閆鵬東，付 盟，韋潔敏，張國彥，崔浪軍

(1.西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室/藥用資源與天然藥物化學(xué)教育部重點實驗室/陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710119；2.延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西延安 716000；3.城固縣群利中藥材合作社，陜西 漢中 723200)

附子是毛茛科植物烏頭(AconitumcarmichaeliDebx.)的子根，是我國著名的傳統(tǒng)大宗中藥材之一。附子始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被譽為“回陽救逆第一品藥”。附子因其具有抗炎、鎮(zhèn)痛、強心、抗心律失常、降血糖、抗癌、免疫抑制等藥理作用[1]，被廣泛用于醫(yī)藥、食療行業(yè)。隨著近年來我國中醫(yī)藥行業(yè)的升溫，以及附子的相關(guān)藥理學(xué)研究的深入，市場對附子的需求量逐步增加，全國附子的種植面積也隨之增加。磷是植物生長和繁殖過程中所必需的基本營養(yǎng)元素之一，對植物的生長發(fā)育、產(chǎn)量形成、品質(zhì)改善具有重要意義[2, 3]。磷肥包括磷酸二氫鉀、過磷酸鈣、鈣鎂磷肥等多種，不同的磷肥對不同的作物產(chǎn)量和品質(zhì)影響不同[4, 5]。磷肥施入土壤，經(jīng)溶解和水解作用，以不同形式的磷酸離子存在，易被土壤吸附、固持，加之一些土壤微生物將磷肥轉(zhuǎn)化為作物不易吸收的有機形式，使磷肥在土壤中表現(xiàn)為低利用性，因此在生產(chǎn)實踐中常投入過量磷肥。過量的使用磷肥不僅造成肥料肥效降低、作物收益減少、作物品質(zhì)下降等問題，還引起水土安全隱患[6, 7]。因此農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，需要根據(jù)作物種類科學(xué)選擇合適的磷肥以及合適的施肥量。

目前附子以陜西、四川和云南等地為主產(chǎn)地，經(jīng)筆者走訪，當(dāng)?shù)厮庌r(nóng)在附子栽培過程中大量使用磷肥，但施用的磷肥種類和效果各異?？茖W(xué)選擇磷肥在最大可能提高附子產(chǎn)量與品質(zhì)的同時，對于降低磷肥的施用量、保護水土安全意義重大。而目前關(guān)于附子對磷肥種類的偏好和用量上缺乏系統(tǒng)研究。基于此，本研究在盆栽條件下，研究了三種磷肥在不同施肥水平下對附子產(chǎn)量、農(nóng)藝性狀以及品質(zhì)的影響，以期為附子合理施加磷肥提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試附子種質(zhì)：試驗前一周自附子道地產(chǎn)區(qū)漢中采挖附子種根，挑選無焦巴、霉?fàn)€、鋤傷、水漩及缺芽的大小均一的二級種根用于試驗。種根經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定及薄層色譜鑒定[8]為A.carmichaeliDebx.的子根。

主要試驗試劑：甲醇、乙腈、乙酸銨、甲酸均購于美國Fisher Chemical，生物堿對照品均購于成都曼斯特生物科技有限公司，磷酸二氫鉀(P2O5=52%)購于什邡華蓉科技有限責(zé)任公司，過磷酸鈣(P2O5=18%)購于山東科達化肥有限公司，鈣鎂磷肥(P2O5=17%)購于廣西鹿寨化肥有限責(zé)任公司，碳酸氫銨、硫酸鉀、以及其余試劑均購于天津天利化學(xué)試劑有限公司。

主要試驗儀器：島津LC-2030高效液相色譜儀(日本島津株式會社)，Tecan Infinit® F50酶標(biāo)儀(上海帝肯貿(mào)易有限公司)。

1.2 試驗設(shè)計

2017年10月在陜西師范大學(xué)長安校區(qū)試驗田進行盆栽試驗。首先，將除去草根、石頭等雜物并充分?jǐn)嚢杈鶆虻闹行匀劳裂b入直徑35 cm、高40 cm的塑料盆中，共裝100盆。再將所有盆施入等量的氮肥(NH4HCO3：21.33 g和鉀肥(K2SO4：2.097 g)。隨后將這些盆隨機分為10組，每組10個重復(fù)，隨機選取一組作為不施任何磷肥的空白對照組，剩余9組以P2O5含量為基準(zhǔn)按照表1方案進行施肥處理。

表1 磷肥試驗方案

1.3 農(nóng)藝性狀測定

所有附子于2018年10月15日采挖。采挖前，量取附子株高和莖粗，采挖后統(tǒng)計每個植株的附子個數(shù)，將附子洗凈、晾干后，測量其最大附子直徑、最小附子直徑、最大附子重量和最小附子重量。

1.4 附子產(chǎn)量、可溶性蛋白含量、多糖含量測定

統(tǒng)計完附子農(nóng)藝性狀后，隨機取4個植株的附子，放置于60 ℃的烘箱中烘干至恒重，稱量干重并計算出每株產(chǎn)量。隨后將干燥后的附子粉碎過100目篩，攪拌均勻，取適量粉末用考馬斯亮藍(lán)法[9]測定其可溶性蛋白含量，同時取部分粉末用蒽酮-硫酸法[10]測定其多糖含量，剩余粉末在室溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 附子生物堿測定

采用高效液相色譜法(HPLC)測定生物堿含量。

1.5.1 液相色譜條件 色譜柱為Venusil XBP C18 (L)，規(guī)格為4.6 mm×250 mm×5 μm。

流動相A液為含0.1%甲酸的2 mmol/L乙酸銨溶液，B液為乙腈。

洗脫程序：柱溫35 ℃；流速1 mL/min；進樣量10 μL；梯度程序為0 min時0%B液，3 min時8%B液，10 min時20%B液，15 min時25%B液，30 min時50%B液。

1.5.2 對照品制備 精密稱取鹽酸多巴胺、去甲豬毛菜堿、宋果靈、多根烏頭堿、棍掌堿、塔拉薩敏、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿這12種標(biāo)準(zhǔn)品，分別置于25 mL容量瓶中，加0.05 mol/L鹽酸溶液定容至25 mL，配制成濃度為0.5 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品對照溶液。取上述12種對照品溶液各1 mL至25 mL量瓶中，加0.05 mol/L鹽酸溶液定容至25 mL，得混合對照品貯備液。

1.5.3 供試品制備 將附子干燥、粉碎、過100目篩后混勻。精密稱取附子粉末1.0 g，加入5 mL 0.05 mol/L鹽酸溶液，搖勻，超聲30 min，于3 000 r/min離心10 min。精密量取上清液0.5 mL，用甲醇定容至2.5 mL，用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

1.5.4 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線 取對照品儲備液適量，用色譜甲醇稀釋成不同濃度梯度的對照品溶液，在擬定的HPLC條件下測定。以待測物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X，待測物的峰面積為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各生物堿回歸方程及其相關(guān)系數(shù)。

1.5.5 方法學(xué)驗證 精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復(fù)性試驗、加樣回收率試驗參考唐進法文章[11]進行驗證。

1.6 數(shù)據(jù)分析方法

采用Excel 2019、SPSS 23、GraphPad Prism 8進行組間差異分析，綜合評價分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 附子農(nóng)藝性狀結(jié)果

表2為不同處理下的附子農(nóng)藝性狀。從表2中可以看出，莖粗、單株附子個數(shù)、最小附子直徑在各處理下雖有變化但彼此間無顯著差異(P>0.05)。與對照組相比，株高在低水平鈣鎂磷肥處理下顯著增長(P< 0.05)，其余處理均無顯著變化；最大附子重量在低、中水平鈣鎂磷肥處理下增加最多，但與對照組相比無顯著差異；最大附子直徑在中水平鈣鎂磷肥處理下最大，低水平鈣鎂磷肥處理次之，但與對照組相比均無顯著差異。最小附子重量在施肥后全部減少，以中水平鈣鎂磷肥處理下減少的最少，且與對照組相比無顯著差異，其余處理與對照相比均顯著減少。

表2 不同處理下的附子農(nóng)藝性狀

2.2 附子產(chǎn)量、可溶性蛋白含量、多糖含量結(jié)果

圖1為不同處理下的附子產(chǎn)量、可溶性蛋白含量和多糖含量。在產(chǎn)量方面，高水平磷酸二氫鉀處理下產(chǎn)量最高，中水平鈣鎂磷肥產(chǎn)量次之，兩者與空白對照組相比均顯著增加。在低水平過磷酸鈣處理下產(chǎn)量最低，高水平鈣鎂磷肥處理次之，與對照組相比均極顯著減少(P< 0.01)。在可溶性蛋白含量方面，與對照組相比其在所有處理下均增加，除高水平磷酸二氫鉀、高水平過磷酸鈣處理無顯著差異外，其余處理都為顯著增加，且以低水平磷酸二氫鉀處理增加最多。在附子多糖含量方面，與對照組相比低、中、高水平磷酸二氫鉀處理的附子多糖含量均為極顯著增加，其余處理均有減少，其中以高水平鈣鎂磷肥處理減少最多，為極顯著減少。

圖1 不同處理下的附子產(chǎn)量(A)、可溶性蛋白含量(B)、多糖含量(C)

2.3 附子生物堿含量結(jié)果

2.3.1 附子生物堿標(biāo)準(zhǔn)曲線與液相色譜方法學(xué)驗證結(jié)果 附子各生物堿標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及其相關(guān)系數(shù)結(jié)果見表3。

方法學(xué)驗證結(jié)果見表3，其中精密度試驗結(jié)果顯示12種生物堿精密度RSD在1.05%～3.99%之間，穩(wěn)定性試驗RSD在1.38%～4.89%之間，重復(fù)性試驗RSD在1.38%～4.23%之間，加樣回收率試驗回收率在97.64%～101.75%之間，RSD在1.01%～4.53%之間，這些表明該方法精密度良好，重復(fù)性良好，且供試品溶液在在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

表3 生物堿含量回歸方程、相關(guān)系數(shù)以及方法學(xué)驗證

2.3.2 附子生物堿含量結(jié)果 表4為不同處理下的各種生物堿的含量。與對照組相比，其中鹽酸多巴胺在處理后全部顯著增加，且以低水平鈣鎂磷肥處理增加最多，高水平磷酸二氫鉀處理次之；去甲豬毛菜堿除在中水平磷酸二氫鉀處理略有減少、高水平鈣鎂磷肥處理顯著減少外，其余處理下均增加，且在低、中水平鈣鎂磷肥處理下顯著增長，并以中水平鈣鎂磷肥處理增加最多；宋果靈則在處理后全部顯著降低，其中以中水平磷酸二氫鉀、低、中水平鈣鎂磷肥處理降低最少；多根烏頭堿在處理后除高水平磷酸二氫鉀輕微增長外，其余皆為顯著增加，且以中水平鈣鎂磷肥、高水平過磷酸鈣處理下增加最多；棍掌堿在低、中水平磷酸二氫鉀處理下降低，其余處理下均增加，其中低、高水平過磷酸鈣、低水平鈣鎂磷肥處理顯著增加；塔拉薩敏在處理后只有中水平過磷酸鈣、低、中水平鈣鎂磷肥略有增加，其余均為減少，但整體無顯著差異；苯甲酰新烏頭原堿除在低、中水平磷酸二氫鉀處理下顯著減少外，其余處理下均顯著增加，以低水平鈣鎂磷肥增加最多；苯甲酰烏頭原堿除在低、中水平磷酸二氫鉀處理下顯著增加外，其余處理下變化不大；苯甲酰次烏頭原堿在處理后均顯著增加，以中水平鈣鎂磷肥處理增加最多，低水平鈣鎂磷肥次之；新烏頭堿在在低、中水平鈣鎂磷肥處理下增加最多，高水平鈣鎂磷肥處理下減少最多，但整體上均無顯著差異；烏頭堿在中水平鈣鎂磷肥處理下顯著增加，其余處理均減少，其中在高水平過磷酸鈣、高水平鈣鎂磷肥、中水平磷酸二氫鉀處理下顯著減少；次烏頭堿除在低、中水平鈣鎂磷肥處理后無顯著變化外，其余處理均顯著降低，并以高水平鈣鎂磷肥減少最多。

表4 不同處理下的附子生物堿含量 (mg/g)

整體來看，總雙酯型生物堿在處理后，除高水平鈣鎂磷肥顯著減少外，其余處理下雖有所減少，但都無顯著差異，并以中、低水平鈣鎂磷肥處理減少最少；總單酯型生物堿在處理后均上升，除低水平磷酸二氫鉀無顯著差異外，其余均顯著增加，其中以低水平鈣鎂磷肥增加最多；總生物堿在處理后均有所增長，其中中水平鈣鎂磷肥、低水平過磷酸鈣、低水平鈣鎂磷肥、高水平過磷酸鈣處理下顯著增加，其余處理無顯著差異。

2.4 主成分分析結(jié)果

通過SPSS軟件，將所有試驗附子的產(chǎn)量、株高、多糖含量、鹽酸多巴胺含量等22項指標(biāo)的數(shù)據(jù)采取標(biāo)準(zhǔn)化處理進行主成分分析。以特征值大于1提取了六個主成分，其累積方差貢獻率為89.542%，可代表原始數(shù)據(jù)的絕大部分信息，其中主成分特征值及方差貢獻率見表5，成分矩陣見表6。

表5 主成分的特征值及方差貢獻率

表6 成分矩陣

表7 得分及排名

以綜合得分來看，不施磷肥的對照組排名最低，施加低、中、高水平磷酸二氫鉀的排名為第6、7、3，施加低、中、高水平過磷酸鈣的排名為5、4、8，施加低、中、高水平鈣鎂磷肥的排名為2、1、9。

3 討論

3.1 不同處理對附子農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量的影響

在本試驗中，筆者發(fā)現(xiàn)施加了高水平磷酸二氫鉀的單株附子個數(shù)最多，并且產(chǎn)量為最好。施加了中水平鈣鎂磷肥的附子個頭最大，產(chǎn)量也有明顯提升。而施加了過磷酸鈣后的附子產(chǎn)量全部降低。

筆者推測可能是由于磷酸二氫鉀作為一種特殊的磷肥，在高水平處理時引入了一定量的鉀元素，促進附子根系的生長，使附子個頭和個數(shù)增多，從而提高了附子的產(chǎn)量，在戴維等人的研究中發(fā)現(xiàn)，鉀元素對附子有著良好的增產(chǎn)效果[14]，這與筆者的試驗現(xiàn)象吻合；鈣鎂磷肥為枸溶性磷肥[15]，肥效長，能提供一定的鈣、硅、硫、鎂等有益元素[16]，從促進附子的生長，使其性狀與產(chǎn)量都較好；過磷酸鈣為水溶性速效肥，其有效成分移動慢、移動距離短、易被固定的特定，其在施用時需盡量與作物根系接觸，在唐莉等人的研究中發(fā)現(xiàn)尿素施用過多會“燒傷”附子種根創(chuàng)口[17]，經(jīng)查閱文獻，過磷酸鈣也有類似燒苗的現(xiàn)象[18]，而附子用塊根繁殖，推測施加過磷酸鈣時對附子創(chuàng)口造成了傷害，從而導(dǎo)致附子種根生長狀態(tài)差，進而引起產(chǎn)量降低。

整體來看，中、低水平鈣鎂磷肥和高水平磷酸二氫鉀能有效提升附子的性狀與產(chǎn)量。

3.2 不同處理對附子品質(zhì)的影響

藥用植物的品質(zhì)主要是由其化學(xué)成分決定的[19]。在當(dāng)前研究中，附子可溶性蛋白作為一種潛在的有效化學(xué)成分[20]，目前研究較少。在本試驗中，附子可溶性蛋白含量在所有處理后均增加，以低水平磷酸二氫鉀處理效果最好，各水平鈣鎂磷肥處理效果也比較好，其余一般。

附子多糖具有調(diào)節(jié)免疫、保護心肌細(xì)胞、降血糖降血脂等作用[1]，是近年來的附子藥理研究的熱點。筆者在此次施肥試驗中發(fā)現(xiàn)，附子多糖含量在磷酸二氫鉀處理中全部極顯著增加，而在過磷酸鈣、鈣鎂磷肥組中全都降低，并在高水平時均為極顯著降低。目前有學(xué)者在研究施肥對黃精多糖含量影響時發(fā)現(xiàn)，磷肥對多糖的合成影響為負(fù)效應(yīng)，鉀肥對多糖合成影響為正效應(yīng)，同時發(fā)現(xiàn)黃精多糖的合成需要一個較為穩(wěn)定的營養(yǎng)環(huán)境，施肥過多或過少均會導(dǎo)致多糖含量降低[21]。這與筆者的試驗現(xiàn)象較為一致。由此推斷，較好的多糖含量，需要在施磷肥的同時增施一定的鉀元素，且要使其保持在穩(wěn)定水平。

生物堿是附子的主要藥用化學(xué)成分，具有強心、抗炎、鎮(zhèn)痛等多種功效[1, 22]，研究不同磷肥在不同施肥量下對其含量的影響具有重要意義。在張燕對益母草的施肥試驗[23]和鄧秋林對瓦布貝母的施肥試驗[24]中，發(fā)現(xiàn)施加過磷酸鈣后作物總生物堿含量增加，同時岳聰慧在土壤營養(yǎng)成分與附子生物堿含量的關(guān)系研究中發(fā)現(xiàn)，土壤速效磷與總生物堿存在顯著正相關(guān)[25]，這些表明磷肥能促進生物堿的合成，這與筆者的試驗結(jié)果一致。同時筆者在試驗中發(fā)現(xiàn)，中水平鈣鎂磷肥處理時，去甲豬毛菜堿、多根烏頭堿、塔拉薩敏、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿含量都比較高，且總生物堿含量最高。在低水平鈣鎂磷肥處理時，鹽酸多巴胺、去甲豬毛菜堿、宋果靈、棍掌堿、塔拉薩敏、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、次烏頭堿含量也比較高。由此推斷，中、低水平的鈣鎂磷肥對附子生物堿的合成具有促進效果。

3.3 基于主成分分析的附子施肥效果綜合評價

主成分分析法是一種降維分析，能將多個指標(biāo)轉(zhuǎn)化成彼此相互獨立的幾個主成分，同時在轉(zhuǎn)化過程中產(chǎn)生能反映主成分信息量的權(quán)數(shù)。以此來計算綜合評價值，可以在一定程度上克服主觀盲目性，進而客觀地反映樣本間的真實關(guān)系[26]。

在基于主成分分析的附子施肥效果綜合評價中，中水平鈣鎂磷肥處理排名最高、低水平鈣鎂磷肥次之、高水平磷酸二氫鉀排第3。同時，不施磷肥的對照組最差，排名第10。結(jié)合前面施肥對附子農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量和品質(zhì)的影響分析，此主成分分析清晰的將綜合施肥效果展示了出來，并且和農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量、品質(zhì)數(shù)據(jù)相互印證。

4 結(jié)論

綜上來看，施磷肥時應(yīng)首先考慮施用鈣鎂磷肥，以中水平的施肥量最好，低水平次之。同時也應(yīng)注意到，施加高水平鈣鎂磷肥時，其對附子的綜合效果變差，因而要避免使用高水平的鈣鎂磷肥。因而筆者今后的研究目標(biāo)將是細(xì)化鈣鎂磷肥的施肥用量梯度，以尋找最適合附子生長的最佳鈣鎂磷肥施用量。