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H3K9me3對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育的影響

2022-03-26 07:48:08田釵張彩玉楊婷王婷黃時(shí)海石德順李湘萍
關(guān)鍵詞:素處理囊胚卵母細(xì)胞

田釵,張彩玉,楊婷,王婷,黃時(shí)海,石德順,李湘萍

廣西大學(xué) 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南寧 530004

組蛋白修飾是最重要的表觀遺傳修飾標(biāo)記之一,在控制基因表達(dá)和細(xì)胞譜系規(guī)范中起到關(guān)鍵作用[1-3].已有研究表明,組蛋白甲基化對(duì)早期胚胎發(fā)育和胚胎干細(xì)胞多能性的維持具有重要作用[4].組蛋白甲基化發(fā)生在組蛋白的賴氨酸和精氨酸殘基上,作用位點(diǎn)在其側(cè)鏈.

在N原子上,常見位點(diǎn)有H3K4me3,H3K9me3和H3K27me3[5-6].其中,組蛋白H3第9位賴氨酸三甲基化(Histone H3K9 trimethylation,H3K9me3)與維持異染色質(zhì)穩(wěn)定和沉默、X染色體失活、印記相關(guān)基因抑制及細(xì)胞特異性的鑒定有關(guān)[7],也被認(rèn)為是胚胎發(fā)育的關(guān)鍵障礙[8].

H3K9me3被證明是小鼠[9-10]、人類[11]和牛[12]重新編程中關(guān)鍵的一個(gè)表觀遺傳調(diào)節(jié)因子.在小鼠GV卵母細(xì)胞中,H3K9me3的表達(dá)與組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的活性密切相關(guān).BHPF(Bateosi High Pass Filter)處理通過影響細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)、線粒體功能、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡提高了H3K9me3的表達(dá),從而降低了小鼠卵母細(xì)胞的成熟效率和卵母細(xì)胞的質(zhì)量[13].大劑量真菌毒素導(dǎo)致小鼠卵母細(xì)胞H3K9me3水平升高,這可能是導(dǎo)致卵母細(xì)胞發(fā)育能力下降的原因之一[14].以上研究表明,適當(dāng)降低H3K9me3的表達(dá)有利于卵母細(xì)胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育.

H3K9me3在基因表達(dá)調(diào)控和卵母細(xì)胞生長中起重要作用[15],目前其在體外成熟豬卵母細(xì)胞和孤雌胚胎中的表達(dá)模式還鮮有報(bào)道.毛殼素作為SUV39亞家族甲基轉(zhuǎn)移酶的抑制劑,能夠特異性抑制組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SUV39H1/2和G9A的活性,通過競爭性結(jié)合SUV39H1/2[16],與關(guān)鍵殘基發(fā)生反應(yīng),從而調(diào)控H3K9me3水平,以此增強(qiáng)表觀遺傳重編程效率[17].因此,本實(shí)驗(yàn)通過在豬卵母細(xì)胞體外成熟過程中添加毛殼素,調(diào)控卵母細(xì)胞H3K9me3及其相關(guān)基因的表達(dá).研究結(jié)果有助于了解體外成熟卵母細(xì)胞和胚胎中H3K9me3表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化,并為改善豬卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量,提高胚胎發(fā)育效率奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

本實(shí)驗(yàn)所用卵巢均來源于廣西南寧市屠宰場,實(shí)驗(yàn)所用胚胎為孤雌激活胚胎.

1.2 豬卵巢的采集及體外成熟培養(yǎng)

將從屠宰場取得的卵巢置于37 ℃生理鹽水中,用生理鹽水清洗3遍,并用注射器采集卵巢表面直徑約3~10 mm的卵泡,挑選形態(tài)完好、胞質(zhì)均勻,周圍帶有3層以上致密卵丘細(xì)胞的卵丘-卵母胞復(fù)合體(cumulus-oocyte complexes,COCs),用洗卵液清凈后將30~50個(gè)卵母細(xì)胞放入用礦物油覆蓋的一個(gè)胚胎培養(yǎng)液(PM)微滴中,每滴為150 μL培養(yǎng)液,[0~22)h將卵母細(xì)胞放入含有激素的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng),之后將卵母細(xì)胞移入另一個(gè)不含激素的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)[22~44] h.實(shí)驗(yàn)組在對(duì)照組的基礎(chǔ)上添加了不同濃度的毛殼素.

1.3 豬卵母細(xì)胞的孤雌激活

實(shí)驗(yàn)前先打開熱臺(tái)、融合儀,并安裝激活盤.用提前平衡的電激活液清洗3遍融合槽,然后把新的電激活液放置于融合槽中.將卵母細(xì)胞在融合液中清洗3遍后放于激活槽中進(jìn)行激活.將激活過的卵母細(xì)胞移入平衡好的胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)15 min,然后移入35 μL的胚胎培養(yǎng)液微滴中進(jìn)行培養(yǎng).24 h統(tǒng)計(jì)卵裂率,48 h統(tǒng)計(jì)4-細(xì)胞率,7 d統(tǒng)計(jì)囊胚率.

1.4 囊胚細(xì)胞總數(shù)的鑒定

將收集的豬孤雌囊胚放入4%的多聚甲醛固定液中固定24 h,然后放入10 μg/mL細(xì)胞核染料(Hoechst)中,避光染色10 min,然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3遍,每次5 min,染好的囊胚移入載玻片的抗淬滅劑中,用凡士林封片,在熒光顯微鏡下觀察并做好統(tǒng)計(jì).

1.5 細(xì)胞免疫熒光

收集不同時(shí)期的卵母細(xì)胞和孤雌囊胚放入4%多聚甲醛中4 ℃固定24 h.固定之后,室溫條件下放入阻斷液中阻斷3次,每次5 min,然后放入1% Triton X-100中,透化30 min,再用阻斷液阻斷2次,每次5 min,然后用1%牛血清蛋白溶液(BSA)進(jìn)行非特異性位點(diǎn)封閉1~2 h,封閉之后用T-BSA-PBS清洗3次,每次5 min,把處理好的樣品放入H3K9me3的一抗4 ℃過夜.第2 d把樣品放入培養(yǎng)箱孵育30 min,然后用T-BSA-PBS清洗3遍,每次5 min,清洗好之后把樣品放入裝有二抗的EP管中,避光室溫孵育1.5 h,然后用清洗液清洗3遍,每次5 min,最后用10 μg/mL Hoechst 33342復(fù)染10 min,用清洗液清洗兩遍放入滴有抗淬滅劑的玻片上,用凡士林封片鏡檢,記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).

1.6 反轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR

收集不同時(shí)期的豬卵母細(xì)胞和孤雌囊胚,用PBS+PVA清洗3遍,洗去樣品所帶的培養(yǎng)液和血清等物質(zhì)后將樣品放入裝有細(xì)胞裂解液的管中.微量反轉(zhuǎn)錄所有步驟均在冰上操作:裂解,將樣品放入聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀中4 ℃裂解15 min;消化,裂解后每管加入1 μL DNase I和1.3 μL 10×DNA buffer,瞬時(shí)離心后放入PCR儀中37 ℃消化40 min;終止,消化完每管加入1 μL EDTA,2 μM Random Primer,1 μL mixture deoxynucleotides (dNTPs),瞬時(shí)離心后放入PCR儀中65 ℃10 min;反轉(zhuǎn),終止后依次加入2 μL DTT,4 μL 5×First-Strand Buffer,0.5 μL RNase Inhibitor(RRI),0.25 μL SuperScriptTMⅡ Reverse Transcriptase (SSⅡ),瞬時(shí)離心,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,其條件是25 ℃ 10 min,42 ℃ 90 min,95 ℃ 10 min,4 ℃停止.將反轉(zhuǎn)錄得到的樣品存放于-20 ℃?zhèn)溆茫?/p>

將微量反轉(zhuǎn)錄得到的產(chǎn)物作為模板,進(jìn)行qRT-PCR檢測,觀察目的基因的表達(dá)情況.反應(yīng)體系按說明書進(jìn)行.

1.7 結(jié)果統(tǒng)計(jì)與分析

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果均使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析,早期胚胎發(fā)育率先通過反正弦變化后再進(jìn)行分析.每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次,每次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中至少隨機(jī)挑選10個(gè)以上卵母細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn).p<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果與分析

2.1 [0~22)h毛殼素處理對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育的影響

[0~22)h采用不同濃度毛殼素處理,發(fā)現(xiàn)2 nmol/L處理組的卵母細(xì)胞第一極體排出率顯著高于未處理組、5 nmol/L組和10 nmol/L組;4-細(xì)胞率顯著高于未處理組、5 nmol/L組和10 nmol/L組;2 nmol/L處理組的囊胚率顯著高于未處理組和10 nmol/L組(p<0.05);2 nmol/L處理組的囊胚細(xì)胞總數(shù)顯著高于5 nmol/L組和10 nmol/L組(p<0.05),與未處理組之間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)(表1).

表1 毛殼素處理對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育的影響

2.2 [22~44] h毛殼素處理對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育的影響

[22~44] h采用不同濃度毛殼素處理時(shí)發(fā)現(xiàn),與未處理組相比,5 nmol/L毛殼素處理組的第一極體排出率顯著提高(87.37% VS 71.91%,p<0.05),各處理組之間的卵裂率、4-細(xì)胞率、囊胚率和囊胚細(xì)胞總數(shù)差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)(表2).

表2 [22~44] h毛殼素處理對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育的影響

基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用體外成熟[0~22)h 添加2 nmol/L毛殼素處理方法.

2.3 毛殼素處理對(duì)豬卵母細(xì)胞和早期胚胎中H3K9me3表達(dá)的影響

與未處理組相比,H3K9me3在GV期2 nmol/L處理組有明顯的表達(dá),差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05).隨著卵母細(xì)胞的成熟進(jìn)程,H3K9me3表達(dá)逐漸減弱,在MI和MⅡ期卵母細(xì)胞中未檢測到H3K9me3表達(dá).與未處理組相比,2 nmol/L處理組的囊胚中H3K9me3表達(dá)顯著降低(p<0.05)(圖1、圖2).

圖1 毛殼素處理對(duì)豬卵母細(xì)胞和囊胚中H3K9me3表達(dá)的影響

2.4 毛殼素處理對(duì)豬卵母細(xì)胞和早期胚胎中重要基因表達(dá)的影響

在相同時(shí)期各組之間*表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05).圖2 GV期豬卵母細(xì)胞和囊胚中H3K9me3的熒光強(qiáng)度分析

與未處理組相比,2 nmol/L處理組的MI期卵母細(xì)胞中的SUV39H1和SUV39H2表達(dá)顯著降低(p<0.05),兩組之間G9A的表達(dá)差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05).與未處理組相比,2 nmol/L處理組的MⅡ期卵母細(xì)胞中SUV39H1,SUV39H2,G9A表達(dá)均顯著降低(p<0.05);囊胚中Nanog,Oct4,CDX2的表達(dá)顯著提高(p<0.05)(圖3).

在相同時(shí)期各組之間*表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05).圖3 不同處理豬卵母細(xì)胞和早期胚胎中相關(guān)基因的表達(dá)

3 討論與結(jié)論

近年來的研究表明,胚胎中高表達(dá)的H3K9me3是阻礙胚胎發(fā)育的關(guān)鍵因素,特別是在合子基因激活(ZGA)過程中[18].在ZGA期間,卵母細(xì)胞中H3K9me3的異常變化會(huì)阻礙轉(zhuǎn)錄激活[19],且在核移植胚胎重編程抗性區(qū)域(RRR)中檢測到高水平的H3K9me3,而體外受精胚胎的RRR基因表達(dá)正常.這些RRRs區(qū)域的特征是富含SUV39H1/2并且缺乏DNasr1,這兩點(diǎn)都是異染色質(zhì)的一般特征[20].由于H3K9的甲基化與基因的表達(dá)抑制密切相關(guān),去除這些表觀遺傳標(biāo)記有利于基因的重新激活和胚胎發(fā)育.以往的研究也表明,降低人和小鼠胚胎中H3K9me3水平能提高胚胎的發(fā)育能力[10].因此,適當(dāng)降低H3K9me3的表達(dá)有利于卵母細(xì)胞體外成熟和早期胚胎的發(fā)育.

在本研究中,免疫熒光數(shù)據(jù)顯示GV期卵母細(xì)胞中H3K9me3的表達(dá)水平較高,但MI期和MⅡ期卵母細(xì)胞中未檢測到該蛋白的表達(dá),發(fā)育到囊胚階段又表現(xiàn)出較高的表達(dá)水平,這意味著MII期卵母細(xì)胞中H3K9me3的缺失可能正在為通過其他修飾的細(xì)胞表觀遺傳重新編程做準(zhǔn)備[21].H3K9me3的動(dòng)態(tài)表達(dá)說明了其在卵母細(xì)胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育過程中具有重要的調(diào)控作用.

本實(shí)驗(yàn)通過在豬卵母細(xì)胞體外成熟過程中添加毛殼素,觀察其是否對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育產(chǎn)生影響.結(jié)果發(fā)現(xiàn),與未處理組相比,2 nmol/L處理組顯著提高了卵母細(xì)胞的第一極體排出率、4-細(xì)胞率和囊胚率.在本研究中2 nmol/L處理組囊胚率增加12.92%,表明抑制劑只部分糾正了異常的表觀遺傳修飾.通過qRT-PCR和免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn),毛殼素處理之后顯著降低了卵母細(xì)胞中SUV39H1/2和G9A的表達(dá),以及囊胚中H3K9me3的表達(dá).這與Zhang等[22]在羊核移植胚胎中的研究一致.2 nmol/L毛殼素處理后顯著提高囊胚中多能性基因Nanog,Oct4和CDX2的表達(dá),該結(jié)果與李海艷[23]對(duì)豬孤雌胚胎的研究結(jié)果一致.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明適量毛殼素處理有利于豬卵母細(xì)胞體外成熟和早期胚胎的發(fā)育.

豬卵母細(xì)胞中H3K9me3的去除對(duì)于正常的ZGA和表觀遺傳重編程至關(guān)重要[18],用毛殼素作為組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SUV39H1/2和G9A特異性抑制劑,能有效降低H3K9me3的表達(dá)水平,最終提高豬體外成熟和胚胎發(fā)育效率.

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