宣學(xué)習(xí)，張 宇，張 華，張傳西，袁義強(qiáng)

缺血性心臟病是由冠狀動(dòng)脈循環(huán)改變引起冠狀動(dòng)脈血流和心肌能量代謝失衡導(dǎo)致的心肌損傷疾病，在心腦血管疾病中極為常見，且在老年人中發(fā)病率較高，以心絞痛、休克、心律失常及心力衰竭為主要臨床表現(xiàn)[1-2]。隨著人們生活水平的提高，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化呈年輕化趨勢(shì)，年齡較小人群中出現(xiàn)心肌缺血疾病愈發(fā)常見，臨床手術(shù)中及時(shí)發(fā)現(xiàn)并且對(duì)缺血的冠狀動(dòng)脈實(shí)行血液再灌注可使組織器官功能恢復(fù)，有效降低死亡率。然而，一些情況下，冠狀動(dòng)脈部分或完全急性阻塞后在一定時(shí)間內(nèi)恢復(fù)血液流動(dòng)，不僅不能恢復(fù)組織器官功能，反而使組織病理損傷加重，發(fā)生不可逆的心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)[3]。槲皮素(Quercetin，QU)是廣泛存在的黃酮類藥物，具有降低血壓、減少毛細(xì)血管脆性、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、增加冠狀動(dòng)脈血流量、對(duì)抗自由基等功效[4-5]。研究表明，槲皮素可以通過緩解炎癥反應(yīng)，減少細(xì)胞凋亡，減輕腎臟缺血再灌注損傷[6-7]。但槲皮素對(duì)MIRI發(fā)生時(shí)氧化應(yīng)激作用研究較少。本研究通過對(duì)氧化應(yīng)激指標(biāo)及心臟電活動(dòng)的比較，探討槲皮素在MIRI發(fā)生時(shí)對(duì)心肌的保護(hù)作用，為缺血性心臟疾病的治療及預(yù)防提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無特定病原體(SPF)級(jí)SD大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量(250±50)g，購(gòu)自廣州相觀生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(粵)2018-0043，適應(yīng)性飼喂7 d。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 凋亡細(xì)胞原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法(TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，活性氧(reactive oxygen species，ROS)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)ELISA檢測(cè)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)ELISA檢測(cè)試劑盒、酶標(biāo)儀均購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司，兔抗大鼠單磷酸腺苷活化蛋白激酶(Adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase，AMPK)抗體一抗、兔抗大鼠p-AMPK抗體一抗、兔抗大鼠結(jié)節(jié)性腦硬化復(fù)合物2(tuberous sclerosis complex-2，TSC2)抗體一抗、兔抗大鼠p-TSC2抗體一抗、兔抗大鼠雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)抗體一抗、兔抗大鼠p-mTOR抗體一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗均購(gòu)自美國(guó)CST公司，UV-1200紫外分光光度計(jì)(上海美析儀器有限公司)，ECG-1350P型十二導(dǎo)聯(lián)心電圖機(jī)(上海光電醫(yī)用電子儀器有限公司)，光學(xué)顯微鏡(上海萬衡精密儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 建模及分組 將48只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、槲皮素低劑量組、槲皮素高劑量組、陽性藥物組4組，每組12只，采用冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法建立MIRI模型[8]。建模前12 h禁食，用2%戊巴比妥對(duì)各大鼠進(jìn)行麻醉，15 min后將其移至解剖臺(tái)上并呈仰臥位，分別捆綁上下肢并連接心電圖機(jī)，觀察心電變化。將各大鼠頸部、胸前備皮、消毒后，分離頸部氣管并插入氣管插管，調(diào)整呼吸機(jī)參數(shù)進(jìn)行連接(呼吸頻率100次/min)。于第三脅或第四肋間順肋間隙的方向偏胸骨左緣的位置開胸，暴露心臟并打開心包，將5-0縫合線沿左心耳下方2 cm冠狀動(dòng)脈前降支穿過，將一小段直徑1.5 cm的乳膠管墊于縫合線上，收緊縫合線、結(jié)扎冠狀動(dòng)脈造成心肌缺血?？p合線下心肌顏色變暗，左心室缺血變白，心電圖ST段弓背向上抬高，說明心肌缺血成功，此過程持續(xù)30 min；剪斷縫合線，恢復(fù)灌注后，可見縫合線下左心室顏色由白逐漸變紅，心電圖ST回落，說明再灌注成功，此過程持續(xù)120 min，排除結(jié)扎前心電圖異常及未到觀察終點(diǎn)即死亡大鼠。剩余12只大鼠為假手術(shù)組，僅打開胸腔，不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈。建模結(jié)束后，假手術(shù)組大鼠剩余10只，模型組6只，槲皮素低劑量組7只，槲皮素高劑量組9只，陽性藥物組10只。

1.2.2 干預(yù) 槲皮素低劑量組、槲皮素高劑量組、陽性藥物組分別用25 mg/kg 槲皮素、50 mg/kg 槲皮素、3 mg/kg依達(dá)拉奉經(jīng)尾靜脈注射給藥，假手術(shù)組及模型組用等量生理鹽水尾靜脈注射給藥，每天1次，持續(xù)4周。

1.2.3 觀察各組大鼠心電圖 將大鼠四肢連接心電圖機(jī)，觀察30 min內(nèi)心電圖變化情況。

1.2.4 計(jì)算各組心肌梗死面積 再灌注結(jié)束后，各組分別取3只大鼠心臟，用生理鹽水洗去血污，將心臟切成0.1～0.3 cm厚心肌片，將2片新鮮心肌橫斷面進(jìn)行氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)染色，于37 ℃溫孵15 min，其余心肌片于-80 ℃凍存。正常心肌組織變藍(lán)色而梗死心肌不著色，用Image Pro-Plus Version 4.5圖像分析軟件計(jì)算心肌橫斷面梗死面積及整個(gè)左心室心肌橫斷面面積，心肌梗死面積用橫斷面梗死部分占左心室心肌橫斷面積的百分比表示。

1.2.5 蘇木精-伊紅(HE)染色觀察心肌組織病理變化 將剩余心肌片用生理鹽水漂洗、濾紙吸干后置于4%甲醛溶液中固定，經(jīng)酒精脫水、石蠟包埋后切片，進(jìn)行HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織病理變化。

（1）分別根據(jù)所設(shè)置的modelA：Logistic(A_P)=-2+6*X1+0.5*X2，A_P=exp(logit(A_P))/(1+exp(logit(A_P)))和modelB：Logistic(B_P)=-4+10*X1+2.5*X2，B_P=exp(logit(B_P))/(1+exp(logit(B_P)))產(chǎn)生樣本量足夠（例如50 000例）數(shù)據(jù)集，每個(gè)患者有三個(gè)變量值，即Xi 1,Xi 2,Pi。

1.2.6 TUNEL法觀察細(xì)胞凋亡情況 取心肌切片，按照TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書操作，常規(guī)處理左心室石蠟標(biāo)本，凋亡心肌細(xì)胞胞核為熒光綠色，正常心肌細(xì)胞則為藍(lán)色。于200倍視野下統(tǒng)計(jì)凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.7 檢測(cè)ROS、MDA、SOD含量 處死各組剩余大鼠，取心肌組織100 mg，放入離心管中，制成10%的勻漿液，后置于高溫沸水浴箱內(nèi)10min，取出后搖勻，3 500 r/min(半徑8 cm)離心10 min后，取上清檢測(cè)。嚴(yán)格按照各說明書進(jìn)行操作，ELISA檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)ROS、MDA、SOD含量，取波長(zhǎng)450 nm，酶標(biāo)儀讀數(shù)，測(cè)定各孔吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計(jì)算ROS、MDA、SOD含量。

1.2.8 檢測(cè)AMPK、p-AMPK、TSC2 、p-TSC2 、mTOR、p-mTOR的表達(dá)情況 另取各組剩余大鼠心肌組織100 mg，提取總蛋白并進(jìn)行蛋白定量，每孔道加入50 μg蛋白進(jìn)行SDS-PACE電泳后轉(zhuǎn)膜，于5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，加入一抗(1∶500)，4 ℃孵育過夜，加入二抗(1∶2 000)，室溫孵育2 h。后加入ECL試劑，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以目的蛋白條帶灰度值/β-actin灰度值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心電圖變化比較 除假手術(shù)組外，其余各組造模過程中，縫合線收緊冠狀動(dòng)脈前降支后，左心室呈灰白狀，心電圖顯示ST段弓背向上抬高，30 min后剪斷縫合線恢復(fù)前降支血流，表明造模成功。假手術(shù)組心電圖正常，模型組心電圖有明顯的心律失?，F(xiàn)象出現(xiàn)，槲皮素高劑量組、槲皮素低劑量組心律失常現(xiàn)象均有明顯改善，但略低于陽性藥物組，陽性藥物組心電圖表現(xiàn)較好。詳見圖1。

圖1 各組大鼠心電圖變化情況

2.2 各組大鼠心肌梗死面積比較 大鼠心肌梗死面積組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。與模型組比較，槲皮素低劑量組、槲皮素高劑量組及陽性藥物組心肌梗死面積均縮小，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與槲皮素低劑量組比較，槲皮素高劑量組及陽性藥物組心肌梗死面積縮小，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與槲皮素高劑量組比較，陽性藥物組心肌梗死面積縮小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠心肌梗死面積比較(±s) 單位：%

圖2 HE染色下各組大鼠心肌組織病理變化(×200)

2.4 各組心肌細(xì)胞凋亡率比較 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，槲皮素低劑量組、槲皮素高劑量組及陽性藥物組心肌細(xì)胞凋亡率均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與槲皮素低劑量組比較，槲皮素高劑量組及陽性藥物組心肌細(xì)胞凋亡率降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與槲皮素高劑量組比較，陽性藥物組心肌細(xì)胞凋亡率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2、圖3。

表2 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率比較(±s) 單位：%

圖3 TUNEL檢測(cè)各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況(×200)

2.5 各組ROS、MDA、SOD含量比較 各組大鼠心肌組織ROS、MDA、SOD含量組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。與假手術(shù)組比較，模型組、槲皮素低劑量組、槲皮素高劑量組及陽性藥物組心肌組織ROS、MDA含量均升高， SOD含量均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，槲皮素低劑量組、槲皮素高劑量組及陽性藥物組心肌組織ROS、MDA含量均降低，SOD含量均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與槲皮素低劑量組比較，槲皮素高劑量組及陽性藥物組ROS、MDA含量均降低，SOD含量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與槲皮素高劑量組比較，陽性藥物組心肌組織ROS、MDA含量均降低，SOD含量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠心肌組織ROS、MDA、SOD含量比較(±s)

2.6 各組AMPK、p-AMPK、TSC2、p-TSC2、mTOR、p-mTOR的相對(duì)表達(dá)量比較 大鼠心肌組織p-AMPK、p-TSC2、p-mTOR相對(duì)表達(dá)量組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與假手術(shù)組比較，模型組、槲皮素低劑量組、槲皮素高劑量組及陽性藥物組p-AMPK、p-TSC2相對(duì)表達(dá)量均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，p-mTOR相對(duì)表達(dá)量均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，槲皮素低劑量組、槲皮素高劑量組及陽性藥物組p-AMPK、p-TSC2相對(duì)表達(dá)量均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，p-mTOR相對(duì)表達(dá)量均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與槲皮素低劑量組比較，槲皮素高劑量組及陽性藥物組p-AMPK、p-TSC2相對(duì)表達(dá)量均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，p-mTOR相對(duì)表達(dá)量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與槲皮素高劑量組比較，陽性藥物組p-AMPK、p-TSC2相對(duì)表達(dá)量均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，p-mTOR相對(duì)表達(dá)量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AMPK、TSC2、mTOR表達(dá)情況組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表4、圖4。

表4 各組大鼠心肌組織AMPK、p-AMPK、TSC2、p-TSC2、mTOR、p-mTOR的表達(dá)情況比較 (±s)

圖4 Western Blot檢測(cè)各組大鼠心肌AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR表達(dá)情況

3 討 論

MIRI是由于冠狀動(dòng)脈及其分支的粥樣硬化導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈狹窄甚至閉塞，引起心肌超微結(jié)構(gòu)、能量代謝、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等一系列損傷變化，這些損傷在血管恢復(fù)灌注后更加突出，嚴(yán)重者出現(xiàn)心律失常甚至猝死[9]。一般認(rèn)為MIRI發(fā)生與再灌注時(shí)氧自由基大量生成有關(guān)[10]。雷曉鳴等[11]研究表明，槲皮素能夠減輕血腦屏障損傷，減少ROS生成，改善大鼠腦缺血再灌注損傷。本研究通過比較不同劑量槲皮素對(duì)MIRI后氧化應(yīng)激相關(guān)因子及AMPK/TSC2/mTOR通路相關(guān)指標(biāo)的作用，明確其在MIRI發(fā)生后對(duì)心肌的保護(hù)作用及機(jī)制。

線粒體是細(xì)胞能量物質(zhì)生成儲(chǔ)存場(chǎng)所，可以進(jìn)行正常物質(zhì)調(diào)控，使體內(nèi)自由基產(chǎn)生及清除處于動(dòng)態(tài)平衡，而不對(duì)機(jī)體造成影響。當(dāng)心肌缺血缺氧時(shí)線粒體無法進(jìn)行正常有氧氧化及能量代謝，能量產(chǎn)生減少，血液重新灌注時(shí)，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)，自身抗氧化能力減弱，氧氣在蛋白激酶C等催化下生成活性氧類物質(zhì)及過氧化氫等，與此同時(shí)產(chǎn)生過量ROS、MDA，由于自由基的清除依賴SOD等抗氧化酶系統(tǒng)，過量ROS、MDA在消耗抗氧化酶的同時(shí)，仍有大量存在[12-13]。尹方等[14]研究表明，銀杏葉提取物含黃酮類物質(zhì)，可以有效捕獲自由基，改善微循環(huán)，抑制大鼠腦缺血再灌注損傷發(fā)生。另有研究表明，MIRI的發(fā)生常伴隨細(xì)胞凋亡，而丙泊酚聯(lián)合槲皮素可以提高氧化應(yīng)激條件下心肌細(xì)胞抗氧化能力，減少氧化應(yīng)激條件下心肌細(xì)胞凋亡[15-16]。本研究結(jié)果中，模型組心電圖出現(xiàn)明顯心律失常，槲皮素低、高劑量組心律失?，F(xiàn)象有所改善，且槲皮素高劑量組效果更好；HE染色顯示，模型組心肌纖維排列紊亂，核裂解消失，而槲皮素低、高劑量組病理變化較輕；此外，槲皮素各劑量組心肌梗死面積、心肌細(xì)胞凋亡率及ROS、MDA含量較模型組均降低，而SOD含量升高，提示槲皮素可以清除自由基，降低過氧化反應(yīng)，改善心電圖及心肌組織病理變化，與既往研究結(jié)果一致。

AMPK是細(xì)胞內(nèi)重要的代謝傳感器，主要參與維持代謝應(yīng)激下能量平衡和氧化還原穩(wěn)態(tài)，與心臟能量代謝密切相關(guān)[17]。在缺血缺氧或氧化應(yīng)激加強(qiáng)的情況下，AMPK被大量激活，磷酸化水平升高，從而引起TSC2激活，進(jìn)而使mTOR活性降低[18]。由于mTOR是蛋白合成的重要通路，當(dāng)其活性降低時(shí)，肌細(xì)胞相關(guān)蛋白合成受到抑制[19-20]。槲皮素可以通過抑制AMPK/TSC2/mTOR信號(hào)通路，緩解中腦動(dòng)脈閉塞大鼠腦組織的異常自噬[21]。唐丹麗等[22]研究表明，痰瘀同治方可通過抑制因缺氧復(fù)氧而激活的心肌細(xì)胞AMPK/mTOR通路，對(duì)心肌發(fā)揮保護(hù)作用。本研究結(jié)果中，與模型組比較，槲皮素各劑量組p-AMPK、p-TSC2表達(dá)量降低，p-mTOR表達(dá)量升高，且槲皮素高劑量組效果更好，提示槲皮素可以通過抑制AMPK/TSC2/mTOR相關(guān)通路，降低MIRI心肌組織損傷，與既往研究結(jié)果相符。

綜上所述，槲皮素對(duì)MIRI后氧化應(yīng)激反應(yīng)具有一定抑制作用，可改善心電圖，減少心肌凋亡心肌損傷，其機(jī)制可能與抑制AMPK/TSC2/mTOR通路有關(guān)。