畢融冰，王玉方，羅婧，趙卉

（中國農(nóng)業(yè)科學院 特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130000）

人參是我國傳統(tǒng)名貴中藥材之一，具有抗腫瘤、抗衰老、抗心律失常、降血糖、增強免疫功能、調(diào)節(jié)代謝、抗菌、抗氧化等功效[1-2]。人參作為一種多年生植物，一般采用噴灑農(nóng)藥的方式來防止在其生長過程中出現(xiàn)的病蟲害。2020版《中國藥典》四部[3]2341通則中藥材及飲片（植物類）的禁用農(nóng)藥及代謝物的種類擴增至33種，共54個農(nóng)藥殘留物化合物，更加說明農(nóng)藥殘留的監(jiān)控，在整個中藥材質(zhì)量安全評價中的重要作用。目前，農(nóng)藥殘留的測定多采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（gas chromatography tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）兩種[4-15]。劉韜等[4]建立了人參、西洋參中固相萃取法結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蚜滅磷、吡蟲啉、涕滅威、甲基內(nèi)吸磷、甲硫威、辛硫磷6種農(nóng)藥的分析方法；崔麗麗等[5]建立了一種 QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged and safe）結(jié)合GC-MS法同時測定人參中20種已登記的農(nóng)藥、常用殺菌劑苯和有機氯類農(nóng)藥殘留量的檢測技術(shù)；屈浩然等[6]利用直接提取法結(jié)合LC-MS/MS和GC-MS/MS檢測技術(shù)建立了人參中33種禁用農(nóng)藥多殘留測定方法。QuEChERS法作為一種快速、簡單、廉價、有效、穩(wěn)定和安全的樣品前處理方法，同時具備根據(jù)基質(zhì)特異性調(diào)整凈化材料和提取鹽包組合的優(yōu)勢，本文通過對人參在不同QuEChERS凈化劑配比、提取鹽包組合及LC-MS/MS儀器條件的分析比較，建立了一種凈化方式簡單、提取充分、回收率較高的人參中30種農(nóng)藥多殘留QuEChERS/LC-MS/MS測定方法，在指導人參種植、評價人參品質(zhì)方面具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲胺磷[10265-92-6]、苯線磷[22224-92-6]、苯線磷砜[31972-44-8]、苯線磷亞砜[31972-43-7]、地蟲硫磷[944-22-9]、治螟磷[3689-24-5]、克百威[1563-66-2]、3-羥基克百威[16655-82-6]、胺苯磺隆[97780-06-8]、甲磺隆[74223-64-6]、氯磺隆[64902-72-3]、硫線磷[95465-99-9]、氯唑磷[42509-80-8]、甲拌磷[298-02-2]、甲拌磷亞砜[2588-03-6]、甲拌磷砜[2588-04-7]、蠅毒磷[56-72-4]、硫環(huán)磷[947-02-4]、磷胺[13171-21-6]、涕滅威[116-06-3]、涕滅威砜[1646-88-4]、涕滅威亞砜[1646-87-3]、久效磷[6923-22-4]、內(nèi)吸磷（OS）[8065-48-3]、滅線磷[13194-48-4]、特丁硫磷砜[56070-16-7]、特丁磷亞砜[10548-10-4]、水胺硫磷[24353-61-5]、殺蟲脒[6164-98-3]、甲基異柳磷[99675-03-3]30種農(nóng)藥混合標準品（濃度為100 mg/L）：上海安譜實驗科技股份有限公司；乙腈（色譜級）：美國Sigma公司；甲酸（色譜級）：美國Fisher公司；甲酸銨（色譜級）：美國Anaqua公司；冰醋酸（優(yōu)級純）、無水硫酸鎂（MgSO4，分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；無水硫酸鈉（Na2SO4，分析純）、氯化鈉（NaCl，分析純）：北京化工廠；N-丙基乙二胺（PSA，40 μm～63 μm）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18，40-63 μm）、石墨化碳黑（GCB，120 目～400目）：德國CNW公司；聚四氟乙烯（polytetrafluoroethylene，PTFE）濾膜：天津市津騰實驗設(shè)備有限公司。

人參樣品：市售?？瞻谆|(zhì)為本實驗室對30種農(nóng)藥檢測后的人參空白樣品。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters Xevo TQ液-質(zhì)-質(zhì)聯(lián)用儀：美國waters公司；HC-3018高速離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；MTV-100多管漩渦混合儀：杭州奧盛儀器有限公司；Milli-Q Advantage超純水器：密理博中國有限公司；EFAA-DC24氮吹儀：上海安譜實驗科技股份有限公司；FW100高速萬能粉碎機：天津泰斯特儀器有限公司；MS 204S電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 供試品溶液的制備

取供試品粉末（過60目篩）3 g，精確至0.000 1 g，置于50 mL聚苯乙烯具塞離心管中，加入1%冰醋酸溶液15mL，渦旋使藥粉充分浸潤，放置30min，精密加入乙腈15 mL，渦旋混勻，置漩渦混合儀振蕩（2 500 r/min）5 min，加入無水硫酸鈉，立即搖散，再置漩渦混合儀振蕩（2 500 r/min）5 min，離心（7 500 r/min）5 min，取上清液9 mL于預先裝有C18（100 mg）的15 mL凈化管中，渦旋混勻，置漩渦混合儀振蕩（2 500 r/min）5 min，離心（7 500 r/min）5 min，精密取上清液1 mL，精密加入0.1%甲酸溶液（含5 mmol/L甲酸銨）0.3 mL，渦旋混勻，過PTFE濾膜，即得。

1.3.2 對照溶液的制備

空白基質(zhì)溶液的制備：取空白基質(zhì)樣品，同供試品溶液的制備方法（1.3.1）處理成空白基質(zhì)溶液。

標準儲備液的制備：精密量取30種農(nóng)藥混合標準品溶液（濃度為100mg/L）1mL于25mL容量瓶中，乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為4 mg/L的標準儲備液。

標準中間液的制備：精密量取適量標準儲備液，乙腈稀釋，搖勻，配制適宜濃度的標準中間液。

基質(zhì)混合對照溶液的制備：分別精密量取空白基質(zhì)溶液1.0 mL，置氮吹儀上，40℃水浴濃縮至近干，加入適量標準中間液，加乙腈稀釋至1 mL，配制濃度為0.16 ng/mL～160 ng/mL，精密加入0.1%甲酸溶液（含5 mmol/L甲酸銨）0.3 mL，渦旋混勻，過PTFE濾膜，即得。

1.4 儀器條件

1.4.1 液相色譜條件

色譜柱：Waters BEH C18（1.7μm，2.1mm×100mm）；柱溫：40℃；流速：0.3 mL/min；流動相：A-乙腈-0.1%甲酸溶液（含5 mmol/L甲酸銨）（95︰5）；B-0.1%甲酸溶液（含 5 mmol/L甲酸銨）；洗脫：0～1.00 min，30%A；1.00min～12.00min，30%A～100%A；12.00min～14.00min，100%A。

1.4.2 質(zhì)譜條件

以Waters Xevo TQ液-質(zhì)-質(zhì)聯(lián)用儀檢測，電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）；正離子掃描模式；多反應監(jiān)測（multi reaction monitoring，MRM）；毛細管電壓：3.0 kV；脫溶劑（氮氣）流速：1 000 L/h；溫度：450℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 LC-MS/MS條件的選擇

用適宜濃度的標準溶液，通過LC-MS/MS的Intellistart調(diào)諧程序，優(yōu)化錐孔電壓和碰撞能量，選擇相對豐度較高、出峰穩(wěn)定的子離子碎片，獲得了30種農(nóng)藥最優(yōu)質(zhì)譜檢測參數(shù)，如表1所示。

表1 30種農(nóng)藥質(zhì)譜檢測參數(shù)詳情Table 1 Details of mass spectrometry parameters of 30 pesticides

續(xù)表1 30種農(nóng)藥質(zhì)譜檢測參數(shù)詳情Continue table 1 Details of mass spectrometry parameters of 30 pesticides

2.2 QuEChERS法的優(yōu)化

2.2.1 PSA、C18、GCB對30種農(nóng)藥吸附的影響

PSA可以去除糖類、脂肪、有機酸、色素、金屬離子等極性及弱極性雜質(zhì)，C18去弱極性、非極性等雜質(zhì)，GCB去除色素等雜質(zhì)[16-21]，分別采用按表2所示配比的凈化材料，凈化適宜濃度的基質(zhì)混合對照溶液。4組凈化材料對30種農(nóng)藥吸附的回收率見圖1。

表2 PSA、C18和GCB的配比Table 2 The proportion of PSA，C18 and GCB

由圖1可知，A、B、C組凈化材料對大多數(shù)農(nóng)藥的吸附能力并沒有太大區(qū)別；D組凈化材料吸附能力相對較大，尤其D組蠅毒磷的回收率降至25%以下，而前3組材料的回收率均在75%以上，對比明顯；因此確定GCB不適合作為人參中多農(nóng)藥測定的凈化材料；只含有C18的B組凈化材料對30種農(nóng)藥的整體吸附能力均較弱，除甲胺磷、殺蟲脒和苯線磷亞砜外，回收率均達到60%以上，故凈化材料應保留C18。

圖1 4組凈化材料對30種農(nóng)藥吸附的回收率Fig.1 Recovery rate of four purification materials on adsorption of 30 pesticides

含有PSA的A、C、D組凈化材料均對氯磺隆、甲磺隆和胺苯磺隆這3種農(nóng)藥有極強的吸附能力，應考察PSA的用量對吸附作用的影響。4組凈化材料對甲胺磷、殺蟲脒和苯線磷亞砜均有較強的吸附能力，考慮是4組凈化材料都包含的無水硫酸鎂產(chǎn)生的影響。

2.2.2 PSA、C18用量對30種農(nóng)藥吸附的影響

C18使用量為400 mg，無水硫酸鎂使用量為1 200 mg，考察PSA使用量從0～400 mg遞增過程中，對適宜濃度基質(zhì)混合對照溶液的吸附效應。PSA用量對30種農(nóng)藥吸附回收率的影響見圖2。

由圖2可知，凈化材料有PSA時，氯磺隆、甲磺隆和胺苯磺隆的回收率均為0，故PSA不適合作為人參多農(nóng)殘測定的凈化材料。

圖2 PSA用量對30種農(nóng)藥吸附回收率的影響Fig.2 Effect of PSA dosage on adsorption recovery of 30 pesticides

無水硫酸鎂使用量為1 200 mg，考察C18使用量從0～400 mg遞增過程中，對適宜濃度基質(zhì)混合對照溶液的吸附效應。C18用量對30種農(nóng)藥吸附回收率的影響見圖3。

由圖3可知，隨著C18使用量的遞增，除甲胺磷和苯線磷亞砜外，大部分農(nóng)藥未出現(xiàn)明顯的吸附效應。并且，C18使用量從100 mg～400 mg遞增過程中，回收率無明顯差異，待測目標物附近無干擾峰，均可以滿足質(zhì)譜檢測要求。因此，C18可以用于人參多農(nóng)藥殘留檢測的樣品凈化，考慮試驗成本，C18的使用量選取100 mg。在C18使用量為0的情況下，甲胺磷和苯線磷亞砜的回收率均低于50%，進一步確定是無水硫酸鎂所引起。

2.2.3 去除無水硫酸鎂對30種農(nóng)藥測定的影響

C18 100 mg（去除無水硫酸鎂）對30種農(nóng)藥吸附的回收率見圖4。由圖4可知，無水硫酸鎂使用量為0 mg時，考察C18 100 mg對適宜濃度基質(zhì)混合對照溶液的吸附效應。去除無水硫酸鎂時，甲胺磷和苯線磷亞砜的回收率均達到50%以上，確定了無水硫酸鎂的吸附作用，故凈化時應舍棄無水硫酸鎂。

圖4 C18 100 mg（去除無水硫酸鎂）對30種農(nóng)藥吸附的回收率Fig.4 Recovery rate of C18 100 mg（MgSO4removal）on adsorption of 30 pesticides

2.2.4 無水硫酸鈉、氯化鈉對30種農(nóng)藥測定的影響

凈化材料中含有無水硫酸鎂，為降低其吸附作用，提取鹽包重新選擇同等作用的替代品。無水硫酸鎂遇水產(chǎn)生的熱量會使部分極性強、熱穩(wěn)定性差的農(nóng)藥降解，且易結(jié)塊，會阻止硫酸鎂的吸水作用，同時阻止目標物進入乙腈層，影響甲胺磷和苯線磷亞砜等的提取效果[14,16]，故在提取鹽包中將無水硫酸鎂更換為無水硫酸鈉或氯化鈉。以C18作為凈化材料，以回收率為指標，考察無水硫酸鈉1 500 mg、氯化鈉1 500 mg作為提取鹽包時的脫水能力，結(jié)果見圖5。

圖5 無水硫酸鈉、氯化鈉作為提取鹽包對30種農(nóng)藥吸附回收率的影響Fig.5 Effect of NaSO4and NaCl as extraction salts on adsorption recovery of 30 pesticides

如圖5所示，選取無水硫酸鈉或氯化鈉作為提取鹽包時30種農(nóng)藥均可檢出，無水硫酸鈉作為提取鹽包時，回收率普遍為80%～120%。氯化鈉作為提取鹽包時，冰醋酸溶液與乙腈不能徹底分層，乙腈層體積偏小，導致目標物濃度上升，回收率普遍聚集在115%以上，故選取無水硫酸鈉作為提取鹽包。

綜上所述，C18（100 mg）作為凈化材料，無水硫酸鈉為提取鹽包時，能夠更好地保證目標物的提取效果，是人參中30種農(nóng)藥殘留檢測的最優(yōu)凈化和提取材料。

2.3 方法學考察

2.3.1 回收率

根據(jù)GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》[22]檢測方法確認的技術(shù)要求，30種農(nóng)藥的回收率進行三水平試驗，被測組分含量小于0.1 mg/kg，回收率范圍60%～120%?；厥章剩≧）公式如式（1）所示。

式中：c1為未加標試樣中農(nóng)藥殘留含量，本試驗所用試樣為空白樣品，故均為0；c2為加標試樣測定值，mg/kg；c3為本試驗在空白樣品中的添加值，mg/kg，參考2020版《中國藥典》規(guī)定的30種農(nóng)藥的定量限，c3為 0.042 7、0.053 3、0.064 0 mg/kg。

空白樣品中的添加值分別為0.042 7、0.053 3、0.064 0 mg/kg時30種農(nóng)藥回收率見表3。

由表3可知，30種農(nóng)藥的回收率范圍均在60%～120%，符合要求。

2.3.2 校準曲線

根據(jù)GB/T 27404—2008檢測方法確認的技術(shù)要求，對30種農(nóng)藥的校準曲線進行考察，30種農(nóng)藥校準曲線見表4。

由表4可知，相關(guān)系數(shù)均不低于0.99，符合要求。

表4 30種農(nóng)藥校準曲線Table 4 Calibration curves of 30 pesticides

2.3.3 精密度

根據(jù)GB/T 27404—2008檢測方法確認的技術(shù)要求，對30種農(nóng)藥的精密度進行考察，被測組分含量0.01 mg/kg，變異系數(shù)為21%，被測組分含量0.1 mg/kg，變異系數(shù)為15%。本試驗根據(jù)2020版《中國藥典》規(guī)定的30種農(nóng)藥的定量限，在空白樣品中的添加量為0.008、0.002、0.040、0.200 mg/kg，因各種農(nóng)藥的定量限不同，故以定量限為添加的中水平，每種農(nóng)藥選擇各自合適的低、中、高3個水平進行精密度測定，30種農(nóng)藥精密度測定結(jié)果見表5。

由表5可知，變異系數(shù)范圍均小于15%，符合要求。

表5 30種農(nóng)藥精密度Table 5 Precision determination of 30 pesticides

2.3.4 檢測限

根據(jù)GB/T 27404—2008檢測方法確認的技術(shù)要求，通過校準曲線的線性范圍考察，對30種農(nóng)藥的測定低限進行確認，結(jié)果見表6。

表6 30種農(nóng)藥檢測限Table 6 Determination limits of 30 pesticides

由表6可知，30種農(nóng)藥檢測限均不大于2020版《中國藥典》對這30種農(nóng)藥規(guī)定的定量限，符合要求。

3 結(jié)論

本文通過對凈化劑配比、質(zhì)譜條件等優(yōu)化，確定人參中30種農(nóng)藥多殘留的QuEChERS前處理方法：C18（100 mg）為凈化劑，無水硫酸鈉為提取鹽包（1 500 mg），優(yōu)化LC-MS/MS儀器方法，建立了人參中30種農(nóng)藥多殘留的QuEChERS/LC-MS/MS快速檢測方法。該方法凈化方式簡單、提取充分、回收率較高，可為人參中30種農(nóng)藥多殘留的快速篩查和質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐。