曾 嬙 李新萍 李利民

干眼病是一種由多種因素引起的淚液分泌減少或蒸發(fā)過快導(dǎo)致的眼表疾病。雖然干眼病不致命，但嚴(yán)重影響到患者生活質(zhì)量[1, 2]。由于生活方式改變，例如長期處于空調(diào)調(diào)控的干燥環(huán)境中、長期閱讀書籍或使用電子產(chǎn)品導(dǎo)致的過度用眼，使干眼病發(fā)生率逐年升高，全球范圍內(nèi)的干眼病發(fā)生率達(dá)6%～34%[3～5]。在美國成年人群中干眼病患者約占9.3%，年齡超過50歲人群的發(fā)生率約11.3%，女性發(fā)生率高達(dá)22.8%[6]。在我國干眼病發(fā)生率為31.4%，尤其在年長女性中和高緯度地區(qū)發(fā)生率更高[7]。

淚腺細(xì)胞是淚腺中的主要功能細(xì)胞，具有分泌水、電解質(zhì)和蛋白的作用，這些分泌物形成淚液膜的親水層，保持眼睛濕潤并維持眼部健康[8]。淚腺組織內(nèi)炎性細(xì)胞的浸潤，產(chǎn)生大量的炎性細(xì)胞因子，導(dǎo)致淚腺上皮細(xì)胞死亡，從而導(dǎo)致淚液分泌減少，這是引起干眼病的重要原因之一[9～11]。分離和培養(yǎng)淚腺上皮細(xì)胞, 是研究淚腺功能的基礎(chǔ), 也是研究干眼病發(fā)病機(jī)制和開發(fā)治療藥物的重要手段之一。本研究建立了從大鼠淚腺分離培養(yǎng)淚腺上皮細(xì)胞的方法，為干眼病的研究提供了一種穩(wěn)定經(jīng)濟(jì)的細(xì)胞模型。

材料與方法

1.主要試劑：DMEM培養(yǎng)基、FBS、牛垂體提取物、重組表皮生長因子、角化細(xì)胞無血清培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素雙抗、PBS、鼠尾膠原、防熒光淬滅劑均購自美國Life Technologies公司。Hoechst 33342和霍亂毒素(cholera toxin，CT)購自美國Sigma-Aldrich公司。膠原蛋白酶購自瑞士Roche公司。透明質(zhì)酸酶購自美國Worthington公司。DNA酶購自德國EMD Millipore公司。細(xì)胞角蛋白(cytokeratin,CK, ab86734)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin, E-cad, ab76055)、波形蛋白(vimentin, Vim, ab8978)、S100(ab76729)和α-平滑肌蛋白(alpha-smooth muscle actin, α-SMA, ab5694)等一抗，以及Alexa Fluor 488 結(jié)合的羊抗鼠二抗(ab150113)、Alexa Fluor 488 結(jié)合的羊抗兔二抗(ab150077)均購自英國Abcam公司。

2.淚腺上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)：分離培養(yǎng)方法根據(jù)文獻(xiàn)[12,13]改良建立。采用4周齡Sprague-Dawley大鼠(體質(zhì)量150～180g)，從中分離純化淚腺上皮細(xì)胞。大鼠經(jīng)麻醉處死后，手術(shù)摘除其淚腺。淚腺組織經(jīng)PBS洗滌，去除殘留血漬，小心剝離周邊的結(jié)締組織，剪碎，加入0.5mg/ml膠原蛋白酶、100units/ml透明質(zhì)酸酶和14080units/ml DNA酶，在90mm培養(yǎng)皿中37℃條件下消化2h，每20min輕輕振動一次。收集細(xì)胞懸液，70μm濾器過濾去除未消化組織，在1500r/min條件下離心3min，收集下層細(xì)胞。加入DMEM/F12培養(yǎng)液混懸細(xì)胞，細(xì)胞懸液經(jīng)培養(yǎng)液洗滌兩次后，接種于75cm2的培養(yǎng)瓶中，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h后，棄去已貼壁細(xì)胞(主要是纖維細(xì)胞)。小心吸取未貼壁細(xì)胞懸液(主要是腺細(xì)胞)，轉(zhuǎn)入膠原(5μg/cm2)預(yù)包被的培養(yǎng)瓶中，加入添加了10% FBS、50μg/ml BPE、5ng/ml rEGF、80ng/ml CT、1%雙抗的KSFM培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)24h，換新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)20天左右的細(xì)胞可傳代培養(yǎng)。

3.淚腺上皮細(xì)胞的鑒定：采用細(xì)胞免疫熒光染色方法對培養(yǎng)的淚腺上皮細(xì)胞主要標(biāo)志物進(jìn)行鑒定。淚腺細(xì)胞接種于適用于免疫熒光實(shí)驗(yàn)的8孔腔室載玻片，培養(yǎng)箱里過夜培養(yǎng)，抽去多余培養(yǎng)液后，用4%多聚甲醛固定10min。然后用PBS輕輕漂洗2min，更換為0.25%Triton X-100溶液，培養(yǎng)15min使細(xì)胞穿孔暴露胞內(nèi)蛋白。用PBS輕輕漂洗后，加入2% BSA溶液封閉1h，再加入一抗在4℃條件下濕盒中孵育過夜。一抗包括anti-CK (1∶100), anti- E-cad (1∶100), anti-Vim (1∶200), anti-S100 (1∶400) 和anti-α-SMA (1∶400)。去掉多余的抗體液，經(jīng)PBS洗滌后，加入相應(yīng)的Alexa Fluor 488標(biāo)記的羊抗鼠二抗(1∶200)或羊抗兔二抗(1∶200)孵育1h。PBS洗去多余二抗后，加入Hoechst 33342(1∶250)染核。拆去孔室裝置，用防熒光淬滅劑封閉玻片，指甲油封固。激光共聚焦顯微鏡(FV1000，日本Olympus公司)下觀察結(jié)果。

結(jié) 果

1.細(xì)胞形態(tài)和生長觀察：分離的淚腺細(xì)胞包括多種細(xì)胞，即酶消化后的上皮細(xì)胞、肌上皮細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞和少量紅細(xì)胞。紅細(xì)胞由于具有懸浮生長的特征，可以通過更換新鮮培養(yǎng)基來消除。成纖維細(xì)胞沉降并在2h內(nèi)黏附到培養(yǎng)瓶底部，因此，可利用成纖維細(xì)胞這個(gè)特性在其黏附2h后，將漂浮細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)膠原包被的培養(yǎng)瓶中以去除成纖維細(xì)胞。原代培養(yǎng)的淚腺上皮細(xì)胞在3天內(nèi)貼附到瓶底上，并增殖形成匯合的單層細(xì)胞。淚腺上皮細(xì)胞表現(xiàn)出鵝卵石形態(tài)，并混有少量梭形細(xì)胞(圖1)。21天后，細(xì)胞長滿瓶底的80%～90%，將細(xì)胞傳代，傳代后的細(xì)胞多數(shù)表現(xiàn)出鵝卵石形態(tài)和長條形，也有極少數(shù)平鋪展開的大尺寸細(xì)胞(圖2中A、B)。

圖1 原代培養(yǎng)大鼠淚腺細(xì)胞的形態(tài) A、D.第7天；B、E.第14天；C、F.第21天

圖2 傳代大鼠淚腺細(xì)胞的形態(tài)(×100)

2.細(xì)胞免疫熒光染色鑒定：通過免疫熒光染色標(biāo)記不同的細(xì)胞標(biāo)志物對分離培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。細(xì)胞角蛋白和E-鈣黏蛋白是上皮細(xì)胞標(biāo)志物，波形蛋白是間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白，而α-SMA和S100蛋白在肌上皮細(xì)胞中大量表達(dá)，是肌上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白。分離培養(yǎng)的細(xì)胞高表達(dá)細(xì)胞角蛋白和E-鈣黏蛋白，弱表達(dá)α-SMA和S100蛋白，基本不表達(dá)波形蛋白，表明從淚腺組織分離培養(yǎng)得到的是上皮細(xì)胞(腺細(xì)胞)和肌上皮細(xì)胞(導(dǎo)管細(xì)胞，圖3)。

圖3 原代培養(yǎng)大鼠淚腺細(xì)胞的鑒定(×200)

討 論

淚腺的主要功能是分泌水、電解質(zhì)和蛋白質(zhì)，形成淚液膜的親水層，保持眼睛濕潤并維持眼部健康[8]。在淚腺中存在3種主要的細(xì)胞類型，包括腺泡和導(dǎo)管上皮細(xì)胞、肌上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞[13, 14]。腺泡上皮細(xì)胞在分泌水、電解質(zhì)和某些蛋白質(zhì)中起重要作用[15]。肌上皮細(xì)胞圍繞腺泡和導(dǎo)管細(xì)胞，以維持腺泡完整性并刺激分泌產(chǎn)物從腺泡細(xì)胞中進(jìn)入導(dǎo)管。間充質(zhì)細(xì)胞起結(jié)構(gòu)和支持作用，包括間充質(zhì)干細(xì)胞、分化的成纖維細(xì)胞和分化的脂肪細(xì)胞[16]。腺泡上皮細(xì)胞和肌上皮細(xì)胞對淚腺功能都有重要作用。本研究采用簡單經(jīng)濟(jì)的方法分離出淚腺上皮細(xì)胞。首先利用不同類型細(xì)胞的貼壁時(shí)間不同去除掉成纖維細(xì)胞，重復(fù)該操作可達(dá)到純化細(xì)胞的目的。然后采用膠原蛋白Ⅰ包被培養(yǎng)瓶以及在培養(yǎng)基中補(bǔ)充CT以維持淚腺細(xì)胞形態(tài)和上皮表型。值得注意的是CT對維持細(xì)胞上皮形態(tài)有重要作用，已有研究發(fā)現(xiàn)原代培養(yǎng)的上皮細(xì)胞在未添加CT的培養(yǎng)基中呈現(xiàn)單層多邊形形態(tài)但是傳代后形態(tài)明顯改變，而在添加CT的培養(yǎng)基中傳代后多邊形形態(tài)仍可維持[12, 13]。

筆者選取不同的細(xì)胞標(biāo)志物對分離培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。CK是位于上皮細(xì)胞的中間細(xì)絲蛋白，在不同腺上皮和導(dǎo)管上皮中的表達(dá)模式差異較大，研究發(fā)現(xiàn)腺上皮細(xì)胞表達(dá)CK-5、CK-7和CK-19[17～19]。由于尚未有特異CK在大鼠淚腺上皮表達(dá)的報(bào)道，在本實(shí)驗(yàn)中采用了pan-CK作為檢測抗體。E-鈣黏蛋白是上皮細(xì)胞標(biāo)志物，在人淚腺中有明顯表達(dá)[20]。Vim是間充質(zhì)細(xì)胞的主要細(xì)胞骨架成分，常表達(dá)于成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞。α-SMA是收縮細(xì)胞比如肌細(xì)胞、肌上皮細(xì)胞的主要骨架蛋白，而S100蛋白是一種酸性鈣結(jié)合蛋白，由2個(gè)亞基組成，在肌上皮細(xì)胞中大量表達(dá)，是肌上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白[13]。對細(xì)胞鑒定結(jié)果顯示，本研究分離得到的細(xì)胞高表達(dá)CK和E-cad，弱表達(dá)α-SMA和S100蛋白，基本不表達(dá)Vim，提示這些細(xì)胞表現(xiàn)為上皮細(xì)胞和肌上皮細(xì)胞的混合群體。上皮細(xì)胞和肌上皮細(xì)胞對維持淚腺功能都有有益的作用，基于此，對這兩種細(xì)胞所占比例尚未進(jìn)行分析，這也是本實(shí)驗(yàn)的一個(gè)不足之處。目前尚無淚腺腺泡細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志物，腺泡細(xì)胞屬于上皮細(xì)胞，因此本研究采用上皮細(xì)胞標(biāo)志物作為鑒定標(biāo)記，但是淚腺腺泡細(xì)胞能特異性分泌lacritin和β-hexosaminidase，由于這兩種物質(zhì)是分泌物，在細(xì)胞中不便于檢測，因此未作為鑒定標(biāo)記。此外，如果是未成熟的淚腺細(xì)胞也會表達(dá)祖細(xì)胞的標(biāo)志物，例如Ki-67、Pax6等[21, 22]。

綜上所述，本研究成功建立了從大鼠淚腺分離培養(yǎng)淚腺上皮細(xì)胞的方法，為淚腺疾病，尤其是干眼病和干燥綜合征的研究提供了一種穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)的體外模型。