王忠偉，黃安香，楊守祿，鄔能英，柏文戀，李丹

(貴州省林業(yè)科學(xué)研究院，貴州 貴陽 550005)

草珊瑚為金粟蘭科植物(SarcandraglabraThunb.Nakai)，又名腫節(jié)風(fēng)、接骨木、接骨草、九節(jié)茶、九節(jié)蘭等，生于山谷林下陰濕處，主要分布于我國福建、江西、廣西及貴州等地[1-3]。草珊瑚主要含有香豆素、有機酸、黃酮、揮發(fā)油類等化學(xué)成分，其性味苦、辛、平，具有清熱涼血、活血祛斑、祛風(fēng)通絡(luò)等功效[4-5]。段營輝等在研究草珊瑚的化學(xué)成分時分離出10個化合物，分別鑒定為嗪皮素、異嗪皮啶、槲皮素-3-氧-葡萄糖醛酸苷、山柰酚-3-氧-葡萄糖醛酸苷、綠原酸、咖啡酸、迷迭香酸、迷迭香酸-4-氧-葡萄糖苷、異香草酸、β-hydroxypropiovanillone[6]。草珊瑚中具有抗菌活性化學(xué)成分的香豆素是草珊瑚的活性成分[7-9]。此外，鄭冬梅等利用氣質(zhì)色譜法分析草珊瑚揮發(fā)油，發(fā)現(xiàn)含有檸檬烯，芳樟醇，乙酸龍腦酯，β-欖香烯等化合物。可見，草珊瑚的活性成分研究比較多[10]。但草珊瑚的質(zhì)量控制主要依據(jù)2015版《中華人民共和國藥典》，藥典規(guī)定了HPLC法測定草珊瑚異嗪皮啶與迷迭香酸[11]，采用加熱回流方式進行提取，提取過程復(fù)雜，耗時長。本研究采用甲醇為提取溶劑，比較了3種提取方法對草珊瑚中綠原酸、異嗪皮啶、迷迭香酸的影響，其中超聲提取具有耗時短、操作簡單、提取效率高、可以同時提取多個樣品等優(yōu)點，利用150 mm的分離短柱將三者分離，檢測時間短，檢測效率高，建立了簡單高效的草珊瑚中綠原酸、異嗪皮啶、迷迭香酸含量測定方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜系統(tǒng)，包括二極管陣列檢測器，四元泵溶劑系統(tǒng)，自動進樣器，柱溫箱，Chemstation工作站；色譜柱(150 mm × 4.6 mm，4 um) (美國Agilent公司)

綠原酸標準品(純度>99.48%)、異嗪皮啶標準品(純度>98.241%)、迷迭香酸標準品(純度>99.685%)均購置于成都瑞芬思生物科技有限公司；乙腈(色譜純，美國Tedia公司)；水(超純水，娃哈哈公司)；磷酸(HPLC級，天津科密歐公司)。兩年生草珊瑚整株鮮樣，采自貴州省叢江、榕江兩地。

表1 樣品采集信息

1.2 色譜條件

高效液相色譜二極管陣列(HPLC-DAD)，反相色譜柱：150 mm× 4.6 mm，4μm，色譜柱溫度設(shè)為40 ℃。流動相：梯度洗脫(0～9 min，20%A+80%B，10～15 min，40%A+60%B)，流速0.6 mL/min，進樣量10 μL，采用吸收波長344 nm，檢測綠原酸、異嗪皮啶、迷迭香酸3個物質(zhì)?？傔M樣時間為15 min，該色譜條件下，3個成分的色譜峰分離較好，綠原酸保留時間3.278 min，異嗪皮啶保留時間7.981 min，迷迭香酸保留時間11.432 min。

1.3 標準品溶液的制備

精密稱取綠原酸、異嗪皮啶、迷迭香酸各標準品0.01 g。分別用甲醇溶解后，定容至10 mL，再取1 mL定容到10 mL，得到每1 mL含綠原酸、異嗪皮啶、迷迭香酸100 μg的標準品儲備液。

1.4 各標準品曲線的繪制

分別從綠原酸、異嗪皮啶、迷迭香酸標準品儲備液中準確移取一定體積于容量瓶中，配制成綠原酸、異嗪皮啶0.5、1、5、10、20 μg/mL；迷迭香酸5、10、20、50、100 μg/mL系列混合標準溶液，按照1.2進行檢測。

1.5 樣品溶液制備

樣品前處理：將采集的草珊瑚整株洗凈后，100 ℃殺青1 h，80 ℃烘干至恒重，粉碎后過0.84篩，作為樣品備用。稱取草珊瑚樣品1.0 g(0.0001)，置具塞錐形瓶中，加入25 mL甲醇，浸潤0.5 h，50 ℃超聲提取10 min。冷卻至室溫，過濾，稀釋至適宜的倍數(shù)，過0.22 μm微孔濾膜，轉(zhuǎn)移至進樣瓶，待測。

2 研究內(nèi)容與結(jié)果

2.1 色譜條件優(yōu)化

流動相的選擇對草珊瑚中綠原酸、異嗪皮啶、迷迭香酸的呈現(xiàn)起到了關(guān)鍵作用，用乙腈與純水為流動相時，3個化合物分離度達不到1.5，并且峰型有拖尾的現(xiàn)象，而在純水中加入磷酸可以達到較好分離效果[11-12]。為了較好的分離效果，往往選擇較高的酸濃度，較長的色譜柱[13-15]，如用0.2%磷酸水與乙腈為流動相，250 mm長柱。流動相中磷酸比例越高，酸性越強，對色譜柱的腐蝕越嚴重，色譜柱越長，柱壓會越高，所需平衡時間越長，導(dǎo)致迷迭香酸的保留時間達到55 min，造成了時間延長，流動相消耗多，色譜柱損壞加劇的現(xiàn)象[16]。為此，選用0.1%的磷酸水與乙腈為流動相(20∶80)，150 mm短柱，流速0.6 mL/min后，3個物質(zhì)分離度達到1.5以上，綠原酸出峰時間為3.278 min、異嗪皮啶出峰時間為7.981 min。但是迷迭香酸依然出現(xiàn)拖尾，選用0.1%的磷酸水與乙腈(40：60)，無拖尾現(xiàn)象，能將目標峰與雜質(zhì)峰分開，出峰時間為11.432 min，標樣與實際樣品譜圖如下：

圖1 標準樣品圖譜

圖2 草珊瑚樣品圖譜

2.2 提取條件優(yōu)化

2.2.1 提取方式

本文以活性成分回收率為研究指標，分析了超聲提取、加熱回流、震蕩提取3種方法對草珊瑚中活性成分綠原酸、異嗪皮啶、迷迭香酸回收率的影響，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明采用震蕩法提取1 h，3者的回收率為15.6%、18.3%、21.3%，可見該法提取不完全，效率低。其可能的原因是活性成分易溶于熱甲醇、乙醇、氯仿，室溫提取過程中，由于溫度低，導(dǎo)致活性成分未被提取充分[11]。加熱回流法提取1 h，3者的回收率為97.3%、96.5%、98.4%，可見該法提取效果好，但是操作繁瑣，耗時長，制約因素多，雜質(zhì)干擾大[17]。40 KHZ超聲波在50 ℃溫度條件下提取10 min，3者回收率為98.1%、95.3%、97.2%，可見超聲提取效率高、步驟少、操作簡單[17]。由此可見，超聲提取不失為草珊瑚中活性成分提取的好方法。

圖3 提取方法對草珊瑚中綠原酸、異嗪皮啶、迷迭香酸回收率影響

2.2.2 超聲提取條件優(yōu)化

超聲(40 KHZ)提取在20、40、50 ℃的溫度下，提取時間5、10、20、30 min，結(jié)果如圖4。在50 ℃，10 min的條件下，效果最好，綠原酸、異嗪皮啶、迷迭香酸的回收率為98.1%、95.3%、99.2%。在較低溫度(20、40 ℃)提取時，需要延長提取時間來達到更高的回收率。當(dāng)溫度上升到50 ℃，時間在10 min時回收率達到極值，繼續(xù)提取，回收率反而降低，其原因可能是在50 ℃溫度下，超聲提取時間過長導(dǎo)致目標化合物分解。

圖4 不同溫度、時間超聲提取草珊瑚中3成分回收率(A)室溫，(B)40 ℃,(C)50 ℃。

2.3 方法的確定性與穩(wěn)定性評價

2.3.1 標準曲線、基質(zhì)效應(yīng)和LOQ

精密吸取綠原酸、異嗪皮啶、迷迭香酸單一成分標準儲備液適量，用甲醇分別稀釋成5個濃度的混合標準溶液，其中綠原酸、異嗪皮啶濃度為0.5、1、5、10、20 ug/mL，迷迭香酸濃度為5、10、20、50、100 ug/mL。以峰面積(x)為橫坐標，以質(zhì)量濃度(y，ug/mL)為縱坐標，繪制3者標準曲線，信噪比(S/N)為3時檢出限(LOD)。回歸方程、線性范圍、檢出限(LOD)見表2。標準曲線的相關(guān)系數(shù)R2達到0.997及以上，表明線性良好。

表2 草珊瑚中三種活性成分的標準曲線、線性范圍及檢測限

2.3.2 準確度和精密度

分別在草珊瑚樣品中加入綠原酸0.2、0.4、0.8 mg；異嗪皮啶、迷迭香酸分別為0.5、1.0、2.0 mg，按照1.5的方法進行處理，每個濃度水平做5個平行，測定其回收率。方法的穩(wěn)定性通過日內(nèi)與日間實驗來進行，由表3可得，日內(nèi)綠原酸、異嗪皮啶、迷迭香酸的回收率達到92.7%～103.3%，相對標準偏差在2.1%～4.8%之間；日間綠原酸、異嗪皮啶、迷迭香酸的回收率達到92.2%～105.4%，相對標準偏差在1.5%～4.3%之間?；厥章逝c相對標準偏差均在70%～120%和0～10%這兩個允許的范圍內(nèi)，方法的穩(wěn)定性與可靠性較好。

表3 日內(nèi)日間回收率穩(wěn)定性(n=5)測定結(jié)果表

2.3.4 樣品分析

草珊瑚樣品主要來源于叢江與榕江兩個地方。稱取草珊瑚樣品1.0 g(精確至0.0001 g)，每個樣品3個平行，按照1.5節(jié)的方法提取，稀釋10倍，按照1.3節(jié)的方法進行檢測。記錄峰面積，根據(jù)2.3.1節(jié)中的標準曲線進行回歸，算出對應(yīng)樣品中的含量，結(jié)果見表4。

表4 不同產(chǎn)地草珊瑚3個有效成分含量結(jié)果測定(n=3)

3 結(jié)論

本實驗采用振蕩提取、超聲提取，加熱回流提取法提取草珊瑚。并對超聲(40 KHZ)提取法進行了優(yōu)化，在溫度為50 ℃下，提取10 min，綠原酸、異嗪皮啶、迷迭香酸的回收率為98.1%、95.3%、99.2%，與加熱回流的效果相當(dāng)，體現(xiàn)出高效、簡單、易操作等優(yōu)點。

建立了高效液相色譜測定草珊瑚藥材中綠原酸、異嗪皮啶、迷迭香酸含量的方法：樣品在最優(yōu)條件下提取后，以Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，4 μm)進行分離，流動相為乙腈/0.1%磷酸水(A/B)溶液采用梯度洗脫方式(0～9 min，20%A+80%B；10～15 min，40%A+60%B)，流速為0.6 mL/min，柱溫為40 ℃，采用吸收波長344 nm。綠原酸、異嗪皮啶、迷迭香酸濃度分別在0.50～20.0、0.5～20、5.0～100.0 ug/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。綠原酸、異嗪皮啶、迷迭香酸檢測限分別為：0.025、0.010、0.10 mg/kg，日內(nèi)與日間回收率(n=6)在91.8%～108.3%范圍內(nèi)，相對標準偏差在1.5%～4.8%之間。

利用本研究建立的綠原酸、異嗪皮啶、迷迭香酸活性成分測定方法，對叢江與榕江兩地，苗圃基地與林下種植的草珊瑚樣品進行測定，結(jié)果表明綠原酸的含量在0.142～0.878 mg/g之間，異嗪皮啶的含量在0.252～1.055 mg/g之間，迷迭香酸的含量在0.378～1.707 mg/g之間。不同產(chǎn)地和種植方式?jīng)Q定了3者活性成分含量不同，一定程度上反映草珊瑚的質(zhì)量，可以作為草珊瑚品質(zhì)控制的指標。