楊濤 蔣艷

摘要： 目的 探究NF-κB在心肌缺血再灌注損傷中的作用。方法 選取60只雌性小鼠隨機(jī)分為四組每組各15只，分為假手術(shù)組（Sham組）、缺血再灌注組（I/R組）、慢病毒對(duì)照（Ad-nc）組、慢病毒（Ad-SNHG1）組，所有小鼠再灌注損傷4h后處死小鼠，HE染色分析心肌組織病理變化，并選擇Western blot分析心肌組織NF-κB信號(hào)通路變化，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定小鼠外周血及心肌組織炎癥水平。結(jié)果 慢病毒（Ad-SNHG1）組心肌NF-κB、血液HMGB-1、IL-10、Tn-1、P-NF-kBp65、TLR4免疫組化評(píng)分顯著高于其他三組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 心肌缺血再灌注損傷后NF-κB激活并釋放大量炎癥因子，增加心肌細(xì)胞負(fù)擔(dān)。

關(guān)鍵詞：核因子-κB;心肌缺血;灌注損傷

【中圖分類(lèi)號(hào)】R542.2 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1673-9026（2022）06--01

急性心肌梗死為臨床常見(jiàn)心血管疾病類(lèi)型，隨著溶栓、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療展開(kāi)，心肌梗死致死率得到顯著改善，但心肌梗死后缺血再灌注損傷成為新的難題[1]。核因子-κB（NF-κB）作為細(xì)胞中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，刺激因子如脂多糖、病毒或腫瘤壞死因子等的活化誘導(dǎo)多種基因表達(dá)，產(chǎn)生多種細(xì)胞因子參與機(jī)體炎癥反應(yīng)[2]。分析心肌缺血再灌注損傷后NF-κB活性及炎癥因子變化，對(duì)有效干預(yù)心肌缺血再灌注損傷具有良好指導(dǎo)作用。文章就建立小鼠心肌缺血再灌注損傷模型，分析NF-κB及相關(guān)炎癥因子變化，具體如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

健康雌性C57BL/60小鼠60 只，12周大，20～22g，清潔級(jí)。由桂林醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（編號(hào)：62000700001045）。采取隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為四組各15只，假手術(shù)組（Sham組）：實(shí)驗(yàn)時(shí)只扎線，不結(jié)扎、缺血再灌注組（I/R組）：結(jié)扎冠狀血流30分鐘，放松結(jié)扎線進(jìn)行再灌注2小時(shí)，造成I/R損傷、慢病毒對(duì)照（Ad-nc）組：術(shù)前7d、2d尾靜脈注射對(duì)照慢病毒，然后結(jié)扎冠脈造I/R損傷模型、慢病毒（Ad-SNHG1）組：術(shù)前7d、2d尾靜脈注射Ad-SNHG1慢病毒，然后結(jié)扎冠脈造I/R損傷模型。

1.2 方法

1.2.1心肌缺血再灌注模型構(gòu)建

將小鼠（C57BL/6，12周大）稱(chēng)重后，2.5%戊巴比妥麻醉。將小鼠仰臥位固定于手術(shù)操作臺(tái)上。剪去頸部體毛，剪開(kāi)頸部皮膚分離組織，氣管切開(kāi)連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，潮氣量250 mL/min，呼吸頻率120次/min。碘伏消毒，胸骨正中偏左側(cè)切口分離肌肉，剪斷第3-4根肋，用于胸器撐開(kāi)胸骨，暴露小鼠心臟。提起包壁層剪開(kāi)心包，暴露左心耳，在左心耳與肺動(dòng)脈圓錐之間，找到行走于也肌內(nèi)與也大靜脈走向一致的冠狀動(dòng)脈前降支處進(jìn)針，5-0無(wú)創(chuàng)縫合線穿過(guò)，進(jìn)針深度為0.3-0.5 mm，在肺動(dòng)脈圓錐旁出針。術(shù)中用針形電極連接小鼠四肢，心尖區(qū)表面的蒼白表示缺血成功，心肌梗死模型的建立成功。120 min后松解結(jié)扎線，行再灌注，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中維持機(jī)械呼吸支持。Sham組小鼠手術(shù)操作與上述基本相同，僅將縫合針穿線過(guò)左冠狀動(dòng)脈前降支，但不結(jié)扎該血管。

1.2.2心肌組織核質(zhì)分離

取出生1-3天新生小鼠處死，心室剪碎至體積1mm3左右的顆粒，15 mL離心管中加入1 mL 0.1% II型膠原酶、0.2%胰酶混合液（1：1），37℃消化10 min輕輕吹打靜置1分鐘，收集上清液放置50 mL離心管，加入DMEM/F12+10%FBS培養(yǎng)基，重復(fù)6～7次直至組織消化成絮狀沉淀物。收集細(xì)胞接種于35 mm的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)30 min。上清液中的細(xì)胞再次貼壁45 min，仍懸浮的細(xì)胞接種于涂有明膠的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h，得到跳動(dòng)的心肌細(xì)胞。

1.2.3Western blot分析蛋白表達(dá)

提取細(xì)胞蛋白和細(xì)胞核蛋白添加上樣緩沖液，依據(jù)說(shuō)明書(shū)操作作NF-KBp65（Ser536）、IkBa（Ser32）等蛋白表達(dá)水平，內(nèi)參選擇LaminB和Tubulin。

1.2.4血液樣本處理

四組小鼠建模前及建模后4h分別經(jīng)尾部取血，將12000rpm/min離心10min（離心半徑8.2cm），將血清部分轉(zhuǎn)移至新的離心管，用于ELISA檢測(cè)。

1.2.5心肌組織細(xì)胞提取物制備

取四組小鼠心肌組織各0.1g并剪碎，放入放射免疫沉淀法組織裂解液200ul，在組織勻漿儀上勻漿，在冰上靜置30min，1200×g，上清轉(zhuǎn)移至新的離心管，用于ELISA檢測(cè)組織炎癥因子。

1.2.6ELISA分析炎癥因子水平

取96孔板，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品孔，加入分離獲取血清和組織上清液10ul，待測(cè)樣本孔中添加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體100ul，依據(jù)說(shuō)明書(shū)孵育、洗滌操作。終止反應(yīng)后于酶標(biāo)儀492nm處測(cè)定隔空吸光度值，依據(jù)樣品OD值，計(jì)算各樣本濃度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism v6.0和SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)均以SD（標(biāo)準(zhǔn)差）表示。采用t檢驗(yàn)分析兩組間的差異，采用單因素方差分析和Dunnett多重比較檢驗(yàn)區(qū)分三組或三組以上的差異。

2 結(jié)果

2.1四組小鼠心肌NF-κB水平比較

慢病毒（Ad-SNHG1）組心肌NF-κB水平顯著高于其他三組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.2四組大鼠血漿中各ELISA指標(biāo)含量分析

慢病毒（Ad-SNHG1）組HMGB-1、IL-10、Tn-1水平顯著高于其他三組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表2。

2.3四組小鼠心臟組織免疫組化評(píng)分結(jié)果

慢病毒（Ad-SNHG1）組P-NF-kBp65、TLR4免疫組化評(píng)分顯著高于其他三組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表3。

3 討論

缺血再灌注損傷所致組織損傷為一種與抗原無(wú)關(guān)炎癥過(guò)程，病理生理十分復(fù)雜。既往研究指出[3]，氧化應(yīng)激反應(yīng)在缺血再灌注損傷病理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。缺血再灌注會(huì)引起無(wú)菌性炎癥，獲得性和固有免疫系統(tǒng)均被激活，如模式識(shí)別受體激活、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

NF-κB則作為一種能特異的與免疫球蛋白的增強(qiáng)子KB序列結(jié)合的核蛋白轉(zhuǎn)錄因子，具有Rel同源結(jié)構(gòu)域，是Rel蛋白家族成員。未活化狀態(tài)下，NF-κB與抑制因子結(jié)合并形成NF-κB/IκB復(fù)合物，處于失活狀態(tài)，定位于細(xì)胞質(zhì)中。但經(jīng)過(guò)外界刺激下會(huì)產(chǎn)生活性氧、細(xì)胞因子等。本次研究中指出，通過(guò)建立四組模型組，其中慢病毒（Ad-SNHG1）組NF-κB信號(hào)通路處于最高水平。主要是建模后，磷酸化NF-κBp65和磷酸化IκBa水平顯著增加，p65蛋白大量進(jìn)入細(xì)胞核，IκBa磷酸化水平增加，處于高激活狀態(tài)，顯著增加心肌缺血再灌注后NF-κB活性。同時(shí)，針對(duì)血清、免疫組化中相關(guān)指標(biāo)分析后，心肌慢性損傷缺血再灌注后炎癥因子、P-NF-kBp65、TLR4顯著偏高，表明炎癥因子作用下會(huì)造成心肌損傷。

綜上所述，心肌缺血再灌注損傷后NF-κB激活并釋放大量炎癥因子，增加心肌組織損傷。

參考文獻(xiàn)：

[1]戴文琴，黃縣立，汪愛(ài)萍，等.小鼠心肌缺血再灌注損傷后NF-κB磷酸化狀態(tài)及炎癥因子的表達(dá)水平[J].國(guó)際免疫學(xué)雜志，2020，43（1）：26-30.

[2]韋皓，許玉霞，秦莉，等. HIF-1α通過(guò)TLR4/NF-κB信號(hào)通路對(duì)心肌缺血-再灌注大鼠心肌損傷的保護(hù)機(jī)制分析[J].臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2019，18（10）：1017-1020.

[3]袁泉，夏中元，趙博，等. NF-κB在Jak2/STAT3通路增加大鼠心肌缺血再灌注致腦損傷中的作用[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2018，47（7）：55-58.