林藝，王策，康勛，康莊，陳峰，江波，李文斌

100070北京，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院 腫瘤綜合治療中心

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，手術(shù)、放療、化療是目前腦膠質(zhì)瘤的綜合治療模式[1]。腦膠質(zhì)瘤患者在接受規(guī)范治療后臨床預(yù)后差異較大，臨床醫(yī)生希望在現(xiàn)有整合診斷基礎(chǔ)上尋找相關(guān)分子標志物，提高腦膠質(zhì)瘤診治水平。除了Oncomine、TCGA、cBioPortal for Cancer Genomics和GEO等數(shù)據(jù)庫，CGGA已實現(xiàn)數(shù)據(jù)公開，為學(xué)者從事神經(jīng)腫瘤領(lǐng)域相關(guān)的標志物研究提供了新的途徑[2-3]。PTK7隸屬于蛋白激酶家族，因最早在結(jié)腸癌中被發(fā)現(xiàn)，故又被稱為CCK-4[4]。其由具有類似免疫球蛋白胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和C端類激酶結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。PTK7基因存在組織特異性，在多種腫瘤中表達水平升高，其高表達提示預(yù)后不佳，相關(guān)研究報道見于胃癌[5]、結(jié)直腸腫瘤[6]、乳腺癌[7]、卵巢癌[8]等。而在子宮頸癌[9]、脂肪肉瘤[10]、血液腫瘤[11]中 ，PTK7呈現(xiàn)為低表達， 低表達提示生存預(yù)后差。腦膠質(zhì)瘤中PTK7的表達情況和預(yù)后價值尚不明確，本研究通過對TCGA、cBioPortal和CGGA等公共數(shù)據(jù)庫的檢索，分析PTK7在腦膠質(zhì)瘤中的表達并研究其與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 資料數(shù)據(jù)來源

所有數(shù)據(jù)來源于互聯(lián)網(wǎng)開放的數(shù)據(jù)庫和分析工具，包括Human Protein Atlas，Oncomine，GEPIA，STRING，cBioPortal for Cancer Genomics和CGGA(表1)。采用Human Protein Atlas基于RNA深度測序結(jié)果分析17種常見腫瘤組織中的基因 mRNA表達情況。Oncomine平臺用于分析比較腦膠質(zhì)瘤和對照組織中的基因mRNA表達水平，這共包括5項腦腫瘤數(shù)據(jù)，其中2項是膠質(zhì)瘤。cBioPortal for Cancer Genomics共有11項腦膠質(zhì)瘤研究，涵蓋低級別膠質(zhì)瘤、膠質(zhì)母細胞瘤等病例。GEPIA分析來自TCGA和GTEx項目的676個腫瘤和對照正常樣品的RNA測序表達數(shù)據(jù)。CGGA分析來自325例腦膠質(zhì)瘤病例的測序數(shù)據(jù)。

表1 生物信息分析相關(guān)數(shù)據(jù)庫

1.2 數(shù)據(jù)資料挖掘

以“PTK7”為關(guān)鍵詞進行檢索，利用Human Protein Atlas 數(shù)據(jù)庫RNA-Seq數(shù)據(jù)分析PTK7基因mRNA在常見腫瘤組織中的表達水平；檢索Oncomine數(shù)據(jù)庫，分析PTK7mRNA在腫瘤組織和正常組織中的表達，利用CGGA分析其mRNA在腦膠質(zhì)瘤中的表達?；赾BioPortal for Cancer Genomics，分析PTK7在腦膠質(zhì)瘤中基因突變及拷貝數(shù)變異情況。然后，利用CGGA mRNA芯片數(shù)據(jù)庫分析PTK7基因mRNA表達水平與腦膠質(zhì)瘤相關(guān)臨床參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系。再通過GEPIA獲取所有TCGA腦膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)，選擇Group Cutoff為Median，設(shè)定高表達人群和低表達人群(Cutoff-High=50%；Cutoff-Low=50%)，驗證PTK7基因mRNA在腦膠質(zhì)瘤中的表達水平，分析其與預(yù)后的關(guān)系。最后，利用STRING 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用(protein protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)，尋找蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系。PPI的相關(guān)基因進行GO和KEGG信號富集分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用R 4.0.2軟件進行統(tǒng)計分析，采用配對t檢驗比較癌組織和癌旁組織PTK7基因的表達量差異。在GO通路富集分析中，數(shù)據(jù)間差異比較采用方差分析。KEGG富集分析中選擇的具有統(tǒng)計學(xué)意義的通路(P<0.05)。生存分析采用Kaplan-Meier法，生存率的比較采用Log-rank檢驗，P<0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。癌組織和癌旁組織表達量差異采用配對t檢驗用來比較，卡方檢驗比較臨床病理參數(shù)組間差異(n<5時行連續(xù)校正卡方檢驗)。

2 結(jié) 果

2.1 PTK7基因mRNA在泛癌組織中的表達

基于Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫RNA-Seq數(shù)據(jù)，研究分析了PTK7基因mRNA在多種類型腫瘤組織中的表達。共納入7 392個病例樣本(表2)：子宮內(nèi)膜癌(n=541)、睪丸癌(n=134)、頭頸癌(n=499)、肺癌(n=994)、卵巢癌(n=373)、宮頸癌(n=291)、乳腺癌(n=1 075)、前列腺癌(n=494)、胰腺癌(n=176)、尿路上皮癌(n=406)、甲狀腺癌(n=501)、黑色素瘤(n=102)、結(jié)直腸癌(n=597)、腦膠質(zhì)瘤(n=153)、胃癌(n=345)、腎癌(n=877)和肝癌(n=365)。PTK7基因的mRNA表達水平在子宮內(nèi)膜癌、睪丸癌、頭頸癌、肺癌、卵巢癌、宮頸癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、尿路上皮癌和甲狀腺癌中相對較高，而在黑色素瘤、大腸癌、胃癌和腦膠質(zhì)瘤中表達中等。在腎癌、肝癌中，其表達水平相對較低(圖1)。

表2 PTK7基因 mRNA在泛癌組織中的表達

圖1 Human Protein Atlas 數(shù)據(jù)庫中PTK7基因 mRNA在腫瘤組織中的表達

2.2 PTK7基因mRNA在腦膠質(zhì)瘤和對照組織中的表達

Oncomine表達譜芯片分析結(jié)果示，與對照的正常腦組織相比，PTK7基因mRNA在腦膠質(zhì)瘤組織(膠質(zhì)母細胞瘤)表達較高，二者之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，F(xiàn)old change值為8.245(圖2)?；赥CGA數(shù)據(jù)的GEPIA分析顯示，與對照的正常腦組織相比，PTK7基因mRNA在低級別腦膠質(zhì)瘤組織中表達較高(P<0.001)，二者間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義；同樣與對照的正常腦組織相比，PTK7基因mRNA在腦膠質(zhì)母細胞瘤組織中表達較高(P<0.001)，二者間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。CGGA數(shù)據(jù)分析結(jié)果示PTK7基因mRNA表達在II、III和IV級腦膠質(zhì)瘤組織組織間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，表達水平隨著腦膠質(zhì)瘤分級升高而升高。

圖2 PTK7 mRNA在組織中的表達

2.3 PTK7基因突變及甲基化分析

基于cBioPortal for Cancer Genomics數(shù)據(jù)庫分析，共納入11個研究數(shù)據(jù)，共計5 386例腦膠質(zhì)瘤病例，結(jié)果顯示PTK7在腦膠質(zhì)瘤中存在突變和擴增。PTK7基因突變率最高0.84%，擴增率最高0.58%，沒有檢測到基因融合(圖3)。甲基化分析共有源自2個研究的325例樣本檢測數(shù)據(jù)被納入，結(jié)果顯示PTK7甲基化和PTK7基因mRNA在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達呈負相關(guān)(P<0.001，圖4)，這提示PTK7基因的表達可能受到了表觀遺傳學(xué)調(diào)控。7例病例檢測到了PTK7基因拷貝數(shù)擴增，25例檢測到了PTK7基因拷貝數(shù)的輕度丟失(圖4)。按照病理類型進行分析，結(jié)果顯示42例腦膠質(zhì)母細胞瘤(占比97.67%)PTK7基因甲基化水平較低(圖4)。

圖3 PTK7基因在腦膠質(zhì)瘤中的突變和擴增

圖4 PTK7基因在腦膠質(zhì)瘤組織中甲基化情況

2.4 PTK7基因mRNA表達水平與腦膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征的關(guān)系

為進一步探討PTK7mRNA表達情況與臨床病理參數(shù)關(guān)系，研究進一步利用 CGGA mRNA芯片數(shù)據(jù)庫進行相關(guān)性分析。該數(shù)據(jù)包括病例325例腦膠質(zhì)瘤病例，涵蓋不同WHO分級，PTK7的高低表達 cut-off值為13.1，高于cut-off值即高表達，反之為低表達。分析結(jié)果顯示：PTK7基因在腫瘤不同分級間(WHO II、WHO III、WHO IV)的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)， 在異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)不同狀態(tài)間(野生型，突變型)差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.001)， 在不同腫瘤發(fā)生類型間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004)， 在不同病理類型間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。PTK7表達與WHO分級、IDH狀態(tài)、腫瘤發(fā)生類型和病理類型相關(guān)(表3)。

表3 PTK7 表達與腦膠質(zhì)瘤患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.5 PTK7基因mRNA表達水平與腦膠質(zhì)瘤預(yù)后的關(guān)系

為分析PTK7的預(yù)后價值，研究使用CGGA mRNA芯片數(shù)據(jù)庫進行生存分析?！癆nalyze-mRNA data”模塊將PTK7表達分為兩組，高表達組111例，低表達組111例，經(jīng)生存分析Kaplan-Meier法顯示，PTK7基因表達與腦膠質(zhì)瘤的總生存率(overall survival, OS)相關(guān)(P<0.001)，PTK7基因mRNA低表達組預(yù)后優(yōu)于高表達組。在復(fù)發(fā)腦膠質(zhì)瘤病例中，PTK7基因高、低表達組間的OS差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.013)，PTK7低表達組預(yù)后優(yōu)于高表達組(圖5)。

圖5 基于CGGA腦膠質(zhì)瘤病例的生存分析

2.6 驗證PTK7基因mRNA表達水平與腦膠質(zhì)瘤預(yù)后的關(guān)系

為了進一步驗證基于CGGA數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果，分析PTK7基因在腦膠質(zhì)瘤中的預(yù)后價值，研究通過GEPIA進行生存分析，結(jié)果(Kaplan-Meier法)顯示在676例TCGA腦膠質(zhì)瘤病例中，PTK7低表達者預(yù)后均優(yōu)于高表達組，二者的OS 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，圖6)。PTK7低表達者無病生存優(yōu)于高表達組，二者之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，圖6)。

圖6 基于TCGA腦膠質(zhì)瘤病例的生存分析

2.7 PTK7 PPI關(guān)系及GO、KEGG分析

為了探討PTK7可能的作用通路，基于STRING 數(shù)據(jù)庫，研究構(gòu)建了蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，并分析與PTK7相互作用的蛋白分子，結(jié)果如圖7所示，共有11個蛋白分子構(gòu)建成為核心相互作用網(wǎng)絡(luò)，相關(guān)基因為PTK7、CCK、CCKAR、CCKBR、DVL1、DVL2、DVL3、FZD7、VANGL1、VANGL2和WNT5A。對上述基因進行GO功能分析結(jié)果提示,其主要參與平面細胞極性通路、耳蝸形態(tài)發(fā)生、Wnt信號通路等29個功能過程(圖8)。KEGG通路分析結(jié)果顯示上述基因參與Wnt通路、基底細胞癌、黑色素生成、調(diào)節(jié)干細胞多能性、Hippo通路、人類T淋巴細胞白血病病毒Ⅰ型感染、癌癥通路和Notch通路等8個通路(圖9)。

圖7 PTK7相關(guān)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

圖8 PTK7相關(guān)基因本體(GO)功能分析結(jié)果

圖9 PTK7相關(guān)基因KEGG信號通路富集分析結(jié)果

3 討 論

腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展過程極其復(fù)雜，是由多種因素共同作用的結(jié)果。盡管在過去的幾十年中，神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療已有很大進展，但是大多數(shù)患者的臨床結(jié)局仍然欠佳，尤其是膠質(zhì)母細胞瘤。近年來，手術(shù)聯(lián)合放療和替硝唑胺化療已經(jīng)成為膠質(zhì)母細胞瘤的標準治療方案，但是即使接受相同的治療，患者的生存期也明顯不同。生存期受很多因素影響，包括治療策略、患者的身體狀態(tài)、腫瘤的特征等。與這些因素相關(guān)的標志物往往是膠質(zhì)瘤患者預(yù)后評價的關(guān)鍵，針對相關(guān)標志物的靶向治療將成為未來腦膠質(zhì)瘤治療方面的突破點。

蛋白激酶是真核細胞中最大的一個基因家族，依據(jù)激酶、非激酶區(qū)域和跨膜的結(jié)構(gòu)域，將蛋白激酶劃分為受體依賴型受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTKs)和非受體依賴型RTKs[12]。蛋白激酶介導(dǎo)了真核細胞內(nèi)大多數(shù)的信號傳導(dǎo)，調(diào)控大部分細胞內(nèi)蛋白的功能，參與發(fā)育過程中的細胞內(nèi)通訊，參與生理反應(yīng)和內(nèi)穩(wěn)態(tài)等[13-15]。因此，蛋白激酶突變和調(diào)控異常導(dǎo)致了人類疾病，這也為使用酶類的激動藥和拮抗藥治療疾病提供了可能。越來越多的研究表明酪氨酸激酶在各種類型腫瘤中均起重要作用，而RTKs已成為腫瘤藥物研究中受到重點關(guān)注的靶點[15-16]。

本研究發(fā)現(xiàn)PTK7mRNA在腦膠質(zhì)瘤組織中表達升高，表達水平隨著腦膠質(zhì)瘤分級升高，這與既往腦膠質(zhì)母細胞瘤研究結(jié)果一致[17]。PTK7在腦膠質(zhì)瘤中存在突變和擴增。臨床參數(shù)分析顯示PTK7表達與腦膠質(zhì)瘤的WHO分級、IDH狀態(tài)和病理類型相關(guān)(P<0.001)，而與其他臨床因素如年齡、性別等無相關(guān)性?；贑GGA數(shù)據(jù)的生存分析顯示PTK7基因mRNA低表達組預(yù)后優(yōu)于高表達組(P<0.001)，在復(fù)發(fā)腦膠質(zhì)瘤中同樣存在上述差異(P=0.013)?；赥CGA數(shù)據(jù)點生存分析印證了PTK7低表達者預(yù)后均優(yōu)于高表達組，OS和DFS差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。而既往學(xué)者研究顯示，與低表達PTK7的腦膠質(zhì)瘤相比較，高表達PTK7的多形性膠質(zhì)瘤患者預(yù)后更差[17]。該研究與我們的分析結(jié)果一致，即在腦膠質(zhì)瘤病例中，PTK7高表達意味著預(yù)后不良。

PTK7是WNT/β-catenin和WNT/PCP信號傳導(dǎo)途徑中的常見成員，可能在這兩個信號傳導(dǎo)途徑中發(fā)揮正向或負向作用[18-20]。研究顯示PTK7調(diào)控細胞極性[21]，并且與RACK1,Cdx和PlexinA1有相互作用[22-23]，是WNT信號通路的調(diào)控因子，作用于Frizzled受體，并作為GSK3β的上游調(diào)節(jié)信號[20,24]。Wnt信號通路在神經(jīng)發(fā)生和干細胞增殖中發(fā)揮功能，被證實在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[25]。此外，PI3K/Akt/mTOR途徑與腦膠質(zhì)母細胞瘤的生長、代謝、存活、血管生成、自噬和化療耐藥性密切相關(guān)[26]。在本研究中，PTK7在腦膠質(zhì)瘤中高表達也預(yù)示預(yù)后不佳。而PTK7在血液腫瘤[27]、肺癌[28]、結(jié)腸癌[6]、乳腺癌[29]、食道癌[30]以及肉瘤[10]等出現(xiàn)過表達則同樣提示不良預(yù)后。這些數(shù)據(jù)進一步支持PTK7未來作為腫瘤新藥研究的候選靶標[31-33]。

總之，本研究結(jié)果提示PTK7表達水平和腦膠質(zhì)瘤的臨床病理參數(shù)和臨床預(yù)后有關(guān)，但PTK7的預(yù)后價值仍需要在蛋白水平進行驗證。PTK7作為酪氨酸蛋白激酶家族成員，如果未來能夠明確其臨床價值和功能機制，或?qū)⒂邢Ｍ蔀槟X膠質(zhì)瘤的治療新靶點，在精準治療中發(fā)揮作用。

作者聲明：本文全部作者對于研究和撰寫的論文出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)相應(yīng)責(zé)任；并承諾論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)資料等已按照有關(guān)規(guī)定保存，可接受核查。

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