李艷榮 杜義龍 沈瑩 吳哲 王狄鑫 趙勝男 潘海峰

中圖分類號(hào) R286.0 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2022）06-0706-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.06.10

摘 要 目的 建立指紋圖譜、多成分定量分析和化學(xué)模式識(shí)別分析相結(jié)合的心安膠囊質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。方法 采用高效液相色譜（HPLC）法，結(jié)合《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》建立24批心安膠囊的指紋圖譜，并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，確定共有峰;采用同一HPLC法測定心安膠囊中牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、金絲桃苷和異槲皮素的含量;以指紋圖譜共有峰峰面積為變量，采用MetaboAnalyst 5.0工具繪制聚類分析（CA）熱圖，采用SIMCA 14.1軟件進(jìn)行主成分分析（PCA）和偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）。結(jié)果 24批心安膠囊共有12個(gè)共有峰，相似度均大于0.97;指認(rèn)出綠原酸、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、金絲桃苷和異槲皮素6個(gè)共有峰。牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、金絲桃苷、異槲皮素檢測質(zhì)量濃度的線性范圍分別為2.36～151.35、9.15～585.20、1.20～76.50、0.68～43.20、0.44～27.90 μg/mL（r均大于0.999）;精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性（24 h）試驗(yàn)的RSD均小于2.00%;平均加樣回收率分別為95.80%（RSD=0.96%，n=6）、102.10%（RSD=0.93%，n=6）、103.26%（RSD=1.28%，n=6）、103.89%（RSD=0.73%，n=6）、102.09%（RSD=1.79%，n=6）。5種成分的含量分別為0.988 8～1.559 1、4.336 6～11.220 1、0.065 1～0.830 5、0.043 8～0.692 5、0.023 2～0.427 2 mg/粒。CA、PCA結(jié)果顯示，24批樣品可分成3類，S1～S15為一類，S16～S18為一類，S19～S24為一類;PLS-DA發(fā)現(xiàn)，6號(hào)峰對應(yīng)成分和牡荊素葡萄糖苷（7號(hào)峰）、牡荊素鼠李糖苷（8號(hào)峰）、金絲桃苷（10號(hào)峰）、異槲皮素（11號(hào)峰）的變量重要性投影值均大于1。結(jié)論 所建立的HPLC指紋圖譜、多成分定量方法簡單、可行，結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別分析可用于心安膠囊的質(zhì)量控制;牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷等可能是影響各批樣品質(zhì)量的差異標(biāo)志物。

關(guān)鍵詞 心安膠囊;高效液相色譜法;指紋圖譜;多成分定量分析;聚類分析;主成分分析;偏最小二乘法-判別分析;質(zhì)量控制

Quality evaluation of Xin’an capsules by combination of fingerprint， multi-component quantitative analysis and chemical pattern recognition analysis

LI Yanrong1，DU Yilong1，SHEN Ying2，WU Zhe1，WANG Dixin1，ZHAO Shengnan1，PAN Haifeng1（1. Institute of Traditional Chinese Medicine/Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Research and Development of Hebei Province， Chengde Medical University， Hebei Chengde 067000， China; 2. Chengde Yushi Jindan Pharmaceutical Co.， Ltd.， Hebei Chengde 068150， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE To establish a method for quality evaluation of Xin’an capsule by combining fingerprint， multi-component quantitative analysis and chemical pattern recognition analysis. METHODS High performance liquid chromatography （HPLC） combined with Similarity Evaluation System of TCM Chromatogram Fingerprint （2012 edition） were used to establish the fingerprints of 24 batches of Xin’an capsules and evaluate the similarity. The common peaks were determined. The contents of glucosylvitexin， rhamnosylvitexin， vitexin， hyperoside and isoquercetin in Xin’an capsules were determined by the same HPLC method. Taking the common peak area of fingerprint as the variable， MetaboAnalyst 5.0 tool was used to draw the cluster analysis （CA） heat map. SIMCA 14.1 software was used to perform principle component analysis （PCA） and partial least squares-discriminant analysis （PLS-DA）. RESULTS Twelve common peaks were identified with the similarity greater than 0.97. Six common peaks were identified as chlorogenic acid， glucosylvitexin， rhamnosylvitexin， vitexin， hyperoside and isoquercetin. The linear range of glucosylvitexin， rhamnosylvitexin， vitexin， hyperoside and isoquercetin were 2.36-151.35， 9.15-585.20， 1.20-76.50， 0.68-43.20， 0.44-27.90 μg/mL（all r>0.999）. RSDs of precision， repeatability and stability （24 h） tests were all less than 2.00%. The average recoveries were 95.80% （RSD=0.96%， n=6）， 102.10% （RSD=0.93%， n=6）， 103.26% （RSD=1.28%， n=6）， 103.89% （RSD=0.73%， n=6） and 102.09% （RSD=1.79%， n=6）， respectively. The contents of the five components were 0.988 8-1.559 1， 4.336 6-11.220 1， 0.065 1-0.830 5， 0.043 8-0.692 5 and 0.023 2-0.427 2 mg/grain， respectively. The results of CA and PCA showed that 24 batches of samples could be divided into three categories， i.e. S1-S15， S16-S18 and S19-S24. PLS-DA showed that variable importance in projection values of the corresponding component of peak 6 and glucosylvitexin （peak 7）， rhamnosylvitexin （peak 8）， hyperoside （peak 10） and isoquercetin （peak 11） were greater than 1. CONCLUSIONS The established HPLC fingerprint and multi-component quantitative method are simple and feasible. Combined with chemical pattern recognition analysis， it can be used for the quality control of Xin’an capsules. Glucosylvitexin， rhamnosylvitexin and other components may be differentital markers affecting the quality of each batch of samples.

KEYWORDS? ?Xin’an capsules; high performance liquid chromatography; fingerprint; multi-component quantitative analysis; cluster? analysis; principal component analysis; partial least squares-discriminant analysis; quality control

心安膠囊是以山楂葉提取物為原料制成的膠囊劑，具有擴(kuò)張冠狀血管、改善心肌供血、降低血脂的作用，可用于臨床治療冠心病、心絞痛、高血壓等心腦血管疾病[1]?，F(xiàn)代研究表明，山楂葉的主要有效成分為黃酮類成分，包括牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、金絲桃苷和異槲皮素等，具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)和糖代謝、護(hù)肝、抗氧化、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈等多種藥理活性[2-4]?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)僅通過測定總黃酮的含量來對心安膠囊進(jìn)行質(zhì)量控制[1]，而已有文獻(xiàn)則多集中于心安膠囊的指紋圖譜研究和含量測定[5-7]。由此可見，現(xiàn)有質(zhì)量研究尚不全面，數(shù)據(jù)分析方法較為單一，也未就質(zhì)量差異原因進(jìn)行分析，不能全面反映心安膠囊的內(nèi)在質(zhì)量和不同生產(chǎn)企業(yè)產(chǎn)品的質(zhì)量差異。

中藥色譜指紋圖譜能體現(xiàn)中藥成分的整體性和復(fù)雜性，強(qiáng)調(diào)共有峰歸屬和相似度評(píng)價(jià)，是目前符合中藥特點(diǎn)的評(píng)價(jià)模式之一，但已知成分共有峰的含量難以確定[8-9]，故在指紋圖譜基礎(chǔ)上進(jìn)行多成分定量測定可彌補(bǔ)上述不足?；谥兴幓瘜W(xué)成分的復(fù)雜性，指紋圖譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別分析能真實(shí)、形象地反映中藥的質(zhì)量差異，揭示其復(fù)雜成分之間的規(guī)律，已被廣泛應(yīng)用于藥物的質(zhì)量控制、差異標(biāo)志物的篩選[10-11]。聚類分析（cluster analysis，CA）是根據(jù)樣本特征進(jìn)行分類的一種多元分析技術(shù)，常以指紋圖譜為基礎(chǔ)，對中藥及其制劑進(jìn)行區(qū)分鑒別[12]。主成分分析（principal component analysis，PCA）是一種利用降維技術(shù)將多個(gè)指標(biāo)轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個(gè)具代表性的綜合指標(biāo)的無監(jiān)督模式識(shí)別方法，可簡單、直觀地對樣品進(jìn)行分類[13-14]。偏最小二乘法-判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）是一種有監(jiān)督的模式識(shí)別方法，適用于區(qū)別兩類或多類樣品，在中藥質(zhì)量綜合分析中有較廣泛的應(yīng)用[15-16]。鑒于此，本文采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法，建立了24批心安膠囊的指紋圖譜，測定了其中牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、金絲桃苷和異槲皮素5種黃酮類成分的含量，同時(shí)結(jié)合CA、PCA、PLS-DA等化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)對樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行深入分析，篩選差異標(biāo)志物，以期為全面、客觀、準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)其質(zhì)量提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Agilent 1200型HPLC儀及配備的二極管陣列檢測器（diode-array detector，DAD）、在線脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱（美國Agilent公司），KQ-700型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），AG-254十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

綠原酸對照品（批號(hào)18071907）、牡荊素葡萄糖苷對照品（批號(hào)20042305）、牡荊素鼠李糖苷對照品（批號(hào)18060103）、牡荊素對照品（批號(hào)16070601）、金絲桃苷對照品（批號(hào)19103001）、異槲皮素對照品（批號(hào)18062702）均購自成都普菲德生物科技有限公司，純度均不低于98%。甲醇、乙腈為色譜純，甲酸為分析純，水為純凈水。24批心安膠囊由3家企業(yè)提供，規(guī)格均為每粒含總黃酮80 mg，其來源信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動(dòng)相為0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B）-四氫呋喃（D），梯度洗脫程序見表2;流速為1.0 mL/min;柱溫為30 ℃;檢測波長為340 nm;進(jìn)樣量為10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取綠原酸、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、金絲桃苷、異槲皮素對照品適量，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度分別為1.05、1.01、1.06、1.02、0.96、0.93 mg/mL的單一對照品貯備液。分別取上述各對照品貯備液適量，置于同一量瓶中，以50%甲醇為溶劑，制成綠原酸、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、金絲桃苷、異槲皮素質(zhì)量濃度分別為38.44、75.40、294.30、38.25、21.60、13.95 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 隨機(jī)取10粒心安膠囊，稱定其總質(zhì)量。將膠囊內(nèi)容物倒出，擦凈膠囊殼，稱定10粒膠囊殼總質(zhì)量，計(jì)算平均粒重：平均粒重=（膠囊總質(zhì)量-膠囊殼總質(zhì)量）/10。將膠囊內(nèi)容物研細(xì)，取細(xì)粉約0.5 g，精密稱定，置于具塞三角瓶，精密加入60%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率250 W，頻率40 kHz，下同）30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用60%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，取上清液，以12 000 r/min離心10 min，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 指紋圖譜分析

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取心安膠囊樣品（編號(hào)S1），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。以牡荊素葡萄糖苷色譜峰為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時(shí)間的RSD均小于2.00%，相對峰面積的RSD均小于3.00%，表明方法精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取心安膠囊樣品（編號(hào)S1），按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，共6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以牡荊素葡萄糖苷色譜峰為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時(shí)間的RSD均小于2.00%，相對峰面積的RSD均小于3.00%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取心安膠囊樣品（編號(hào)S1），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以牡荊素葡萄糖苷色譜峰為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時(shí)間的RSD均小于2.00%，相對峰面積的RSD均小于3.00%，表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 指紋圖譜的建立、相似度評(píng)價(jià)及共有峰指認(rèn) 取24批心安膠囊樣品，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。將所得色譜圖的“AIA”格式文件導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》進(jìn)行分析，設(shè)S11圖譜為參照圖譜，采用中位數(shù)法自動(dòng)匹配后生成24批心安膠囊樣品的疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜（圖1、圖2）。結(jié)果顯示，24批心安膠囊樣品有12個(gè)共有峰。24批心安膠囊樣品圖譜與對照指紋圖譜的相似度分別為0.993、0.993、0.991、0.990、0.992、0.991、0.980、0.972、0.977、0.992、0.992、0.991、0.990、0.991、0.991、0.989、0.988、0.987、0.983、0.983、0.977、0.982、0.985、0.982，均大于0.97，提示樣品圖譜與對照指紋圖譜具有較高的相似度，各批樣品的化學(xué)成分整體類似。經(jīng)與混合對照品色譜圖（圖3）比對，共指認(rèn)出6個(gè)色譜峰，分別為綠原酸（3號(hào)峰）、牡荊素葡萄糖苷（7號(hào)峰）、牡荊素鼠李糖苷（8號(hào)峰）、牡荊素（9號(hào)峰）、金絲桃苷（10號(hào)峰）、異槲皮素（11號(hào)峰）。

2.4 多成分定量測定

2.4.1 專屬性考察 取心安膠囊樣品（編號(hào)S1），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件對60%甲醇空白溶劑和供試品溶液進(jìn)樣分析。結(jié)果顯示空白溶劑對供試品測定無干擾，表明方法專屬性良好，具體圖略。

2.4.2 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、金絲桃苷、異槲皮素對照品貯備液各適量，以50%甲醇為溶劑，配制成上述成分質(zhì)量濃度分別為151.35、585.20、76.50、43.20、27.90 μg/mL的混合對照品溶液Ⅰ。取上述混合對照品溶液Ⅰ，用50%甲醇倍比稀釋，配制成牡荊素葡萄糖苷質(zhì)量濃度分別為75.68、37.84、18.92、9.46、4.73、2.36 μg/mL，牡荊素鼠李糖苷質(zhì)量濃度分別為292.60、146.30、73.15、36.58、18.29、9.14 μg/mL，牡荊素質(zhì)量濃度分別為38.25、19.12、9.56、4.78、2.39、1.20 μg/mL，金絲桃苷質(zhì)量濃度分別為21.60、10.80、5.40、2.70、1.35、0.68 μg/mL，異槲皮素質(zhì)量濃度分別為13.95、6.98、3.49、1.74、0.87、0.44 μg/mL的系列線性溶液。取上述混合對照品溶液Ⅰ和系列線性溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測成分質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表3。

2.4.3 精密度試驗(yàn) 取心安膠囊樣品（編號(hào)S1），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、金絲桃苷和異槲皮素峰面積的RSD均小于2.00%，表明方法精密度良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取心安膠囊樣品（編號(hào)S1），共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算各成分含量。結(jié)果顯示，牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、金絲桃苷和異槲皮素含量的RSD均小于2.00%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取心安膠囊樣品（編號(hào)S1），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、金絲桃苷和異槲皮素峰面積的RSD均小于2.00%，表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的心安膠囊樣品（編號(hào)S1）6份，每份約0.25 g，分別精密加入0.902 mg/mL的牡荊素葡萄糖苷溶液1 mL、0.930 mg/mL的牡荊素鼠李糖苷溶液4 mL、0.890 mg/mL的牡荊素溶液0.5 mL、 0.725 mg/mL的金絲桃苷溶液0.2 mL、0.610 mg/mL的異槲皮素溶液0.2 mL（按“2.2.1”項(xiàng)下方法配制），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算5種成分的加樣回收率。結(jié)果顯示，5種成分的平均加樣回收率分別為95.80%、102.10%、103.26%、103.89%、102.09%，RSD均小于2.00%（n=6），表明方法準(zhǔn)確度良好，結(jié)果見表4。

2.4.7 樣品含量測定 取24批心安膠囊樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法測定平均粒重并制備供試品溶液，每批平行制備2份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，采用外標(biāo)法計(jì)算各樣品中牡荊素葡萄糖苷等5種成分的含量，結(jié)果見表5。

由于不同樣品中各成分的含量差異較大，故按以下方法計(jì)算各已知成分的相對平均含量（用比值表示）：相對平均含量=各廠家樣品中每種成分的平均含量/各廠家樣品中每種成分的平均含量之和。以上述相對平均含量為對象，采用Excel 2013繪制雷達(dá)圖，結(jié)果見圖4。由表5、圖4可以觀察出，同一廠家不同批次樣品中5種成分的含量有一定差異;不同廠家樣品之間各成分的含量差異較為明顯，如承德廠家樣品中牡荊素葡萄糖苷和牡荊素含量較高，牡荊素鼠李糖苷含量較低;四川廠家樣品中金絲桃苷和異槲皮素含量較高;遼寧廠家樣品中牡荊素鼠李糖苷含量較高，牡荊素、金絲桃苷和異槲皮素含量較低。

2.5 化學(xué)模式識(shí)別分析

2.5.1 CA CA熱圖可對數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選、提取和降維，可通過橫向聚類來反映樣品的關(guān)系，通過縱向聚類來反映化學(xué)成分之間的關(guān)系[17]。該法以漸進(jìn)的藍(lán)紅色條帶來直觀呈現(xiàn)數(shù)據(jù)結(jié)果，其顏色代表歸一化后的含量數(shù)據(jù)，含量越高，條帶顏色越紅，反之條帶顏色越藍(lán)，可以此反映研究對象的差異變化[18]。將24批心安膠囊的12個(gè)共有峰峰面積導(dǎo)入MetaboAnalyst 5.0工具，選擇“statistical analysis”模塊，對數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選、歸一化等操作后，輸出CA熱圖，詳見圖5。由圖5可知，24批樣品可聚成3類：S1～S15聚為一類，S16～S18聚為一類，S19～S24聚為一類;承德廠家生產(chǎn)的15批心安膠囊樣品中，除4、6號(hào)峰對應(yīng)成分和牡荊素鼠李糖苷（8號(hào)峰）外，其余共有峰對應(yīng)成分的含量整體較高;四川廠家生產(chǎn)的樣品中，5、6號(hào)峰對應(yīng)成分和金絲桃苷（10號(hào)峰）、異槲皮素（11號(hào)峰）的含量相對較高，且6號(hào)峰對應(yīng)成分的含量明顯高于承德廠家和遼寧廠家生產(chǎn)的樣品;遼寧廠家生產(chǎn)的樣品中，牡荊素鼠李糖苷（8號(hào)峰）的含量相對較高。結(jié)合CA熱圖中的條帶顏色可知，6、7、8、10、11號(hào)峰是主要差異峰，不同廠家樣品間的差異較為顯著。

2.5.2 PCA 建立24批心安膠囊的12個(gè)共有峰峰面積矩陣，導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件中，以共有峰峰面積為變量，建立PCA模型并繪制PCA得分圖。模型質(zhì)量參數(shù)R 2X為0.953，預(yù)測能力參數(shù)Q 2為0.802，均高于0.5，說明該模型有較高的穩(wěn)定性和預(yù)測力[19]，PCA得分圖見圖6。由圖6可知，3個(gè)廠家生產(chǎn)的心安膠囊樣品分布在不同區(qū)域，說明其組間差異較明顯，且分類結(jié)果與CA一致。

2.5.3 PLS-DA 為明確24批樣品的組間差異及差異標(biāo)志物，本研究在CA和PCA的基礎(chǔ)上，將24批心安膠囊的12個(gè)共有峰峰面積導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件，建立PLS-DA模型。結(jié)果顯示，自變量累積解釋能力參數(shù)R 2X為0.967，因變量累積解釋能力參數(shù)R 2Y為0.965，預(yù)測能力參數(shù)Q 2為0.919，均大于0.5，且R 2和Q 2兩者差距小于0.2，說明所建模型具有較強(qiáng)的解釋率和預(yù)測率[19]。設(shè)置分類Y矩陣隨機(jī)排列200次并進(jìn)行置換檢驗(yàn)，置換檢驗(yàn)圖見圖7。由圖7可知，R 2擬合直線在Y坐標(biāo)軸的截距為0.209（應(yīng)小于0.30），說明所建立的模型可靠;Q 2擬合直線在Y坐標(biāo)軸的截距為-0.703（應(yīng)小于0.05），表明所建模型不存在過度擬合，可用于分析24批樣品的組間差異[19]。PLS-DA得分圖、載荷散點(diǎn)圖和變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）圖分別見圖8～圖10。由圖8可知，3個(gè)廠家生產(chǎn)的24批樣品均分布在95%置信區(qū)間內(nèi)，且不同廠家分布在不同區(qū)域，區(qū)分明顯，分類結(jié)果與CA和PCA一致。由圖9可知，離原點(diǎn)分散較遠(yuǎn)的色譜峰分別為6、7、8、10、11號(hào)峰，說明這些成分對樣品組間差異的影響較大。結(jié)合VIP值篩選出能引起不同廠家心安膠囊質(zhì)量差異的標(biāo)志性成分，其中VIP值>1且其值越大，表明對質(zhì)量差異的貢獻(xiàn)越大，可作為差異標(biāo)志物[20]。由圖10可得出，6號(hào)峰對應(yīng)成分和牡荊素葡萄糖苷（7號(hào)峰）、牡荊素鼠李糖苷（8號(hào)峰）、金絲桃苷（10號(hào)峰）、異槲皮素（11號(hào)峰）為差異標(biāo)志物。

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

本課題組前期考察了4種型號(hào)的色譜柱[Agilent ZORBAX SB-C18、Thermo AcclaimTM120 C18、Water Sunfire C18及Agilent 5 HC-C18（2），規(guī)格（4.6 mm×250 mm，5 μm）均相同]的分離效果，發(fā)現(xiàn)Agilent ZORBAX SB-C18的分離效果最佳。本課題組考察了流動(dòng)相體系中不同體積分?jǐn)?shù)甲酸溶液（0.05%、0.1%、0.2%）的分離效果，發(fā)現(xiàn)以0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B）-四氫呋喃（D）的分離效果最好，并對梯度洗脫程序進(jìn)行了優(yōu)化。本課題組對檢測波長（320、340、350、363 nm）進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)340 nm波長下各色譜峰的響應(yīng)值均較高，故將其作為檢測波長。本課題組還對柱溫（25、30、35 ℃）、流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)當(dāng)柱溫為30 ℃、流速為1.0 mL/min時(shí)的分離效果最佳。

3.2 供試品溶液制備方法的考察

本課題組以指紋圖譜信息的全面性和色譜峰的響應(yīng)值為主要指標(biāo)，比較了不同提取溶劑（50%甲醇、60%甲醇、70%甲醇）和不同超聲提取時(shí)間（20、30、40 min）的提取效率。結(jié)果顯示，以60%甲醇提取時(shí)，樣品中雜質(zhì)較少，提取效率較高;當(dāng)超聲提取時(shí)間為30 min時(shí)，提取效率最優(yōu)，再延長提取時(shí)間，提取效率無明顯變化，故最終確定以60%甲醇超聲30 min作為供試品溶液的制備方法。

3.3 指紋圖譜的化學(xué)模式識(shí)別分析

本研究結(jié)果表明，24批心安膠囊樣品有12個(gè)共有峰，且各色譜圖整體相似，與對照指紋圖譜的相似度均大于0.97。比較24批樣品的外觀及其指紋圖譜特征發(fā)現(xiàn)，承德廠家產(chǎn)心安膠囊樣品（編號(hào)S1～S15）內(nèi)容物呈棕灰色，顏色較淺，色譜圖所示色譜峰較多且響應(yīng)較強(qiáng);四川廠家產(chǎn)心安膠囊樣品（編號(hào)S16～S18）內(nèi)容物呈灰黃色，顏色淺，色譜圖所示色譜峰較多;遼寧廠家產(chǎn)心安膠囊樣品（編號(hào)S19～S24）為深棕褐色，顏色較深，色譜圖所示色譜峰較少。CA、PCA及PLS-DA均將24批樣品分為3類，且均隨廠家不同而明顯區(qū)分，分類結(jié)果一致。PLS-DA指出，6號(hào)峰對應(yīng)成分和牡荊素葡萄糖苷（7號(hào)峰）、牡荊素鼠李糖苷（8號(hào)峰）、金絲桃苷（10號(hào)峰）、異槲皮素（11號(hào)峰）為差異標(biāo)志物，提示生產(chǎn)廠家在生產(chǎn)過程中應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注上述成分的含量，以提高心安膠囊的整體穩(wěn)定性。筆者進(jìn)一步分析了造成這種差異的原因，可能與廠家的生產(chǎn)工藝以及山楂葉原藥材的生長環(huán)境、海拔、光照、采收期、儲(chǔ)藏等因素有關(guān)，具體原因有待結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)調(diào)研進(jìn)一步確認(rèn)。

4 結(jié)語

綜上所述，本研究建立的HPLC指紋圖譜、多成分定量方法簡單、可行，可較全面地分析心安膠囊的成分信息，結(jié)合CA、PCA和PLS-DA可對該制劑進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，使分析結(jié)果更為科學(xué)、全面，可為完善心安膠囊的藥品標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。后續(xù)本課題組將進(jìn)一步加大樣本量，通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對未知成分進(jìn)行指認(rèn)，進(jìn)一步開展心安膠囊譜效關(guān)系、代謝組學(xué)研究，為全面評(píng)價(jià)心安膠囊的質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2021-10-28 修回日期：2022-01-23）

（編輯：曾海蓉）