劉根才，華 杰

（浙江維康藥業(yè)股份有限公司，浙江 麗水 323000）

紫蘇Perilla f rutescens（L.）Britt.屬薄荷屬唇形科植物，廣泛分布于中國、日本、韓國、印度及部分東南亞國家［1］。我國有2 000多年的紫蘇栽培歷史，是栽種面積和年出口量最大的國家［2］。紫蘇的葉、莖和果實(shí)均能入藥，是衛(wèi)生部“第一批藥食同源的60種作物”之一［3］。紫蘇葉具有解表散寒、行氣和胃功效，可用于治療風(fēng)寒感冒、咳嗽嘔惡、妊娠嘔吐、魚蟹中毒等癥［4］。紫蘇葉中含有多種生物活性成分，包括揮發(fā)油類、黃酮類、酚酸類等，迷迭香酸在酚酸類成分中含量最高［5-6］，具有抗炎、抑菌、抗抑郁、抗腫瘤等作用［7］。迷迭香酸的提取方法較多，包括微波提取、超聲提取、熱水浸提、有機(jī)溶劑提取、回流提取等［8-12］。響應(yīng)曲面法能準(zhǔn)確表達(dá)考察指標(biāo)與單因素之間的關(guān)系，可快速得出多因素影響的最優(yōu)工藝條件。本研究中采用響應(yīng)曲面法優(yōu)選迷迭香酸的超聲提取工藝?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；ME303型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；KQ-500DB型超聲清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；DFY-600型搖擺式高速萬能粉碎機(jī)（永康式速鋒工貿(mào)有限公司）；循環(huán)水式多用真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）；T-1000型電子秤（上海浦春計量儀器有限公司）；酒精計（河北省武強(qiáng)縣滏陽儀表廠）。

1.2 試藥

迷迭香酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為111871-201706，含量90.5%）；甲醇、磷酸均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。紫蘇葉（浙江惠松制藥有限公司，批號為200930）。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件［13-14］

色譜柱：Agilent SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸水溶液（40∶60，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：330 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.1.2 溶液制備

取迷迭香酸對照品10.0 mg，精密稱定，置10 mL棕色容量瓶中，用甲醇超聲（功率500 W，頻率40 kHz，下同）提取30 min，放冷，加甲醇定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的對照品溶液。取藥材樣品粉末（過80目篩）5.00 g，精密稱定，置帶塞錐形瓶中，用乙醇超聲提取，放冷，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：分別精密量取對照品溶液，倍比稀釋，制成質(zhì)量濃度分別為0.015 6，0.031 3，0.062 5，0.125，0.25 mg/mL的系列對照品溶液。各精密量取10μL，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以迷迭香酸質(zhì)量濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=95 544X+391.66（R2=0.998 9，n=5）。結(jié)果表明，迷迭香酸質(zhì)量濃度在0.015 6～0.25 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

檢測限和定量限考察：分別精密量取2.1.2項(xiàng)下對照品溶液適量，倍比稀釋，并按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以信噪比10∶1和3∶1時的質(zhì)量濃度作為檢測限和定量限。結(jié)果迷迭香酸的檢測限和定量限分別為0.001 4 mg/mL和0.004 8 mg/mL。

精密度試驗(yàn)：取2.1.2項(xiàng)下對照品溶液適量，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)測定3 d（每天連續(xù)2次）及1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果日間和日內(nèi)精密度試驗(yàn)中迷迭香酸峰面積的R S D分別為1.56%（n=3）和0.49%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，1，2，4，8 h時按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果迷迭香酸峰面積的RSD為0.92%（n=5），表明供試品溶液在室溫放置8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取藥材樣品粉末適量，精密稱定，共5份，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果迷迭香酸峰面積的RSD為1.22%（n=5），表明方法重復(fù)性良好。

2.2 提取率計算

按公式［提取率（%）=c×n×V/M×100%］計算迷迭香酸的提取率［15］。式中，c為迷迭香酸質(zhì)量濃度（mg/mL），n為濾液稀釋倍數(shù)，V為濾液體積（mL），M為藥材樣品粉末質(zhì)量（g）。

2.3 單因素試驗(yàn)

乙醇體積分?jǐn)?shù)：當(dāng)超聲60 min、料液比為1∶10、乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%～40%時，迷迭香酸的提取率呈上升趨勢，在40%乙醇時出現(xiàn)最大值，其后呈先下降后上升趨勢，但均未超過最大值（見圖1）。故以40%乙醇進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對迷迭香酸提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on extraction rate of ros?marinic acid

料液比：以40%乙醇超聲60 min、料液比為1∶5～1∶10時，迷迭香酸的提取率呈上升趨勢，并在1∶10時出現(xiàn)最大值，其后呈下降趨勢（見圖2）。故以料液比1∶10進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 料液比對迷迭香酸提取率的影響Fig.2 Effect of material-to-liquid ratio on extraction rate of rosmarinic acid

超聲時間：乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、料液比為1∶10、超聲時間為15～60 min時，迷迭香酸提取率呈緩慢上升趨勢，并在60 min時出現(xiàn)最大值，其后呈下降趨勢（見圖3）。故以超聲時間60 min進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖3 超聲時間對迷迭香酸提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on extraction rate of rosmarinic acid

2.4 響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)

2.4.1 響應(yīng)曲面模型的建立和顯著性檢驗(yàn)

依據(jù)Box-Behnken響應(yīng)曲面法，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以迷迭香酸提取率為響應(yīng)值，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（因素A）、料液比（因素B）、超聲時間（因素C）為考察因素，采用Design Expert 8.0軟件設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)曲面試驗(yàn)。因素與水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計見表2。

表1 因素與水平Tab.1 Factors and levels

由表2可知，17個試驗(yàn)點(diǎn)中12個為分析原因點(diǎn)，其余5個為中心點(diǎn)，用來估計試驗(yàn)誤差。以Design Expert 8.0軟件進(jìn)行回歸分析，進(jìn)行多元回歸擬合，得到迷迭香酸提取率（Y）對因素A、因素B、因素C的二次多項(xiàng)回歸方程：Y=0.62-5.625×10-3A-0.019B+0.019C-6.5×10-3A B-0.027AC+2.25×10-3BC-0.062A2-0.061B2-0.048C2。對表2所得回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表2 試驗(yàn)設(shè)計Tab.2 Design of the test

由表3可知，模型的P＜0.000 1，說明所得二次多項(xiàng)模型有極顯著性；失擬項(xiàng)P=0.462 5＞0.05，說明失擬項(xiàng)無顯著性；模型的R2adj=0.949 7，說明擬合程度好，試驗(yàn)方法可靠，該模型可用于紫蘇葉中迷迭香酸提取工藝條件的預(yù)測和分析。由回歸模型中各項(xiàng)P值可知，一次項(xiàng)B和C對迷迭香酸的提取率有極顯著影響，A無顯著影響；交互項(xiàng)AC對迷迭香酸的提取率影響極顯著，AB、BC無顯著影響；二次項(xiàng)A2，B2，C2對迷迭香酸的提取率影響極顯著。由回歸模型單因素F值可知，對迷迭香酸提取率影響由大至小為B＞C＞A。結(jié)合回歸模型各因素P值和F值可知，以迷迭香酸提取率為響應(yīng)值時，各因素影響大小順序?yàn)锽＞C＞A。

2.4.2 響應(yīng)面分析

利用Design Expert 8.0軟件對表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行二項(xiàng)多次回歸擬合，建立響應(yīng)曲面，比較2個因素交互作用對迷迭香酸提取率的影響。

表3 方差分析結(jié)果Tab.3 ANOVA results

當(dāng)超聲60 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)≤30%時，迷迭香酸提取率隨料液比的增大先增加后減小，在料液比約為1∶10和乙醇體積分?jǐn)?shù)約為40%時出現(xiàn)最大值，且料液比對提取率的影響大于乙醇體積分?jǐn)?shù)。詳見圖4。

圖4 料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)對迷迭香酸提取率的影響a.Response surface plot b.Contour plotFig.4 Effects of material-to-liquid ratio and ethanol volume fraction on the extraction rate of rosmarinic acid

當(dāng)料液比為1∶10時，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲時間的增加，迷迭香酸提取率逐漸增加，在乙醇體積分?jǐn)?shù)約為40%和超聲約60 min時出現(xiàn)最大值，且超聲時間對提取率的影響大于乙醇體積分?jǐn)?shù)。詳見圖5。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲時間對迷迭香酸提取率的影響a.Response surface plot b.Contour plotFig.5 Effects of ethanol volume fraction and ultrasonic time on the extraction rate of rosmarinic acid

當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%，料液比較小時，超聲時間在15～60 min間增加時，迷迭香酸提取率呈上升趨勢，約在60 min時出現(xiàn)最大值，且料液比對提取率的影響大于超聲時間。詳見圖6。

圖6 料液比和超聲時間對迷迭香酸提取率的影響a.Response surface plot b.Contour plotFig.6 Effects of material-to-liquid ratio and ultrasonic time on the extraction rate of rosmarinic acid

2.4.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

響應(yīng)面分析得到迷迭香酸提取的最優(yōu)條件為，39.16%乙醇超聲63.21 min，料液比為1∶9.28，迷迭香酸提取率達(dá)0.62%。考慮到試驗(yàn)的可行性，將最優(yōu)條件修正為39%乙醇超聲63 min，料液比為1∶9。在修正條件下，取藥材樣品粉末，精密稱定，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得到迷迭香酸的實(shí)際平均提取率為0.61%，RSD為1.61%，與理論值比較誤差為0.009%。

3 討論

紫蘇葉的藥食用價值均較高，所含迷迭香酸生物活性廣泛，其藥理作用和來源的天然性在保障人體健康方面潛力較大，是天然的抗氧化劑。且迷迭香酸性質(zhì)穩(wěn)定，不易分解，克服了目前市面上許多抗氧化劑性質(zhì)不穩(wěn)定的問題，在抗氧化領(lǐng)域應(yīng)用前景良好。響應(yīng)曲面法是目前活性成分提取、分離運(yùn)用較多的方法，操作簡便，所得數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，具有代表性。本試驗(yàn)中在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法對紫蘇葉中迷迭香酸的超聲提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得到最優(yōu)條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)39%，超聲時間63 min，料液比1∶9。在此條件下，迷迭香酸的提取率理論值為0.62%，實(shí)際值為0.61%，兩者相對誤差較小，證明采用響應(yīng)曲面法得到的超聲提取紫蘇葉中迷迭香酸的最優(yōu)工藝條件較準(zhǔn)確，有實(shí)用價值。