(zhì)粒(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)共轉(zhuǎn)染293T細胞，72 h后收集細胞上清液，4 ℃ 4 000 r·min-1離心5 min后過濾上清，4 ℃ 20 000 r·min-1離心2 h濃縮病毒液。

1.5 慢病毒滴度檢測

293T細胞以3×104個·孔-1的密度接種到96孔板中培養(yǎng)24 h。用DMEM完全培養(yǎng)基將10 μL慢病毒原液10倍稀釋4個梯度(10-1、10-2、10-3、10-4)，再將100 μL稀釋液和0.5 μg Polybrene加入96孔板的孔中，每組3個重復(fù)。孵育24 h后更換新鮮DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h。通過FACS計數(shù)熒光細胞，結(jié)合稀釋倍數(shù)計算病毒滴度。

1.6 慢病毒侵染IPEC-J2細胞及干擾效果鑒定

IPEC-J2以5×104個·孔-1的密度接種到12孔板中，待融合度達到60%左右進行慢病毒侵染。加入5 μL 1×108TU·mL-1的慢病毒和5 μg Polybrene，同時設(shè)置陰性對照和空白對照組，每組3個重復(fù)，混勻后孵育48 h。在熒光顯微鏡下觀察細胞熒光，每孔加入5 μg嘌呤篩選陽性細胞，直至無熒光細胞全部死亡。將陽性細胞消化傳代，擴大培養(yǎng)。收集細胞提取RNA和蛋白，檢測METTL3表達情況。

1.7 引物設(shè)計與合成

根據(jù)NCBI(http://www.NCBI.Nlm.nih.govn/)數(shù)據(jù)庫中豬TNF-α、Bax、Caspase3、Caspase9、GPXs、CAT、Mn-SOD、CuZn-SOD、IL-6、IL-12、β-actin等基因序列，為防止基因組DNA污染，使用Primer Premier 5.0設(shè)計跨外顯子的實時熒光定量PCR引物(表1)，引物均由擎科生物科技(北京)有限公司合成。

表1 實時熒光定量 PCR引物

1.8 總RNA提取及實時熒光定量PCR反應(yīng)

利用動物RNA抽提試劑盒(離心柱式)對處理過的每孔細胞的RNA進行抽提，并利用2.0%瓊脂糖凝膠電泳及利用NanoDrop 1000 核酸/蛋白濃度測定儀對抽提的RNA進行濃度和純度測定后，在達到所規(guī)定要求后(A260/A280的比值在1.7～2.1之間)-80 ℃保存，將每個抽提出的RNA作為模板按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系為10 μL：5×qRT SuperMix II 2 μL，模板RNA 500 ng，RNase-free ddH2O補足至10 μL。反應(yīng)程序：25 ℃ 10 min，50 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃保存。

實時熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL：模板cDNA 2.0 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，50×ROX Reference Dye II 0.4 μL,2×Ace TM qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL，ddH2O 6.8 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)，擴增結(jié)束后進行擴增熔解曲線并分析，熔解曲線程序：95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。每個樣本設(shè)置3個重復(fù)。

1.9 細胞活力測定

收集轉(zhuǎn)染后的IPEC-J2細胞(METTL3干擾組和對照組)，以500個·μL-1的細胞密度接種200 μL含有DON的細胞液于96孔板中，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后按照CCK8操作說明書進行操作，每孔加入10 μL CCK8溶液，然后37 ℃培養(yǎng)2 h，利用酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度(A)值。

1.10 細胞周期檢測

待六孔板中轉(zhuǎn)染后的IPEC-J2細胞(METTL3干擾組和對照組各3個重復(fù))密度達到80%，加入含DON的DMEM完全培養(yǎng)液避光放置在細胞培養(yǎng)箱中48 h后按照試劑盒說明書進行細胞周期檢測。用不含EDTA的胰酶消化細胞并收集到離心管中備用，1 000 r·min-1離心5 min后棄上清，用1 mL預(yù)冷PBS重懸細胞1 000 r·min-1離心5 min后棄上清，用1 mL預(yù)冷70%乙醇吹打混勻放置4 ℃過夜固定。1 000 r·min-1離心5 min后棄上清，用1 mL預(yù)冷PBS重懸細胞再次離心棄上清。每管加入0.5 mL碘化丙啶染色液，緩慢并充分懸浮細胞沉淀，37 ℃避光溫浴30 min。使用標(biāo)準(zhǔn)程序用流式細胞儀進行檢測，計數(shù)1萬個細胞，結(jié)果用FlowJo 10.0分析細胞周期。

1.11 細胞凋亡檢測

待六孔板中轉(zhuǎn)染后的IPEC-J2細胞(METTL3干擾組和對照組各3個重復(fù))密度達到80%，加入含DON的DMEM完全培養(yǎng)液避光放置在細胞培養(yǎng)箱中48 h后按照試劑盒說明書進行細胞凋亡檢測。用不含EDTA的胰酶消化細胞并收集到離心管中備用，300×g離心10 min后棄上清。用1 mL預(yù)冷PBS重懸細胞，300 r·min-1離心10 min后棄上清。用1 mL Binding Buffer重懸細胞，300 r·min-1離心10 min后棄上清。用100 μL Binding Buffer重懸細胞后加入5 μL Annexin V-FITC室溫避光孵育10 min。加入5 μL PI室溫避光孵育5 min，加入400 μL PBS輕吹混勻后按標(biāo)準(zhǔn)程序使用流式細胞儀進行檢測，計數(shù)1萬個細胞，結(jié)果用CytExpert分析細胞凋亡。

1.12 活性氧(ROS)檢測

待六孔板中轉(zhuǎn)染后的IPEC-J2細胞(METTL3干擾組和對照組各3個重復(fù))密度達到80%，加入含DON的DMEM完全培養(yǎng)液避光放置在細胞培養(yǎng)箱中48 h后按照試劑盒說明書進行試劑制備和ROS檢測。用不含EDTA的胰酶消化細胞，使用含DCFH-DA的DMEM培養(yǎng)液(DCFH-DA∶DMEM培養(yǎng)液為1∶1 000)終止消化并收集到離心管中，放入細胞培養(yǎng)箱避光孵育20 min，每隔5 min顛倒混勻。用1 mL DMEM培養(yǎng)液洗滌細胞3次，每次以300 r·min-1離心10 min后棄上清。最后用500 μL PBS重懸細胞后按標(biāo)準(zhǔn)程序使用流式細胞儀進行檢測，計數(shù)1萬個細胞，結(jié)果用CytExpert分析ROS。

1.13 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 20.0軟件分析實時熒光定量PCR結(jié)果，使用2-ΔΔCt對相關(guān)基因在細胞水平的實際表達量進行計算，用單因素方差分析及T-TEST計算差異是否達到顯著水平，分別以P<0.05、P<0.01作為差異顯著與極顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)。采用Flow J 10.0 分析細胞周期結(jié)果，CytExpert分析細胞凋亡及活性氧水平結(jié)果，使用Excel軟件記錄細胞凋亡數(shù)目及ROS水平，用T-TEST判斷顯著性。柱狀圖統(tǒng)一使用Graphpad prism 8.0.2軟件進行繪圖。

2 結(jié) 果

2.1 METTL3基因穩(wěn)定干擾IPEC-J2細胞系的建立

通過設(shè)計3對siRNA干擾序列轉(zhuǎn)染IPEC-J2細胞，通過qPCR檢測METTL3的轉(zhuǎn)錄水平。如圖1所示，siRNA-2的干擾效率最高，為62.5%，METTL3的表達極顯著下調(diào)(P<0.01)。因此選擇siRNA-2用慢病毒包裝。將重組干擾慢病毒載體和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，培養(yǎng)24 h后細胞表達綠色熒光，說明慢病毒包裝成功，收集濃縮病毒液并進行滴度測定。如圖2所示，分別加入稀釋10-1、10-2、10-3、10-4倍的病毒濃縮液，均可觀察到表達綠色熒光蛋白的細胞，且熒光細胞數(shù)量隨著稀釋倍數(shù)的增加而梯度減少。根據(jù)稀釋10-4倍病毒濃縮液處理孔中觀察到的熒光細胞計算病毒滴度為2×108TU·mL-1，滿足侵染細胞的濃度要求。慢病毒侵染IPEC-J2細胞，加入嘌呤藥篩獲得表達綠色熒光的shMETTL3及對照組細胞。通過qPCR和Western blot試驗檢測細胞METTL3的mRNA和蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)METTL3的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均極顯著低于陰性對照組，結(jié)果表明,METTL3穩(wěn)定干擾IPEC-J2細胞系構(gòu)建成功(圖3)。

METTL3干擾組與對照組相比，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P< 0.01)，下同

A.豬腸上皮細胞METTL3干擾細胞系中METTL3基因的mRNA水平檢測；B 豬腸上皮細胞METTL3干擾細胞系中METTL3的蛋白水平檢測

2.2 DON誘導(dǎo)METTL3基因干擾組和對照組IPEC-J2細胞后相關(guān)基因的表達水平

為了確定細胞水平DON誘導(dǎo)后，METLL3表達量與細胞凋亡、免疫和氧化酶指標(biāo)的關(guān)系，利用實時熒光定量PCR對DON誘導(dǎo)處理之后的METTL3基因干擾組和對照組的IPEC-J2細胞中細胞凋亡相關(guān)基因、免疫相關(guān)基因及氧化酶指標(biāo)相關(guān)基因基因進行表達水平檢測。結(jié)果顯示，凋亡相關(guān)的基因Bax和Caspase9在METTL3基因干擾組IPEC-J2細胞的表達量顯著低于對照組(P<0.05)，Caspase3在METTL3基因干擾組IPEC-J2細胞中的表達水平則極顯著低于對照組(P<0.01，圖4A)；如圖4B所示，干擾組細胞中TNF-α表達量極顯著高于對照組，而IL-6、IL-12的表達量極顯著低于對照組(P<0.01)；如圖4C所示，氧化酶指標(biāo)相關(guān)基因CAT、GPXs、CuZn-SOD干擾組的表達水平顯著高于對照組(P<0.05)。

2.3 DON誘導(dǎo)METTL3基因干擾組和對照組IPEC-J2細胞后細胞增殖的差異分析

為分析細胞水平上DON誘導(dǎo)后METTL3干擾組與對照組細胞增殖活性的差異程度，在豬小腸上皮細胞系IPEC-J2細胞中干擾METTL3并經(jīng)過DON誘導(dǎo)48 h，利用CCK8增殖試驗檢測處理之后IPEC-J2細胞的增殖活性，IPEC-J2細胞METTL3干擾組在450 nm處的光吸收值極顯著高于對照組(圖5)。這說明經(jīng)過DON誘導(dǎo)48 h之后，相比較對照組，干擾METTL3能極顯著的增強IPEC-J2細胞的增殖活性(P<0.01)。

圖5 DON誘導(dǎo)48 h METTL3干擾組和對照組的細胞增殖活性變化

2.4 DON誘導(dǎo)METTL3基因干擾組和對照組IPEC-J2細胞后細胞周期及細胞凋亡的差異分析

為分析細胞水平上DON誘導(dǎo)后METTL3干擾組與對照組細胞周期和凋亡的變化程度，在豬小腸上皮細胞系IPEC-J2細胞中干擾METTL3，DON誘導(dǎo)48 h，使用流式細胞術(shù)對IPEC-J2細胞進行細胞周期和凋亡檢測，結(jié)果如圖6A所示，對照組IPEC-J2細胞在4N時期的細胞百分比為15.5%，如圖6B所示METTL3干擾組IPEC-J2細胞在4N時期的細胞百分比為17.4%，在4N時期的細胞百分比數(shù)METTL3干擾組比對照組多1.9%，這表明經(jīng)DON誘導(dǎo)48 h后METTL3干擾組的細胞更多處于增殖狀態(tài)；由圖7A、B可知，METTL3干擾組細胞的晚凋細胞百分比為4.35%，早凋細胞百分比為3.25%，對照組細胞的晚凋細胞百分比為7.92%，早凋細胞百分比為3.99%，將細胞凋亡數(shù)據(jù)匯總并進行統(tǒng)計分析，由圖7C可知，干擾組的細胞凋亡總數(shù)顯著少于對照組，由此顯示METTL3干擾組IPEC-J2細胞凋亡數(shù)顯著減少(P<0.05)。

A.豬腸上皮細胞對照組；B.豬腸上皮細胞METTL3干擾組

A.豬腸上皮細胞對照組；B.豬腸上皮細胞METTL3干擾組；C.細胞總凋亡數(shù)

2.5 DON誘導(dǎo)METTL3基因干擾組和對照組IPEC-J2細胞后活性氧(ROS)的差異變化分析

為確定細胞水平上DON誘導(dǎo)METTL3干擾組與對照組IPEC-J2細胞的活性氧(ROS)變化程度，在豬小腸上皮細胞系IPEC-J2細胞中干擾METTL3并經(jīng)過DON誘導(dǎo)48 h后，使用流式細胞術(shù)對IPEC-J2細胞進行活性氧水平檢測，并將ROS相對熒光強度數(shù)據(jù)匯總并進行統(tǒng)計分析，如圖8 所示，METTL3干擾組細胞的活性氧相對熒光強度極顯著低于對照組細胞(P<0.01)，活性氧相對熒光強度越高表示細胞受損傷程度越高，這表明METTL3干擾組細胞能一定程度抵抗由DON誘導(dǎo)而引起的細胞損傷。

A.鈣離子依賴的磷脂結(jié)合蛋白-異硫氰酸熒光素通道下的不同ROS相對熒光強度細胞統(tǒng)計；B.對照組和METTL3干擾組的ROS相對熒光強度對比

3 討 論

在高等生物mRNA中，m6A是最豐富、最常見的轉(zhuǎn)錄修飾方式[21]。m6A修飾由m6A甲基轉(zhuǎn)移酶進行修飾，去甲基化酶對修飾進行消除，這一系列過程通過m6A結(jié)合蛋白進行讀取和識別。m6A修飾也參與多種生物學(xué)功能調(diào)控，其在干細胞發(fā)生、機體發(fā)育、癌癥等多種生命進程中發(fā)揮重要的作用[22-24]。催化m6A修飾的甲基化轉(zhuǎn)移酶在機體內(nèi)部以復(fù)合物形式存在并發(fā)揮作用，并且分工協(xié)作地對mRNA上腺苷酸發(fā)生m6A修飾的過程進行催化。同時，m6A甲基化修飾過程是可逆的，這表明去甲基化酶在其中發(fā)揮著同樣重要的功效，其擁有去除mRNA上甲基化的功能，以此參與促進m6A修飾mRNA的剪切、翻譯和降解等過程[25]。相關(guān)研究表明[26]，m6A甲基化修飾與機體腫瘤發(fā)生的過程密不可分。METTL3在乳腺癌組織的表達水平存在下降的變化，這說明m6A甲基轉(zhuǎn)移酶可能在一定程度上提高了乳腺癌發(fā)生的概率。除此之外，多個研究結(jié)果說明METTL3可以影響細胞發(fā)育、分化、炎癥等[27-28]。METTL3的缺失會顯著影響斑馬魚的生育能力并產(chǎn)生多種發(fā)育缺陷[29-30]，METTL3可通過調(diào)節(jié)MyD88的剪接來阻礙脂多糖(LPS)誘導(dǎo)而引發(fā)的炎癥反應(yīng)?？梢奙ETTL3甲基化酶在m6A甲基化修飾的過程中極其重要。本試驗初步探討了豬METTL3基因在脫氧雪腐鐮刀菌烯醇誘導(dǎo)豬小腸上皮細胞中可能發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用。

本試驗在豬小腸上皮細胞(IPEC-J2)中對METTL3進行干擾，經(jīng)DON誘導(dǎo)48 h后，對細胞凋亡相關(guān)基因、免疫相關(guān)基因及氧化酶指標(biāo)相關(guān)基因進行實時熒光定量PCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DON誘導(dǎo)48 h后IPEC-J2細胞中的METTL3干擾組免疫因子TNF-α表達量相較對照組出現(xiàn)極顯著升高，IL-6、IL-12和Bax表達量相較對照組均出現(xiàn)顯著或極顯著下降，TNF-α是炎癥反應(yīng)的標(biāo)志物且其可以促進細胞的增殖與分化，在炎癥反應(yīng)中起到非常重要的調(diào)控和指示作用[31]，IL-6、IL-12和Bax為促細胞炎癥反應(yīng)基因，其可以反映細胞受到侵害產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的狀況，這表明在細胞受到DON的損傷之后會產(chǎn)生反應(yīng)，METTL3干擾組細胞中可以一定程度上緩解因為DON誘導(dǎo)細胞而引起的炎癥反應(yīng)。METTL3干擾組的細胞凋亡相關(guān)基因中Caspase3和Caspase9兩個基因出現(xiàn)了顯著或極顯著的下降，這表明DON誘導(dǎo)48 h之后，將METTL3基因干擾后能夠調(diào)控細胞凋亡相關(guān)基因的表達，使其表達量呈顯著或極顯著下降。研究表明，DON可誘導(dǎo)細胞氧化應(yīng)激，影響抗氧化系統(tǒng)，從而一定程度上損傷細胞，使抗氧化酶基因mRNA的表達量降低[32]。谷胱甘肽(GSH)是生物體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)中最重要的小分子活性寡肽，谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)包括GSH及相關(guān)代謝酶,這形成生物體內(nèi)最重要的抗氧化防御系統(tǒng),其可以保護細胞免受ROS的攻擊[33]。脊椎動物則一般含有CuZn-SOD和Mn-SOD，其是生物體系中抗氧化酶系的重要組成成員，可以一定程度上反映機體清除氧自由基的能力[34]。過氧化氫酶(CAT)能夠預(yù)防過量的過氧化氫對細胞產(chǎn)生的毒害作用，并與超氧化物歧化酶協(xié)同作用抵抗機體受有害自由基的侵害[35-36]。METTL3干擾組的氧化酶指標(biāo)相關(guān)基因中CAT、GPXs和CuZn-SOD的表達相比對照組均出現(xiàn)顯著上升，這表明降低METTL3基因的表達會通過某些途徑參與調(diào)控，進而減弱因DON誘導(dǎo)IPEC-J2細胞而導(dǎo)致的抗氧化酶基因表達量下降的問題，在一定程度上幫助細胞進行抗氧化過程從而抵抗DON誘導(dǎo)的損害。

為了更直觀地反映METTL3基因表達變化與DON誘導(dǎo)IPEC-J2細胞的關(guān)系及細胞的變化，本研究進行了細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡及活性氧的檢測。結(jié)果表明，使用DON對METTL3基因干擾組和對照組IPEC-J2細胞誘導(dǎo)48 h后，METTL3干擾組的細胞增殖活性極顯著高于對照組，這說明干擾METTL3基因表達之后，極顯著緩解了細胞因DON誘導(dǎo)所致增殖活性下降。王琴等[37]研究表明，細胞周期調(diào)節(jié)蛋白激酶抑制劑p21表達升高,抑制SW480細胞從G0/G1期進入S期,則會抑制細胞增殖，可以通過細胞周期檢測以反映細胞增殖的情況，而在METTL3干擾組處于S期和4N期的細胞百分比占比更高，這表明METTL3干擾組的IPEC-J2細胞相較對照組具有更多處于分裂或增殖階段的細胞[38]。相關(guān)研究表明，DON誘導(dǎo)IPEC-J2細胞之后會導(dǎo)致細胞凋亡出現(xiàn)上升的現(xiàn)象，本研究的細胞凋亡檢測結(jié)果顯示，METTL3干擾組的細胞凋亡數(shù)量顯著低于對照組，這表明將METTL3干擾之后，會顯著降低細胞因DON誘導(dǎo)而致細胞凋亡數(shù)量上升的現(xiàn)象。研究表明，DON可以誘導(dǎo)ROS的積累，增加脂質(zhì)過氧化程度，改變細胞膜和抗氧化系統(tǒng)的完整性[32]，活性氧(ROS)包括羥基自由基、超氧陰離子自由基、過氧化氫和脂質(zhì)過氧化的不穩(wěn)定中間體[39]，ROS的生成增加和細胞抗氧化能力下降是細胞內(nèi)氧化應(yīng)激的主要原因,并作為信號源干預(yù)細胞凋亡的進程，影響細胞的數(shù)量[40-41]。本研究活性氧檢測結(jié)果說明，METTL3干擾組細胞的活性氧水平更低，因此推測，干擾METTL3基因的表達可以減弱細胞因受DON誘導(dǎo)產(chǎn)生過多ROS受損傷的程度。

本研究從細胞水平驗證了METTL3對嘔吐毒素誘導(dǎo)IPEC-J2細胞損傷的作用關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在豬小腸上皮細胞中降低METTL3基因表達后，能一定程度幫助細胞抵抗因DON誘導(dǎo)所致細胞凋亡和炎癥損傷，今后需要進一步利用m6A測序(MeRIP-seq)和轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)來深入探究METTL3介導(dǎo)m6A修飾對DON誘導(dǎo)細胞損傷的分子調(diào)控機制。

4 結(jié) 論

本研究成功構(gòu)建了METTL3基因穩(wěn)定干擾IPEC-J2細胞系，并經(jīng)過DON誘導(dǎo)48 h后，通過實時熒光定量PCR、細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡及活性氧試驗檢測表明，在IPEC-J2細胞中降低METTL3基因表達后，能一定程度幫助豬小腸上皮細胞抵抗因DON誘導(dǎo)所致的細胞凋亡和炎癥。METTL3表達下調(diào)有利于緩解DON對細胞損傷產(chǎn)生的一系列炎癥反應(yīng)。