汪 卿，游秋云，丁 莉，夏 婧，王 平

（湖北中醫(yī)藥大學老年醫(yī)學研究所 武漢 430065）

睡眠是生命活動中不可缺少的一種生理現(xiàn)象，良好的睡眠有利于生長發(fā)育、機體恢復(fù)以及保持心理健康等。但隨著現(xiàn)代人生活方式的變遷，尤其是新冠疫情引發(fā)的后續(xù)心理問題，導致失眠癥的發(fā)病率逐年增高。中國睡眠研究會公布的中國成人失眠患病率已經(jīng)達到57%[1]。長期失眠不僅會導致生活質(zhì)量下降，還會造成能量代謝紊亂，增加肥胖、糖尿病及代謝綜合征等疾病的風險[2]。

研究表明，生物節(jié)律和內(nèi)穩(wěn)態(tài)是調(diào)控睡眠的兩大關(guān)鍵因素，二者又互為影響[3]。一方面生物鐘的節(jié)律表達參與了機體能量代謝的調(diào)控。全基因組基因表達譜分析發(fā)現(xiàn)，大約有15%的轉(zhuǎn)錄組基因呈周期性表達，其中大部分是參與編碼碳水化合物、脂肪酸代謝、膽固醇生物合成的重要調(diào)節(jié)劑[4]。另一方面晝夜節(jié)律的破壞是誘發(fā)代謝性疾病的危險因素。如輪班工作者患二型糖尿病、胃腸疾病、肥胖、代謝紊亂等的發(fā)病率顯著升高[5]；小鼠時鐘基因（Clock）突變、時鐘管理基因（Bmal1）缺陷或SCN受損，都會引起葡萄糖耐受能力、胰島素敏感性降低，表現(xiàn)為食欲旺盛、晝夜飲食節(jié)律減弱，并且隨著年齡的增長問題更為突出[6]?？梢姡镧娋W(wǎng)絡(luò)和代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是交織在一起，提示我們可以通過研究生物鐘基因調(diào)控能量代謝的機制，來探索失眠防治的方向和路徑[7]。

相較于以中樞神經(jīng)系統(tǒng)鎮(zhèn)靜催眠為主的化學藥物長時間使用會出現(xiàn)藥物依賴、呼吸抑制、損傷認知和精神系統(tǒng)等副作用，中醫(yī)藥在失眠防治領(lǐng)域中顯示出獨特優(yōu)勢[8]。經(jīng)典古方安寐丹，出自清代陳士鐸《石室秘錄》一書。書云：“心經(jīng)之病，怔忡、不寐等癥，乃心血少矣……”方中人參益心氣，丹參、當歸補心血，麥冬養(yǎng)心陰，菖蒲開心竅，茯神、棗仁、甘草補心神，五味子斂心氣，諸藥合用，共奏益氣養(yǎng)心安神之功效。臨床用于治療虛證失眠并隨癥加減能收到良好效果[9]。課題組前期實驗也證實，安寐丹可通過修復(fù)線粒體分裂/融合失衡狀態(tài)、食欲素水平等改善睡眠剝奪（SD）模型大鼠神經(jīng)細胞凋亡，恢復(fù)晝夜節(jié)律及學習記憶水平[10-11]。安寐丹浸泡給藥后能恢復(fù)光照SD斑馬魚幼魚晝夜節(jié)律，且鎮(zhèn)靜催眠效果隨劑量升高而增加，其機制可能與調(diào)節(jié)MAPK/MNK/eIF4E通路相關(guān)[12]。本研究選用模式生物斑馬魚為研究對象，采用咖啡因做誘導劑建立成年斑馬魚睡眠剝奪模型，觀察安寐丹浸泡給藥后對晝夜節(jié)律和能量代謝水平的影響，探討了安寐丹在調(diào)控斑馬魚睡眠中的作用機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗所用斑馬魚為4月齡野生型AB系，購自國家斑馬魚資源中心并于湖北中醫(yī)藥大學老年醫(yī)學研究所斑馬魚實驗室繁殖飼養(yǎng)，參照Westerfield方法[13]，設(shè)置溫度為28℃，光黑交替循環(huán)為14 h：10 h，每天按時喂食豐年蝦兩次。

1.2 實驗藥物與儀器

1.2.1 主要藥物與試劑

安寐顆粒（湖北中醫(yī)藥大學老年醫(yī)學研究所提供[14]）；褪黑素（Sigma公司，批號：M5250）；咖啡因（巴菲爾公司，批號：58-08-2）；RNA提取液（批號：G3013）、RT First Strand cDNA Synthesis Kit（批號：G3330）、2×SYBR Green qPCR Master Mix （High ROX） [A Synthesis Kit（批號：G3322）]，以上試劑均由武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司提供；總蛋白定量測試盒考馬斯亮藍法（批號：A045-2）、超微量三磷酸腺苷（ATP）酶測試盒（批號：A070-6），以上試劑均由南京建成弘大生物科技有限公司提供；尼氏染色液（南京生航生物技術(shù)有限公司，批號：DL-082）。

1.2.2 主要儀器與設(shè)備

斑馬魚行為分析系統(tǒng)（法國View Point Life Science，Videotrack Track 3.5）、T迷宮（法國 View Point Life Science，TF105B）、實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀（Real time-PCR，美國Bio-Rad公司，CFX96）、超微量分光光度計（美國Thermo公司，ND2000）、酶標檢測儀（美國Biotek公司，Epoch）、病理包埋機（德國Leica公司，RM2016）、切片機（德國Leica公司，RM2016）、熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司，IX71）。

1.3 實驗分組

1.3.1 分組及給藥

將斑馬魚隨機分成5組，分別為空白組、模型組、褪黑素組、安寐丹低劑量組、安寐丹高劑量組，每組15尾?？瞻捉M：正常飼養(yǎng)；模型組：用25 mg·L-1的咖啡因溶液浸泡24 h[15]；褪黑素組：用25 mg·L-1的咖啡因溶液浸泡給藥22 h后再轉(zhuǎn)移到0.464 mg·L-1褪黑素溶液中浸泡給藥2 h；安寐丹低組：用25 mg·L-1的咖啡因溶液浸泡給藥22 h后再轉(zhuǎn)移到0.129 g·L-1安寐丹溶液中浸泡給藥2 h；安寐丹高組：用25 mg·L-1的咖啡因溶液浸泡給藥22 h后再轉(zhuǎn)移到0.514 g·L-1安寐丹溶液中浸泡給藥2 h。各組每日放入T迷宮中訓練，以此循環(huán)4天。

1.3.2 樣本采集

行為學檢測結(jié)束后，將斑馬魚放入冰水混合物中處死，于冰上迅速分離腦、肝臟等組織，用于組織切片樣本固定于4%多聚甲醛溶液放于4℃冰箱備用，用于分子生物分析樣本裝于滅菌EP管放于-80℃冰箱備用。

1.4 指標檢測

1.4.1 24 h行為學檢測

將各組斑馬魚置于斑馬魚行為分析系統(tǒng)中，根據(jù)成魚游動速率設(shè)置參數(shù)范圍為：靜止（＜5 mm·s-1，黑色）、小運動（5-25 mm·s-1，綠色）、大運動（＞25 mm·s-1，紅色），監(jiān)測24 h內(nèi)斑馬魚不同狀態(tài)運動計數(shù)、運動時間和運動距離。儀器將自動追蹤斑馬魚的行為軌跡，檢測結(jié)束后自動產(chǎn)生數(shù)據(jù)記錄與行為軌跡圖。

1.4.2 T迷宮實驗

T型迷宮由水平等長的左右臂和垂直起始臂組成，在起始臂的最前端設(shè)置一個可控的擋板隔開，根據(jù)斑馬魚顏色偏好[16]，右臂標記綠色，并在深水區(qū)放置孵化的豐年蝦食物設(shè)為營養(yǎng)富集區(qū)（EC區(qū)），左臂標記紅色，不放置食物。

實驗測試包括3個階段：第1個階段是適應(yīng)階段。將所有斑馬魚都放入T迷宮中自由游動，以適應(yīng)新環(huán)境，為期2天。第2階段是訓練實驗。將每組斑馬魚分別放在T迷宮的起始區(qū)域，待魚適應(yīng)穩(wěn)定30 s后，輕輕抽出隔板，記錄斑馬魚在T迷宮中探索6 min的行動軌跡，分別記錄第1次進入EC區(qū)的時間以及在EC區(qū)停留的總時間，未進入者記為0 min，超過6 min記為6 min。測試時間內(nèi)沒有進入EC區(qū)的將被人為引導到EC區(qū)，并讓它在其中停留1 min。訓練測試連續(xù)4天每天1次。第3階段是正式實驗。在最后1次訓練實驗的第2天進行記憶能力正式實驗，但不以食物作為獎勵，以評估學習記憶情況。配合斑馬魚行為分析系統(tǒng)記錄并分析每尾斑馬魚的行為軌跡。

1.4.3 尼氏染色觀察中腦神經(jīng)元形態(tài)

全腦經(jīng)4%多聚甲醛固定后，用PBS沖洗組織表面，切片機連續(xù)冠狀切片，PBS洗片3次，將切片放入1%尼氏染色液染色中浸染10 min。然后使用蒸餾水沖洗，用分色液分化10 s以清除背景。梯度乙醇脫水，再用二甲苯透明。最后中性樹膠封片，在顯微鏡下進行拍照，觀察中腦神經(jīng)元及尼氏小體變化。

1.4.4 Real time-PCR檢測clocka、bmal1、晶體蛋白基因（Cry）1a、系列周期基因（Per）1a、per2mRNA表達水平

取斑馬魚腦組織，使用TRIzol提取總RNA溶于15 μL ddH2O并進行逆轉(zhuǎn)錄，而后使用Real time-PCR反應(yīng)，以rpl13a為內(nèi)參測定時鐘基因clocka、bmal1、cry1a、per1a和per2的相對量。結(jié)果采用 2-ΔΔCT法表示各mRNA表達。引物設(shè)計均由武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司代合成，引物序列見表1。

1.4.5 定磷法測定肝臟中Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶及總ATP酶活力

由于ATP酶可分解ATP生成二磷酸腺苷和無機磷，因此測定無機磷含量可間接判斷ATP酶的活性。首先，取斑馬魚肝臟，準確稱取組織重量進行勻漿，采用考馬斯亮藍法測定斑馬魚肝臟蛋白濃度。然后采用定磷法按照超微量Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、總ATP酶測試盒說明書進行檢測。計算公式：組織中ATPase活力（U·mg-1）=（測定OD值-對照OD值）（/標準OD值-空白OD值）×標準品濃度（0.02 μmol·mL-1）×6*×7.8**/待測樣本蛋白濃度（mg·mL-1），注：6*：定義上為每小時，實際操作為10 min反應(yīng)，所以必須乘6；7.8**：反應(yīng)體系中7.8倍稀釋

表1 引物序列

1.5 統(tǒng)計學方法

用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件處理所有采集數(shù)據(jù)，運用Graphpad Prism 6.0繪制圖形。數(shù)據(jù)通過單因素方差分析，使用LSD、沃德-鄧肯法對組間進行統(tǒng)計評估，以平均值±標準差（）表示，當結(jié)果P＜0.05時被認為具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 安寐丹對SD斑馬魚24 h自主活動的影響

結(jié)果顯示，與空白組相比，SD斑馬魚靜止狀態(tài)總計數(shù)、持續(xù)時長、覆蓋距離減少，大運動狀態(tài)總計數(shù)、持續(xù)時長、覆蓋距離增加，24 h晝夜節(jié)律變化幅度特征降低，但未見統(tǒng)計學差異。與模型組相比，藥物干預(yù)能恢復(fù)模型晝夜節(jié)律特征，其中褪黑素、安寐丹高劑量可增加靜止狀態(tài)計數(shù)（P＜0.05）、減少大運動狀態(tài)計數(shù)（P＜0.05），安寐丹低劑量增加靜止狀態(tài)計數(shù)（P＜0.05）（圖1，表2）。

2.2 安寐丹對SD斑馬魚學習記憶能力的影響

除模型組外，各組隨著訓練時間延長第1次進入EC區(qū)時間均有不同程度的縮短。正式實驗結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組第1次進入EC區(qū)的時間顯著增加（P＜0.05），多在主臂徘徊，少數(shù)斑馬魚進入EC區(qū)后又游出，累計停留時間減少。與模型組相比，褪黑素組斑馬魚第1次進入EC區(qū)的時間顯著縮短（P＜0.05），EC區(qū)的停留時間顯著增加（P＜0.05），安寐丹組也出現(xiàn)改善效果，但差異無統(tǒng)計學意義（圖2，表3、4）。

圖1 安寐丹對SD斑馬魚24 h自主活動的影響（n=4）

表2 各組24 h不同狀態(tài)總計數(shù)（n=4）

圖2 正式實驗各組T迷宮軌跡圖（n=5）

2.3 安寐丹對斑馬魚中腦神經(jīng)元的影響

尼氏染色是觀察神經(jīng)細胞改變的一種檢測方法，染色結(jié)果顯示，空白組斑馬魚中腦組織神經(jīng)細胞數(shù)目正常，視蓋區(qū)細胞集中分布在中央灰質(zhì)層，尼氏小體多見，著色顯著，核相對完整。與空白組比較，模型組中腦神經(jīng)細胞數(shù)目明顯減少，細胞周圍裂隙增寬，尼氏小體明顯減少，著色淺。經(jīng)安寐丹干預(yù)后，SD斑馬魚神經(jīng)元胞體較為飽滿，丟失情況明顯好轉(zhuǎn)，尼氏小體部分可見，著色加深，且高劑量效果優(yōu)于低劑量組。褪黑素組同樣可見中腦神經(jīng)元數(shù)目增加，損傷減輕（圖3）。

2.4 安寐丹對腦組織clocka、bmal1、cry1a、per1a、per2 mRNA表達的影響

Real time-PCR結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組bmal1和cry1a基因的mRNA相對表達量顯著上調(diào)（P＜0.01）。與模型組比較，褪黑素及安寐丹處理后能降低bmal1和cry1amRNA相對表達量（P＜0.01）（表 5）。

表3 各組第一次進入EC區(qū)時間（n=5）

表4 各組在EC區(qū)累計停留時間（n=5）

表5 各組斑馬魚腦組織clocka、bmal1、cry1a、per1a、per2 mRNA相對表達量（n=3）

表6 各組斑馬魚肝臟Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、總ATP酶活力（n=6）

2.5 安寐丹對肝臟Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶及總ATP酶活力的影響

模型組肝臟Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶及總ATP酶活性均較正常斑馬魚減少，但差異未見統(tǒng)計學意義。安寐丹干預(yù)后，高劑量組三種酶的活性均顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）；低劑量組總ATP酶活力顯著增加（P＜0.05）。褪黑素組總ATP酶及Na+-K+-ATP酶活力顯著增加（P＜0.01）（表6）。

3 討論

睡眠剝奪是一種造成動物失眠的有效方式[17]，咖啡因是制造SD模型的常用中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮劑，通過結(jié)合神經(jīng)遞質(zhì)腺苷A2A受體抑制睡眠，增強覺醒。我們前期實驗結(jié)果證實咖啡因能有效誘導斑馬魚SD模型[18]，尤其是高劑量的咖啡因，可以通過影響海馬神經(jīng)元凋亡加重SD模型認知損傷[19]。故本實驗采用模式生物斑馬魚為研究對象，選取咖啡因誘導建立斑馬魚SD模型。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)與空白組相比，模型組24 h行為學節(jié)律特征降低，靜止狀態(tài)總計數(shù)、持續(xù)時長、覆蓋距離均減少，運動狀態(tài)則顯著增加，并且以大運動為主；睡眠還可以幫助記憶信息存儲，SD則會影響大腦編碼神經(jīng)元整合信息，降低學習記憶水平[17]。實驗發(fā)現(xiàn)SD模型學習記憶能力受損，隨著訓練時間延長第1次進入EC區(qū)的時間未見縮短，與空白組相比，正式實驗中進入EC區(qū)時間顯著增加（P＜0.05），累計停留時間減少；與人腦不同，魚腦的形態(tài)是原始的，與視器有關(guān)的中腦占主要地位，通過發(fā)達的視網(wǎng)膜接收區(qū)來控制運動行為[20]。尼氏染色顯示SD模型中腦神經(jīng)細胞、尼氏小體數(shù)目減少，裂隙增寬，著色變淺，提示模型的行為學變化與神經(jīng)細胞受損密切相關(guān)。

晝夜節(jié)律的產(chǎn)生依賴于生物體自身的生物鐘系統(tǒng)以及鐘控基因組建的復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中CLOCK和Bmal1形成異源二聚體誘導鐘控基因PER和CRY的轉(zhuǎn)錄，并隨著誘導基因的轉(zhuǎn)移增多形成負反饋，構(gòu)成了節(jié)律震蕩最為重要的驅(qū)動回路[21]。因此我們從鐘控基因入手繼續(xù)探討了造成模型行為學改變的機制，發(fā)現(xiàn)SD模型的核心生物鐘基因clocka、bmal1（P＜0.01）、cry1a（P＜0.01）、per1a、per2mRNA表達水平較空白組升高，提示SD導致內(nèi)源性生物鐘紊亂，這可能是引起睡眠-覺醒周期異常的重要原因。

同時生物鐘參與了機體能量代謝的調(diào)控并依賴于細胞膜上的離子泵等限速酶[22]。離子泵即ATP酶，鈉鉀泵是細胞的Na+-K+-ATP酶，鈣鎂泵是細胞的Ca2+-Mg2+-ATP酶，它們都參與了細胞逆濃度梯度的主動運輸，且酶的活性與轉(zhuǎn)運強度成正比。有研究發(fā)現(xiàn)SD令興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸釋放，通過谷氨酸離子型受體使鈣離子內(nèi)流，細胞內(nèi)鈣離子含量升高[23]。我們實驗也證實SD使能量代謝Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶及總ATP酶活性降低，會減少物質(zhì)的交換和毒素的外排，從而破壞代謝穩(wěn)態(tài)。提示SD會干預(yù)生物鐘基因功能，打破肝細胞跨膜轉(zhuǎn)運平衡，影響能量代謝。

安寐丹是中醫(yī)治療失眠癥的代表方，針對上述SD導致的行為學、細胞形態(tài)學及分子生物學改變結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)與模型組相比，安寐丹能恢復(fù)模型晝夜節(jié)律特征，增加靜止狀態(tài)計數(shù)（P＜0.05）、減少大運動狀態(tài)計數(shù)（P＜0.05）；縮短第1次進入EC區(qū)的時間，增加EC區(qū)的停留時間；保護神經(jīng)元胞體結(jié)構(gòu)，增加尼氏小體數(shù)目；降低生物鐘基因clocka、bmal1（P＜0.01）、cry1a（P＜0.01）、per1a、per2mRNA 相對表達量；升高 Na+-K+-ATP酶（P＜0.05）、Ca2+-Mg2+-ATP酶（P＜0.01）及總ATP酶（P＜0.05）活力，并且結(jié)果呈現(xiàn)出劑量相關(guān)性。提示安寐丹對生物鐘基因異常表達導致晝夜節(jié)律紊亂，影響能量代謝穩(wěn)態(tài)，造成神經(jīng)元損傷這一過程有顯著的拮抗作用。

另外褪黑激素作為一種潛在的同時參與調(diào)節(jié)睡眠覺醒和能量代謝的激素[24]，設(shè)為陽性對照藥，實驗發(fā)現(xiàn)褪黑素可顯著改善SD斑馬魚的鎮(zhèn)靜和睡眠質(zhì)量，維持代謝平衡，與安寐丹低劑量組相比在降低bmal1（P＜0.05）、cry1a（P＜0.01）mRNA水平上更為顯著，但與安寐丹高劑量組相比未見明顯差異。

綜上所述，安寐丹可以恢復(fù)斑馬魚睡眠剝奪模型晝夜節(jié)律，增強學習記憶能力，保護神經(jīng)元結(jié)構(gòu)，其機制可能與干預(yù)bmal1、cry1a等生物鐘基因，提高Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、總ATP酶等能量代謝酶活性相關(guān)。但本實驗并未對生物鐘干預(yù)能量代謝的關(guān)鍵途徑進行深一步的探討，后期將繼續(xù)開展晝夜節(jié)律與能量代謝的關(guān)聯(lián)性分析和機制研究。