章曉云 李華南* 陳鋒 柴源 甘斌 李松

1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004

2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種廣泛的全身性及慢性疾病，骨量減少及骨微結(jié)構(gòu)破壞是其主要病理特征，易導(dǎo)致低能量骨折。OP是老年人群中最常見的疾病之一，目前影響著全世界約2億人，而且隨著全球老齡化進程日益加劇，其發(fā)病率正快速增長[1]。椎間盤退變(intervertebral disc degenerative，IDD)是一種常見的肌肉骨骼疾病，可導(dǎo)致椎間盤突出癥，椎管狹窄，退行性椎體滑脫等脊柱退行性疾病的發(fā)生，從而造成人們?nèi)粘Ｉ钯|(zhì)量的下降，并增加醫(yī)療成本及社會經(jīng)濟的負擔(dān)[2-3]。隨著生活節(jié)奏的加快及生活方式改變，IDD的發(fā)病率不斷上升，而且呈年輕化趨勢。OP與IDD之間的發(fā)病病理過程均與年齡增長密切相關(guān)，兩者的發(fā)病機制有相似之處，臨床上很多患者同時患有兩種疾病。研究表明OP對IDD的發(fā)病有著顯著影響，但兩者之間存在的相關(guān)具體機制尚不清楚[4-5]。

隨著以基因芯片為代表的高通量測序技術(shù)的發(fā)展，目前可在短時間內(nèi)獲取疾病的相關(guān)信息，進而從基因?qū)用孢M行更全面的生物標志物篩選。因此，本研究通過GEO數(shù)據(jù)庫查找OP和IDD血清基因芯片表達譜進行生物學(xué)信息學(xué)分析，篩選出各自的差異mRNA并進行映射取交集，根據(jù)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)篩選出核心mRNA，最后對其進行富集分析，為確定OP和IDD之間共同發(fā)病機理創(chuàng)造條件，并為OP和IDD治療藥物的研發(fā)提供有效的作用靶點。

1 材料和方法

1.1 軟件與數(shù)據(jù)庫

軟件與數(shù)據(jù)庫見表1。

表1 數(shù)據(jù)庫與分析平臺Table 1 Involved database and related analysis platform in the study

1.2 數(shù)據(jù)收集

以“osteoporosis”、“intervertebral disc degeneration”、“human”、“RNA”為關(guān)鍵詞，在GEO公共數(shù)據(jù)庫[6]中檢索與OP及IDD相關(guān)的芯片，獲得編號為GSE56116的OP外周血基因表達譜數(shù)據(jù)，包含10位OP患者和3位健康對照，其所處平臺為GPL4133；獲得編號為GSE56081的IDD髓核組織基因表達譜數(shù)據(jù)，包含5位IDD患者和5位健康對照，其所處平臺為GPL15314。

1.3 差異基因的數(shù)據(jù)分析

利用Perl對數(shù)據(jù)進行重注釋，并利用R語言校正、分類，limma包對基因進行差異分析，再以P<0.05和∣logFC∣≥0.5作為過濾條件，篩選差異基因。最后運用Venny平臺將所得OP和IDD的差異基因進行映射取交集，得到交集基因。

1.4 篩選關(guān)鍵基因

使用Cytoscape軟件將交集基因?qū)?，運用Bisogenet插件，在Identifiers下選擇“Gene identifiers only”，限定研究物種為“Homo Sapiens”，同時在Data Settings下選擇“Protein Protein Interaction”，構(gòu)建直接或間接蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)。并運用CytoNCA插件進行拓撲分析，篩選出節(jié)點連接度(degree，DC)>80和節(jié)點介度(betweenness，BC)>2 000的基因[7]，構(gòu)建PPI核心網(wǎng)絡(luò)圖，獲取所獲取的基因是直接或間接調(diào)控發(fā)揮治療OP和IDD作用的關(guān)鍵基因。

1.5 關(guān)鍵基因的基因本體論(gene ontology，GO)分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫[8]對關(guān)鍵基因進行GO功能富集分析，通過統(tǒng)計學(xué)P值和FDR值來評估GO生物過程 ( BIOLOGICAL PROcess) ，研究關(guān)鍵基因在OP和IDD發(fā)生發(fā)展過程中的主要生物功能。

1.6 關(guān)鍵基因的京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫對關(guān)鍵基因進行KEGG功能富集分析，根據(jù)所富集的通路功能條目，探究OP和IDD發(fā)生發(fā)展相關(guān)的信號通路。

2 結(jié)果

2.1 差異基因的分析

對OP芯片進行分析，共得到971個明顯改變的基因，其中上調(diào)基因541個，下調(diào)基因430個；對IDD芯片進行分析，共得到9 125個明顯改變的基因，其中上調(diào)基因4 764個，下調(diào)基因4 361個。將2組差異基因分別繪制成火山圖，見圖1。圖中黑色的點代表無差異基因，綠色的點代表下調(diào)基因，紅色的點代表上調(diào)基因。同時在上調(diào)和下調(diào)的基因中分別選取差異最顯著的10個基因繪制差異基因熱圖，見圖2。

2.2 交集基因的獲取

將OP和IDD的差異基因上傳至Venny平臺進行映射取交集，共得到205個交集基因，見圖3。該205個交集基因在OP與IDD的發(fā)生發(fā)展中均發(fā)揮著重要作用。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)及拓撲分析

利用Cytoscape的Bisogenet插件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，共涉及3 242個節(jié)點、 69 536條邊。再利用CytoNCA插件進行拓撲分析，設(shè)置DC>80，獲得465個節(jié)點，16 635條邊的網(wǎng)絡(luò)。最后設(shè)置BC>2 000，獲得一個涉及8個節(jié)點，17條邊的PPI核心網(wǎng)絡(luò)，見圖4。結(jié)果表明UBC、YWHAZ、TP53、CUL3、NTRK1、BRCA1、Mcm2、ESR1排名靠前，在整個網(wǎng)絡(luò)中起著關(guān)鍵作用，可能是治療OP與IDD的關(guān)鍵靶點，其基本信息見表2。

表2 關(guān)鍵基因的基本信息Table 2 The basic information on the key genes

2.5 GO功能分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫對8個關(guān)鍵基因進行GO功能分析，共確定571條生物過程，主要涉及蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物組合、蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物亞基組織、蛋白質(zhì)去泛素化、蛋白質(zhì)小分子修飾、染色體組織的調(diào)控等過程。GO分析結(jié)果得出的結(jié)果與OP和IDD的發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)。選取富集前15位進行圖片展示，見圖5。

2.6 KEGG富集分析

使用DAVID數(shù)據(jù)庫對8個關(guān)鍵基因進行KEGG富集分析，共確定14個KEGG信號通路條目，主要涉及PI3K/Akt信號通路、泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解、線粒體自噬、影響細胞周期及凋亡相關(guān)通路、神經(jīng)營養(yǎng)素信號通路、甲狀腺激素信號通路等。選取全部結(jié)果進行圖片展示，見圖6。

3 討論

椎間盤退變是下腰痛的主要發(fā)病誘因，經(jīng)常導(dǎo)致腰椎間盤狹窄、椎間盤突出、椎體滑脫等脊柱退行性疾病的發(fā)生，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。隨著人口老齡化加劇，脊柱退行性疾病往往伴隨著骨質(zhì)疏松，尤其是絕經(jīng)后女性，體內(nèi)雌激素的迅速下降導(dǎo)致骨密度降低，骨質(zhì)量下降，骨質(zhì)疏松發(fā)生率較高，而且椎間盤退變更嚴重。因此本研究通過生物信息學(xué)分析了解OP與IDD之間的相關(guān)性，篩選兩者發(fā)病的共同基因，闡釋兩者之間的相關(guān)發(fā)病機理，為藥物研發(fā)提供一定的參考資料。

本研究通過GEO數(shù)據(jù)庫查找獲取OP血清基因表達芯片GSE56116和IDD血清基因表達芯片GSE56081，對兩種芯片進行生物學(xué)信息分析共獲得205個交集基因并對其進行拓撲分析，結(jié)果表明UBC、YWHAZ、TP53、CUL3、NTRK1、BRCA1、Mcm2、ESR1可能是治療OP與IDD的關(guān)鍵靶點。研究表明骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生與成骨細胞和破骨細胞之間介導(dǎo)的骨穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)[9]，骨穩(wěn)態(tài)的平衡還可保證脊柱生物力學(xué)的穩(wěn)定性，可減少IDD的發(fā)生幾率[10-11]。骨穩(wěn)態(tài)涉及骨形成與骨吸收之間的動態(tài)平衡，研究表明UBC在血管生成及骨形成過程中是必不可少的，其可促進骨膜血管生成并提高成骨細胞的活性[12]，而TP53在原發(fā)型骨質(zhì)疏松癥被上調(diào)并發(fā)揮著重要作用，其抑制表達后同樣可促進機體血管形成和成骨作用減緩骨質(zhì)疏松病情發(fā)展[13]。另有研究[14]表明UBC與TP53參與了IDD發(fā)生發(fā)展，可能是IDD的潛在治療靶標。因此筆者認為UBC與TP53通過調(diào)節(jié)機體骨穩(wěn)態(tài)從而影響OP與IDD疾病的發(fā)生與發(fā)展。研究[15]表明YWHAZ是治療骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵靶點，YWHAZ表達抑制對骨礦化，成骨細胞分化和骨形成發(fā)揮抑制作用，從而影響OP的發(fā)生和發(fā)展。生物信息學(xué)研究[16]表明YWHAZ和TP53與IDD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是治療IDD的關(guān)鍵基因。CUL3在Spop介導(dǎo)的泛素化過程中發(fā)揮作用從而影響機體軟骨細胞和成骨細胞分化，增加骨密度，促進人體骨骼發(fā)育，為臨床上骨質(zhì)疏松、椎間盤退變、骨關(guān)節(jié)炎等疾病的診斷與治療提供潛在的靶標[17]。NTRK1基因的突變會影響人體礦物質(zhì)不足，骨質(zhì)形成缺陷，引起人體出現(xiàn)復(fù)發(fā)性骨折和骨質(zhì)疏松，進而影響脊柱的穩(wěn)定性，增加椎間盤退變的發(fā)生機率[18]。雌激素通過多種途徑影響破骨細胞、成骨細胞、免疫細胞和其他細胞的功能從而維持骨礦物質(zhì)密度至關(guān)重要。研究[19]表明ESR1的多態(tài)性與人類的骨量相關(guān)，在OP發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，另有研究[20]發(fā)現(xiàn)ESR1表達差異會引起人體椎間盤及髓核病理改變誘發(fā)椎間盤退變。BRCA1的表達增加導(dǎo)致雌激素受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄受到抑制從而影響機體的骨形成導(dǎo)致骨質(zhì)疏松發(fā)生[21-22]，而BRCA1損傷后會導(dǎo)致椎間盤退變引起脊柱退行性變的發(fā)生[23]。因此筆者認為UBC、YWHAZ、TP53、CUL3、NTRK1、BRCA1、ESR1等共同調(diào)控OP與IDD的發(fā)生發(fā)展，它們會誘發(fā)椎體骨質(zhì)疏松，進而引起椎體承受壓力能力減弱而導(dǎo)致壓力往椎間盤上轉(zhuǎn)移，從而引起椎間盤彈性減低，髓核持續(xù)受壓后導(dǎo)致其突出概率增大。

為充分了解關(guān)鍵基因在OP與IDD中涉及的共同通路及功能，我們進行了GO 及KEGG分析。GO結(jié)果顯示靶基因主要通過蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物組合、蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物亞基組織、蛋白質(zhì)去泛素化、蛋白質(zhì)小分子修飾、染色體組織的調(diào)控等過程，這些生物過程參與成骨細胞增殖分化、細胞凋亡，從而影響機體骨穩(wěn)態(tài)，造成骨量丟失，造成骨質(zhì)疏松的同時引起椎體生物力學(xué)失衡，進而導(dǎo)致椎間盤退變。KEGG分析結(jié)果顯示信號通路主要涉及PI3K/Akt信號通路、泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解相關(guān)通路、線粒體自噬相關(guān)通路、影響細胞周期及凋亡相關(guān)通路、神經(jīng)營養(yǎng)素信號通路、甲狀腺激素信號通路等。研究[25]表明FoxO1通過PI3K/AKT途徑發(fā)生磷酸化從而影響代謝，細胞周期變化及細胞死亡等生物過程，進一步調(diào)控骨代謝以改善骨質(zhì)內(nèi)微觀結(jié)構(gòu)，骨密度及強度，可有效延緩OP病情進展，減少IDD的發(fā)生。與GO分析結(jié)果一樣，KEGG也同樣顯示泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解相關(guān)通路與影響細胞周期及凋亡相關(guān)通路在OP與IDD的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。研究表明泛素蛋白酶體系統(tǒng)通過靶向蛋白質(zhì)底物進行泛素化，在調(diào)節(jié)成骨細胞和破骨細胞的分化功能介導(dǎo)骨重塑過程中發(fā)揮著重要作用，可影響成骨細胞周期及凋亡，調(diào)控骨穩(wěn)態(tài)平衡影響OP發(fā)生發(fā)展，進而導(dǎo)致椎體骨質(zhì)流失引起IDD發(fā)生。自噬和線粒體自噬在成骨細胞分化，礦化和存活過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，越來越多的證據(jù)表明成骨細胞自噬和線粒體自噬是OP發(fā)病機理中的一種新機制[24]。線粒體功能障礙，氧化應(yīng)激和髓核細胞凋亡是IDD發(fā)生和發(fā)病的重要因素，研究[25-28]已證實Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬通路激活可有效減輕椎間盤退變。人體在正常生理狀態(tài)下，成骨與破骨細胞之間的功能平衡才能維持機體骨穩(wěn)態(tài)的正常。研究表明自噬可通過調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細胞、成骨細胞及破骨細胞的功能狀態(tài)參與機體骨穩(wěn)態(tài)的維持，自噬水平降低會導(dǎo)致細胞成骨分化能力減弱，破骨細胞活性增強，從而導(dǎo)致骨穩(wěn)態(tài)失衡引起人體骨質(zhì)丟失，最終導(dǎo)致OP的發(fā)生。OP是全身性疾病，各椎體出現(xiàn)骨質(zhì)疏松后，其強度和硬度降低，進而影響各椎體承受壓力的大小，當椎體受到以往同樣的外界壓力后，其力量會傳導(dǎo)至椎間盤，最終引起OP與IDD在同一位患者中相繼出現(xiàn)。椎間盤變性與局部炎癥和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的表達增加有關(guān)，神經(jīng)營養(yǎng)素信號通路的激活可引起神經(jīng)營養(yǎng)蛋白增加減輕IDD病情[30-31]。人體與動物實驗研究[32-33]均表明骨骼與神經(jīng)系統(tǒng)之間存在密切關(guān)聯(lián)，骨骼細胞與神經(jīng)組織之間的聯(lián)系對于促進骨骼的生長，體內(nèi)平衡和修復(fù)非常重要，神經(jīng)營養(yǎng)蛋白基因表達異常是OP發(fā)病的危險因素。吳毅華等[34]研究表明甲狀腺激素輔助治療頸椎退行性椎間盤疾病合并骨質(zhì)疏松癥患者，可有效提高骨密度及成骨相關(guān)基因，臨床療效顯著，而生物信息學(xué)實驗驗證表明甲狀腺激素在OP發(fā)病過程中起著關(guān)鍵作用[35]，因此甲狀腺激素通路是否激活對于OP與IDD病情發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。

總之，OP和IDD均存在龐大的疾病基因網(wǎng)絡(luò)，但這些網(wǎng)絡(luò)并非各自獨立，而是存在密不可分的聯(lián)系。本研究獲得OP和IDD各自疾病基因網(wǎng)絡(luò)的交叉部分正是二者相關(guān)聯(lián)的部分，也是研究OP和IDD相互關(guān)系的突破點，同時也可為藥物同時干預(yù)兩種相互關(guān)聯(lián)的疾病提供較為可靠的路徑和作用靶點。且從側(cè)面反映出不同疾病可通過應(yīng)用同一藥物治療的特色，與中醫(yī)辨證論治中的“異病同治”思想不謀而合，以此促進中藥現(xiàn)代化發(fā)展。為臨床兩種疾病治療提供一定的臨床指導(dǎo)，讓醫(yī)生及患者了解兩種疾病合并治療的重要性。此外該研究尚存在一些缺點，首先，由于篩選條件的限制，只能對主要蛋白基因、作用靶點、信號通路進行分析，在一定程度上使得研究結(jié)果具有局限性；其次，對差異基因信息進行整合處理依賴于生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，疾病數(shù)據(jù)庫的完整性、準確性直接決定著整合后信息的可靠性。故本文雖然能夠篩選出大量靶點和通路，但仍需后續(xù)結(jié)合體內(nèi)外實驗進一步驗證與支持，使理論更加可靠。