陳 凱， 嚴(yán) 馨， 李天依， 馮佰歡， 張安東， 李 姝， 王元宵， 黃 敏， 曹 玫

(1. 電子科技大學(xué)附屬醫(yī)院·四川省人民醫(yī)院， 成都 610072； 2. 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 資源微生物學(xué)與生物技術(shù)重點實驗室， 成都 610064； 3.四川省原子能研究院 輻照保藏四川省重點實驗室， 成都 610101)

《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載，有柄石韋(Pyrrosiapetiolosa,P.petiolosa)屬于水龍骨科石韋屬植物，具有清肺泄熱、利尿通淋、清熱止血的功效.其可作為金瘡藥用于傷口止血、預(yù)防傷口感染、加快傷口恢復(fù)，效果良好[1].金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)是導(dǎo)致傷口感染的最主要致病菌之一，利用抗生素治療微生物感染是臨床上常用的手段，但隨著抗生素的使用，病原微生物抗生素耐藥現(xiàn)象也變得日趨嚴(yán)重.本課題組前期研究工作發(fā)現(xiàn)P.petiolosa內(nèi)生真菌、內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵物中具有豐富的抑菌活性物質(zhì)[2, 3]；此外，P.petiolosa提取物中含有圣草酚、山奈酚等抑菌物質(zhì)，體外對S.aureus等原核微生物、犬小孢子菌(Microsporumcanis)等真菌有顯著抑制作用，且P.petiolosa提取物及有效成分山奈酚等物質(zhì)可以顯著降低S.aureus毒力因子hla、sea的表達(dá)水平[4, 5].對于外傷傷口治療，除傳統(tǒng)的抗生素外，臨床上也使用一些抗感染或促進(jìn)傷口愈合的中藥膏劑[6].具有清熱解毒、活血化瘀、煨膿長肉及祛腐生肌功效的中藥可以涂于難以愈合的傷口表面，通過調(diào)節(jié)各種細(xì)胞生長，改善局部微環(huán)境，控制局部感染，從而起到促進(jìn)傷口愈合的作用[7, 8].本研究將首次利用有柄石韋試制藥膏，在動物水平研究其抗菌和促傷口愈合的作用，為川西北羌族藥用植物有柄石韋的開發(fā)提供指導(dǎo)意義，為中國傳統(tǒng)藥用植物的研究作出了一定的貢獻(xiàn).

2 材料與方法

2.1 實驗材料

有柄石韋：P.petiolosa采自四川省阿壩藏族羌族自治州汶川縣綿虒鎮(zhèn)，取植物葉片陰干后保存?zhèn)溆?

菌種：S.aureus由四川省資源微生物學(xué)與生物技術(shù)重點實驗室保存.

SD大鼠： SD大鼠為無特定病原體(SPF)級合格動物，60日齡左右，由成都達(dá)碩實驗動物提供，生產(chǎn)許可證號為SCXK(川)2018-030.

主要試劑：乙酸乙酯、無水乙醇、京萬紅軟膏等購于金蜀都化驗設(shè)備有限公司和成都科龍化工集團(tuán)，冰片、薄荷、三七等購于成都市武侯區(qū)思義診所，F(xiàn)GF-2、TNF-α和IL-6檢測用ELISA試劑盒購于北京方程生物科技有限公司.

主要儀器：艾科浦超純水系統(tǒng)AFZ-1002-U(艾科浦公司)、分析天平SL502N(上海民橋精密儀器科技有限公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀BD1110(上海康儀儀器有限公司)、高速粉碎機(jī)WK-1000A(重慶瑞仟順制藥設(shè)備有限公司)、病理組織包埋冷凍機(jī)BMJ-A型(江蘇省常州市中威電子儀器有限公司)、病理組織切片RM2125(中國上海Leica)、電腦自動組織脫水機(jī)TSJ-SD(江蘇省常州市中威電子儀器有限公司)等.

2.2 方 法

2.2.1 石韋藥膏制備 藥膏配方：鮮石韋50 g、干石韋10 g、冰片5 g、薄荷5 g、三七20 g、黃芪10 g、蜂蠟2 g、芝麻油25 mL.將鮮石韋粉碎后與乙酸乙酯按1∶20的比例混合后常溫浸泡10 d，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到鮮石韋酯提物藥膏1.將干石韋10 g、黃芪10 g、三七20 g、冰片5 g、薄荷5 g分別粉碎后，過80目篩，先與95%乙醇按1∶10的比例混勻40 ℃浸泡過夜，過濾后將濾液于80 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得藥膏2.將上述過濾后的藥材再與水按1∶10的比例混合后文火熬制1 h，過濾掉濾渣后繼續(xù)文火熬制并加入2 g蜂蠟，熬成30 mL膏狀物冷卻后備用，此為藥膏3.將藥膏1、藥膏2與芝麻油融合后再與藥膏3攪拌均勻，試制得到實驗用石韋藥膏.

2.2.2 SD大鼠創(chuàng)傷建模 選取體重約200 g的SD大鼠在SPF 級動物房日常飼養(yǎng)，觀察1 w、無死亡和精神異常后進(jìn)行相關(guān)試驗.按照7 mL/100 g的標(biāo)準(zhǔn)將5%水合氯醛腹腔注射供試大鼠，將大鼠的背部毛發(fā)逆向剪去，然后用皮膚活檢器和剪刀在大鼠的兩側(cè)分別制造一個直徑為 9±1 mm的圓形全層切除傷口[9].將創(chuàng)口表面的分泌物和壞死組織用沾生理鹽水的濕潤紗布輕輕拭去，然后用5%苦味酸乙醇溶液標(biāo)記毛發(fā)以區(qū)分不同個體.

2.2.3 SD大鼠分組與藥膏處理 將創(chuàng)傷建模大鼠分為兩組：單純創(chuàng)傷組、S.aureus感染組.單純創(chuàng)傷組再細(xì)分成3小組，分別為自然暴露組、石韋藥膏處理組和京萬紅軟膏處理組，每組12只.S.aureus感染組經(jīng)過前期創(chuàng)傷建模，用生理鹽水清洗后，在每個傷口上接種20 μL 1×108CFU/mLS.aureus菌懸液，感染1 d后進(jìn)行后續(xù)試驗；S.aureus感染組細(xì)分成3小組，S.aureus感染/自然暴露組、S.aureus感染/石韋藥膏處理組和S.aureus感染/京萬紅軟膏處理組，每組12只.

自然暴露組不涂抹任何藥物，作為陰性對照；石韋藥膏處理組每個創(chuàng)面涂抹100 μL石韋藥膏，早晚各1次；京萬紅軟膏處理組，每個創(chuàng)面涂抹上100 μL京萬紅軟膏，早晚各1次，該組為陽性對照.給藥后喂食，連續(xù)給藥3 w.

2.2.4 體重與進(jìn)食情況測量 實驗期間，每天每組早上八點給飼料250 g、測定前一天飼料消耗量(進(jìn)食量)和各組大鼠的體重，并做好詳細(xì)記錄.

2.2.5 創(chuàng)面愈合情況測量 分別在給藥后第3 d、7 d、14 d、21 d以直尺作為對照標(biāo)準(zhǔn)，對傷口處進(jìn)行拍照保存，通過Image軟件計算傷口面積并記錄.

2.2.6 創(chuàng)傷組織病理學(xué)檢測 每組實驗組共計12只大鼠，分別在給藥后第3 d、7 d、14 d、21 d隨機(jī)抽取3只大鼠采用腹腔麻醉的方法麻醉大鼠并進(jìn)行創(chuàng)傷組織取樣，剪取麻醉大鼠的創(chuàng)面皮膚組織(2 cm×2 cm).用生理鹽水清洗取下的創(chuàng)傷組織的血液，一部分創(chuàng)面用4%多聚甲醛固定24 h，經(jīng)過組織洗滌、脫水、透明，將創(chuàng)面組織放入65 ℃融化的石蠟中浸蠟3次，每次1 h，切成4 μm切片，組織切片烘烤后進(jìn)行染色，再經(jīng)過烘干、封片，進(jìn)行顯微鏡觀察與拍照.

2.2.7 血樣采集與炎性因子表達(dá)水平測定 每組實驗組共計12只大鼠，分別在給藥后第3 d、7 d、14 d、21 d隨機(jī)抽取3只大鼠采用腹腔麻醉的方法在麻醉狀態(tài)下背動脈全血采集3 mL至抗凝管內(nèi)輕微搖晃.將收集的血樣放于室溫靜置4 h后3000 r/min離心10 min，小心吸取上清液，得到血清樣品，存放于-80 ℃?zhèn)溆?根據(jù)ELISA試劑盒說明書分別對各個時間段各個實驗處理的血清樣本進(jìn)行FGF-2、TNF-α和IL-6炎性因子表達(dá)水平的測定并記錄數(shù)據(jù).

2.2.8 統(tǒng)計分析 通過GraphPad Prism7軟件對體重、進(jìn)食量、創(chuàng)面愈合率、相關(guān)炎性因子ELISA數(shù)據(jù)進(jìn)行T檢驗，根據(jù)組間差異性作圖.

3 結(jié) 果

3.1 SD大鼠體重與進(jìn)食量變化情況

給藥后每天早晨八點進(jìn)行體重和進(jìn)食量統(tǒng)計，根據(jù)21 d各組大鼠的體重和進(jìn)食量數(shù)據(jù)分析，單純創(chuàng)傷組和S.aureus感染組之間以及各不同給藥處理方式小組之間大鼠體重?zé)o顯著性差異，進(jìn)食量無顯著性差異，實驗組大鼠與對照組大鼠生長狀態(tài)良好，未受手術(shù)創(chuàng)傷和給藥處理的影響.這表明石韋藥膏和陽性對照京萬紅藥膏處理均不會影響大鼠的正常進(jìn)食和生長(如圖1和圖2).

圖1 大鼠體重變化Fig.1 Changes of body weight in rats

圖2 大鼠進(jìn)食量變化Fig.2 Changes of food intake in rats

在給藥后測量大鼠的傷口愈合面積，據(jù)圖3a顯示，在正常創(chuàng)傷組中，治療3 d后石韋藥膏組傷口愈合率為65%，顯著高于自然恢復(fù)組和京萬紅組；治療7 d后石韋藥膏組與京萬紅組相比傷口愈合率無顯著性差異，但均高于自然恢復(fù)組；治療14 d后，大鼠傷口愈合率達(dá)到98%以上，傷口基本恢復(fù)，且石韋藥膏組的傷口愈合率顯著高于京萬紅組和自然恢復(fù)組；此外，在S.aureus感染組中也觀察到了類似的結(jié)果(如圖3b).由此推測P.petiolosa藥膏可促進(jìn)正常創(chuàng)傷及創(chuàng)傷兼S.aureus感染后的傷口愈合.

圖3 傷口愈合率分析(a) 單純創(chuàng)傷組； (b) S.aureus感染組Fig.3 Statistical analysis of wound-healing rates(a) normal trauma group; (b) S.aureus infection group

3.3 創(chuàng)傷組織病理學(xué)分析

3.3.1 正常創(chuàng)傷組病理分析 如圖4所示，治療3 d后，正常創(chuàng)傷自然恢復(fù)組、石韋藥膏組和京萬紅組創(chuàng)面部位皮膚表皮和真皮層結(jié)構(gòu)均已缺失，自然恢復(fù)組皮下組織缺失，但石韋藥膏組和京萬紅組均可見皮下組織.各實驗組創(chuàng)面由新生肉芽組織填充，肉芽組織內(nèi)可見較多以中性粒細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤，肉芽組織上覆蓋壞死層，石韋藥膏治療組炎性細(xì)胞浸潤較其余兩組較輕.

治療7 d后，各實驗組壞死層厚度明顯變薄，修復(fù)部位炎癥進(jìn)一步減輕，修復(fù)面肉芽組織下有纖維細(xì)胞形成，創(chuàng)面邊緣可見部分上皮生成；治療14 d實驗各組大鼠皮膚創(chuàng)面均已變平并被新生表皮組織全部覆蓋，修復(fù)面真皮層全部被纖維組織替代，纖維組織排列整齊緊密，纖維層內(nèi)并可見少量毛囊，但未見皮脂腺，修復(fù)面內(nèi)已未見壞死灶，僅可見少量炎性細(xì)胞浸潤.

圖4 正常創(chuàng)傷組不同處理不同時間傷口愈合情況Fig.4 Wound healing in normal trauma group at different treatment times

3.3.2S.aureus感染組病理分析 如圖5所示，治療3 d后，S.aureus感染組可見較多以中性粒細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤，與正常創(chuàng)傷組相比中性粒細(xì)胞數(shù)量增加，壞死層厚度增加，自然恢復(fù)組和京萬紅治療組部分創(chuàng)面中央部位還未得到肉芽組織填充，石韋藥膏治療組未見明顯不同的組織形態(tài)結(jié)構(gòu).

治療7 d后，各實驗組新生肉芽組織填充，肉芽組織上覆蓋壞死層，且壞死層厚度明顯變薄，自然恢復(fù)組可見炎癥減輕程度小于石韋藥膏組和京萬紅組.治療14 d后，創(chuàng)面被新生表皮組織覆蓋，修復(fù)面真皮層全部被纖維組織替代，但自然恢復(fù)組表皮組織與真皮層界定不明，表皮組織與纖維組織交錯排列，不平整，愈合狀況較差；石韋藥膏組和京萬紅組創(chuàng)面已變平，纖維組織排列整齊緊密，界限分明，修復(fù)面內(nèi)已未見壞死灶，部分組血管別再生，僅可見少量炎細(xì)胞浸潤，恢復(fù)情況逐漸好轉(zhuǎn).

圖5 S.aureus感染組不同處理不同時間傷口愈合情況Fig.5 Wound healing in S.aureus infection group at different treatment times

3.4 血清炎性因子表達(dá)水平分析

3.4.1 TNF-α表達(dá)差異性分析 TNF-α常被用作反應(yīng)傷口局部炎癥狀態(tài)的指標(biāo)之一.如圖6a所示，在正常創(chuàng)傷組中，所有致創(chuàng)大鼠的TNF-α均顯著高于空白未處理組，表明在傷口致創(chuàng)過程中出現(xiàn)了炎性反應(yīng)；其中，石韋藥膏組治療3 d、7 d，其TNF-α的含量相較自然恢復(fù)組和京萬紅治療組更低；在S.aureus感染組中，石韋藥膏組治療3 d，其TNF-α的含量明顯低于自然恢復(fù)組和京萬紅治療組，表明石韋藥膏治療組在致創(chuàng)前期可明顯降低炎性反應(yīng)(圖6b).

圖6 TNF-α表達(dá)分析 (a) 單純創(chuàng)傷組； (b) S.aureus感染組Fig.6 TNF-α expression in different groups(a) normal trauma group；(b) S.aureus infection group

3.4.2 IL-6表達(dá)差異性分析 IL-6被認(rèn)為是傷口炎性反應(yīng)有價值的標(biāo)志物，根據(jù)圖7顯示：在正常創(chuàng)傷組中，石韋藥膏組分別治療3 d、7 d、14 d，其IL-6的含量明顯低于自然恢復(fù)組和京萬紅治療組；治療21 d后，各治療組IL-6的含量與空白未處理組相比均無顯著性差異(圖7a).在S.aureus感染組中，S.aureus感染導(dǎo)致傷口炎癥加劇，自然恢復(fù)組IL-6在3 d時明顯升高，是空白未處理組的1.13倍且明顯高于各治療組，石韋藥膏和京萬紅治療組在前期很好的抑制了S.aureus對傷口的感染，IL-6增長趨勢緩慢，愈合7 d后逐漸降低且石韋藥膏組IL-6的含量低于京萬紅治療組(圖7b)，由此推測P.petiolosa藥膏對S.aureus所致的傷口感染和創(chuàng)傷愈合的治療效果優(yōu)于陽性對照京萬紅治療組.

圖7 IL-6表達(dá)分析(a) 單純創(chuàng)傷組； (b) S.aureus感染組Fig.7 IL-6 expression in different groups(a) normal trauma group；(b) S.aureus infection group

3.4.3 FGF-2表達(dá)差異性分析 如圖8顯示：在正常創(chuàng)傷組中，各處理組FGF-2的含量均高于空白未處理組；其中，石韋藥膏治療組在整個愈合中，F(xiàn)GF-2的含量在前期逐漸上升，7 d后逐漸減低，符合傷口愈合規(guī)律，且FGF-2的含量在愈合過程中的大部分時間內(nèi)均高于自然恢復(fù)組和京萬紅治療組(圖8a)，在S.aureus感染組(圖8b)中也觀察到了類似的結(jié)果.FGF-2是由成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，特別是內(nèi)皮細(xì)胞在組織損傷時分泌的，對促進(jìn)新生血管的形成具有重要作用.在FGF家族中，F(xiàn)GF-2、FGF-7和FGF-10已被證明在皮膚傷口愈合中有著不可或缺的作用[10].有研究表明，缺乏FGF-2的小鼠皮膚全層切除傷口的愈合會延遲.進(jìn)一步說明了P.petiolosa藥膏在抗感染、促進(jìn)傷口愈合過程中具有一定的治療效果.

圖8 FGF-2表達(dá)分析(a) 單純創(chuàng)傷組； (b) S.aureus感染組Fig.8 FGF2 expression in different groups(a) normal trauma group；(b) S.aureus infection group

4 討 論

通過之前的實驗發(fā)現(xiàn)，P.petiolosa乙酸乙酯提取物(PPEAE)和水提取物(PPAE)中含有大量抑菌物質(zhì)，PPAE具有良好的促進(jìn)傷口愈合的作用[11].另外中藥三七可以消炎鎮(zhèn)痛及止血[12]；黃芪具有抗菌抗病毒活性，對傷口感染及傷口愈合有一定效果[7]；薄荷也具有抗炎抑菌等作用[13].因此，本研究在對P.petiolosa提取液進(jìn)行優(yōu)化后，將鮮P.petiolosa和干P.petiolosa混用，再結(jié)合中藥學(xué)理論知識，與三七、黃芪、薄荷等中藥搭配制成藥膏用于治療外傷感染、促進(jìn)傷口結(jié)痂愈合.

本研究通過建立大鼠感染模型，測定P.petiolosa藥膏對創(chuàng)面愈合率、瘢痕面積、致創(chuàng)期間血清中炎性因子的表達(dá)等判斷藥膏在傷口愈合和抗感染過程中的作用.根據(jù)數(shù)據(jù)顯示，以P.petiolosa為主體的藥膏可縮短傷口愈合時間、提高傷口愈合率，且藥膏組治療后的瘢痕面積顯著小于自然恢復(fù)組和陽性對照京萬紅治療組.同時在被S.aureus感染的傷口治療過程中，通過HE病理切片結(jié)果及血清中TNF-α、IL-6、FGF-2等細(xì)胞因子變化情況顯示，P.petiolosa藥膏可拮抗S.aureus感染并促進(jìn)傷口愈合，降低中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤，促進(jìn)肉芽組織生長、纖維細(xì)胞形成、表皮組織生長、真皮層形成和毛囊再生，恢復(fù)皮膚彈性.以上結(jié)果說明這款自主研發(fā)的以P.petiolosa為主要原料的中藥藥膏具有很好的拮抗S.aureus、促進(jìn)傷口愈合的效果；且本藥膏殺菌效果好、副作用小、易被皮膚吸收、創(chuàng)面愈合后疤痕面積小，有效解決了現(xiàn)有的藥膏存在的殺菌能力弱，創(chuàng)口愈合率低和祛疤效果差的問題.