尹英超，劉富祥，張玉欽，陳慕雁??

(1.中國海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，山東 青島 266003；2.海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國海洋大學(xué))，山東 青島 266003；3.煙臺(tái)中集藍(lán)海洋科技有限公司，山東 煙臺(tái) 264000)

刺參(Apostichopusjaponicus)屬棘皮動(dòng)物門(Echinodermata)海參綱(Holothuroidea)辛那參目(Synallactida)刺參科(Stichopodidae)，廣泛分布于中國、日本、韓國和俄羅斯等東北亞沿海[1]。刺參作為底棲生物以底泥、碎屑為食，在維持生態(tài)系統(tǒng)平衡中發(fā)揮著重要的作用[2]。此外，刺參具有很高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，長期以來在亞洲市場(chǎng)上作為一種食品和民間藥物備受歡迎，是中國重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)品種之一，目前已經(jīng)成為北方水產(chǎn)養(yǎng)殖中的支柱性產(chǎn)業(yè)[1,3]。

全球氣候的變化導(dǎo)致海水溫度升高和缺氧現(xiàn)象已成為一個(gè)世界性環(huán)境問題，嚴(yán)重影響到海洋生物的生存。“厄爾尼諾”是導(dǎo)致太平洋海水表面溫度異常升高的重要因素之一，可以引發(fā)嚴(yán)重而廣泛的天氣變化，如高溫和暴雨[4]。2013年夏末以來，中國山東、河北兩省因“厄爾尼諾”現(xiàn)象引發(fā)的連續(xù)高溫暴雨天氣，導(dǎo)致海水溫度高達(dá)30 ℃，溶解氧水平降至2 mg/L以下；由于刺參長期營底棲生活，活動(dòng)緩慢，受環(huán)境因素影響非常顯著，極端高溫、低氧脅迫可導(dǎo)致刺參大量死亡，嚴(yán)重制約刺參養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。為了給刺參應(yīng)對(duì)逆境關(guān)鍵指標(biāo)篩選和抗逆品種選育提供理論支持，刺參在急性高溫、低氧脅迫下內(nèi)在分子調(diào)控機(jī)制的科學(xué)研究亟待開展。

棘皮動(dòng)物通常缺乏特異性免疫，體腔液是棘皮動(dòng)物進(jìn)行機(jī)體防御的重要免疫組織。刺參體腔液中懸浮著各種體腔液細(xì)胞，同時(shí)也含有凝集素、水解酶、酚氧化酶、超氧化物歧化酶類白介素和類補(bǔ)體樣因子等體液免疫因子，兩者共同作用負(fù)責(zé)刺參的天然免疫防御[5-6]。已有大量研究表明棘皮動(dòng)物在響應(yīng)外界溫度、鹽度、溶解氧和pH等環(huán)境脅迫因子時(shí)，體腔液及其細(xì)胞的相關(guān)免疫抗病能力會(huì)發(fā)生變化[7-10]。

miRNA是一類長度為21～24 nt的內(nèi)源性非編碼RNA，miRNA能夠通過種子序列與特定的靶基因位點(diǎn)相結(jié)合，引起mRNA降解或抑制mRNA翻譯，從而對(duì)靶基因的表達(dá)起到調(diào)節(jié)作用。目前，關(guān)于miRNA介導(dǎo)高溫、低氧脅迫的調(diào)節(jié)機(jī)制在水生生物中進(jìn)行了廣泛研究。Zheng等在日本對(duì)蝦(Marsupenaeusjaponicus)體內(nèi)共發(fā)掘了15個(gè)miRNA參與高溫脅迫應(yīng)答，靶標(biāo)基因的預(yù)測(cè)和功能分析表明這些miRNA參與了信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄、抗脅迫應(yīng)激等細(xì)胞過程[11]。Zhou等研究發(fā)現(xiàn)虹鱒魚(Oncorhynchusmykiss)在致死溫度22.5 ℃脅迫48 h下，頭、腎組織中共發(fā)掘出12個(gè)上調(diào)和5個(gè)下調(diào)的miRNA，6個(gè)差異表達(dá)的miRNA共預(yù)測(cè)到22個(gè)靶基因，注釋結(jié)果表明在熱應(yīng)激下miRNA主要參與了虹鱒魚的代謝和免疫反應(yīng)[12]。Hadj-Moussa等發(fā)現(xiàn)miRNA調(diào)控的代謝抑制是保障洪堡魷魚(Dosidicusgigas)能夠在缺氧水域生存的重要機(jī)制，在缺氧誘導(dǎo)下魷魚的大腦、外套膜肌肉和心臟中表達(dá)量變化的miRNA主要參與了關(guān)鍵細(xì)胞功能維持和細(xì)胞保護(hù)的過程[13]。Wang等在南美白對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)應(yīng)對(duì)缺氧的研究中，鑒定出許多與缺氧耐受相關(guān)的miRNA，其差異表達(dá)的miRNA可能通過調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)基因(如HIF1a和p53)的表達(dá)來調(diào)節(jié)宿主對(duì)缺氧的反應(yīng)，并影響與缺氧適應(yīng)相關(guān)的關(guān)鍵細(xì)胞事件[14]。Sun等在黒鱸(Micropterussalmoides)缺氧脅迫的研究中篩選出的13個(gè)差異表達(dá)的miRNAs的靶基因在血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路和磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)中顯著富集[15]。關(guān)于刺參miRNA研究起步較晚，最早于2012年Li等從刺參的體腔液細(xì)胞中鑒定到miRNAs[16]，之后的研究表明miRNA廣泛參與了刺參補(bǔ)體系統(tǒng)、脂多糖以及Toll樣受體的調(diào)控[17-22]。近年來，關(guān)于miRNA在刺參響應(yīng)環(huán)境脅迫中的調(diào)控作用研究也相繼開展。Li等構(gòu)建了刺參在高溫脅迫下的miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)大量差異表達(dá)的miRNA參與免疫過程相關(guān)的調(diào)節(jié)[23]；Huo等在刺參缺氧脅迫研究中發(fā)現(xiàn)miRNA可能在氧化還原、運(yùn)輸以及耐缺氧脅迫中發(fā)揮作用[24]。Tian等研究發(fā)現(xiàn)miR-10可能通過靶標(biāo)TBC1D5基因參與低鹽脅迫下刺參的能量調(diào)節(jié)，并在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)方面起到了關(guān)鍵作用[25]。Huo等以刺參呼吸樹為研究對(duì)象，構(gòu)建了在高溫、低氧脅迫下刺參的miRNA表達(dá)譜，并在高溫(26 ℃)、低氧(2 mg/L)和高溫低氧復(fù)合脅迫條件下，分別鑒定出21、26和22個(gè)差異表達(dá)miRNA，GO和KEGG通路分析顯示差異miRNA的潛在靶基因參與了生物合成、代謝、免疫、細(xì)胞生長和死亡、翻譯及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程[26]。

本研究以刺參高溫、低氧脅迫下的體腔液細(xì)胞為研究對(duì)象(由于高溫低氧協(xié)同組的刺參全部死亡，無法進(jìn)行后續(xù)的研究)，采用Illumina測(cè)序技術(shù)，結(jié)合生物信息學(xué)分析，構(gòu)建了刺參在高溫、低氧脅迫下的miRNA表達(dá)譜，使用miRanda軟件，以構(gòu)建的三代全長轉(zhuǎn)錄組為參考文庫，預(yù)測(cè)了差異表達(dá)miRNA的靶標(biāo)基因，并對(duì)候選靶標(biāo)基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析，發(fā)掘了刺參在高溫、低氧脅迫下的差異miRNA參與調(diào)控的關(guān)鍵通路，探討了miRNA在刺參體腔液細(xì)胞響應(yīng)高溫、低氧脅迫中的潛在調(diào)控機(jī)制，為篩選刺參抗逆關(guān)鍵指標(biāo)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物暫養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)所用的成熟刺參于2019年4月采集于威海刺參養(yǎng)殖場(chǎng)，低溫運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室。挑選120頭健康無病、發(fā)育良好的刺參(體質(zhì)量(120±20)g)分別放入12個(gè)大小、形狀、材質(zhì)一致的藍(lán)色避光的養(yǎng)殖水箱中，每個(gè)水箱中放置10頭刺參，為了消除環(huán)境因素的差異，在海邊收集大小不一的碎石經(jīng)消毒清洗后，放入水箱中供刺參附著，箱內(nèi)水溫(T)為(15±1)℃，鹽度為30±1，pH為8.0±0.5，充氣保持溶解氧(DO)為8 mg/L，在此環(huán)境中馴化2周。期間每日上午定時(shí)清除水箱底部的糞便和剩余的飼料，飼料與底泥按1∶3比例混合投喂。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)處理 對(duì)照組的條件設(shè)置為T=15 ℃、DO=8 mg/L，高溫處理組T=30 ℃，DO=8 mg/L，低氧處理組T=15 ℃，DO=2 mg/L，高溫低氧處理組T=30 ℃，DO=2 mg/L。高溫設(shè)置方法為使用功率1 000 W的加熱棒加熱來達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需的水溫，并通過控溫器來保持水溫，水溫升高速率為2 ℃/h。低氧設(shè)置方法為向水體中充入氮?dú)猓刂频獨(dú)獬淙胨俾?，使溶解氧下降速率保持?.8 mg/L。達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需溶氧條件后，使用塑料薄膜覆蓋水箱的水面，在低氧脅迫期間使用便攜式溶氧儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)溶解氧水平。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別設(shè)置3個(gè)平行，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組在達(dá)到所需溫度溶氧條件后48 h進(jìn)行取樣。

1.1.3 樣品收集 每個(gè)平行組中取4頭刺參，設(shè)3個(gè)平行組，每個(gè)處理組共取12頭刺參。將每個(gè)刺參的體腔液分別取3份，每份體積為1 mL，在4 ℃，1 000 r/min的冷凍離心機(jī)中離心30 s,去掉上清液后將剩余細(xì)胞混合，加入1 mL的Trizol試劑，立即放入液氮中速凍后轉(zhuǎn)入-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｓ捎诖虆o法耐受48 h的高溫低氧(T=30 ℃, DO=2 mg/L)的協(xié)同作用而全部死亡，無法取得該實(shí)驗(yàn)組樣品進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2 RNA文庫構(gòu)建

采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，具體步驟見李興可等[27]。使用Nanodrop檢測(cè)RNA的純度(OD260/280比值)；使用Qubit對(duì)RNA濃度進(jìn)行精確定量；使用Agilent 2100精確檢測(cè)RNA的完整性。使用NEBNext? Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina?(NEB, USA)生成測(cè)序文庫，文庫中對(duì)照組為CO1、CO2、CO3，高溫組為HS1、HS2、HS3，低氧組為HY1、HY2、HY3，建庫流程如圖1所示。

圖1 Illumina樣品檢測(cè)、建庫和測(cè)序的流程圖

1.3 miRNA測(cè)序與數(shù)據(jù)分析

采用Illumina Hiseq 2500進(jìn)行miRNA測(cè)序，去除低質(zhì)量的reads(質(zhì)量值小于等于20 的堿基占整個(gè)reads的30%以上)；去除 N(N表示無法確定堿基信息)的比例大于10%的 reads；去除接頭污染的reads；去除3’接頭序列；去除polyA/T/G/C的reads。選擇一定長度的clean reads用于下游的分析，miRNA的長度集中在21～22 nt。將小RNA標(biāo)簽映射到RepeatMasker和Rfam數(shù)據(jù)庫，除去源自蛋白質(zhì)編碼基因、重復(fù)序列、rRNA、tRNA、snRNA和snoRNA等。用bowtie將長度篩選后的sRNA定位到刺參基因組(NCBI BioProject ID: 29023486)序列上，分析small RNA在參考序列上的分布情況。

1.4 miRNA的鑒定和差異表達(dá)分析

使用miRBase20.0作為參考，鑒定已知的miRNA；結(jié)合miRNA前體發(fā)夾結(jié)構(gòu)特征，采用軟件miREvo和mirdeep2預(yù)測(cè)新的miRNA。將所有sRNA標(biāo)簽與成熟miRNA進(jìn)行比對(duì)，檢測(cè)可能有堿基編輯的miRNA，已知的miRNA使用miFam.dat(http://www.mirbase.org/ftp.shtml)查找家族。將新的miRNA前體提交到Rfam庫(http://rfam.sanger.ac.uk/search/)，以尋找Rfam家族。根據(jù)下面算法，應(yīng)用TPM(每百萬轉(zhuǎn)錄本)估算miRNA表達(dá)水平。

規(guī)范化表達(dá)式=(映射的讀數(shù)/總讀數(shù))×1 000 000。

使用DESeq R軟件包(1.8.3)對(duì)兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行差異表達(dá)分析。使用Benjamini&Hochberg方法調(diào)整P值。默認(rèn)情況下，P<0.05為顯著差異表達(dá)。

1.5 靶標(biāo)基因的預(yù)測(cè)和分析

利用miRanda分析軟件，以前期構(gòu)建的三代全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)作為參考文庫，從中提取3’非編碼區(qū)域，預(yù)測(cè)靶標(biāo)基因。將篩選參數(shù)設(shè)置為自由能小于-83.68 kJ/mol和得分閾值大于140。

1.6 GO和KEGG富集分析

基于GOseq的Wallenius非中心超幾何分布調(diào)整基因長度偏差，用于GO富集分析。Pathway顯著性富集分析以KEGG Pathway為單位，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，該分析計(jì)算公式如下：

得到的P值經(jīng)Bonferroni方法校正，以校正后的P值小于0.05定義為顯著富集的pathway。

1.7 qRT-PCR驗(yàn)證

應(yīng)用SYBR?Premix Ex TaqTMII Kit(Takara，Japan，Cat No.RR820)試劑盒，分別取刺參對(duì)照組、高溫組、低氧組的樣品各5個(gè)平行，每個(gè)平行樣品設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)，將成熟miRNA(21～23 nt)的完整序列用作miRNA特異性5’端引物，引物序列如表1所示。

表1 miRNA qRT-PCR的引物序列

qPCR的3’端引物使用試劑盒提供的mRQ 3’通用引物，以U6作為內(nèi)參基因，其引物序列為：F:GGAACGATACAGAGAAGATTAGC, R: TGGAACG-CTTCACGAATTTGCG。變性的反應(yīng)條件：95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。融解曲線的反應(yīng)條件：95 ℃ 60 s，55 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s。使用2-ΔΔCt法計(jì)算 miRNA 的相對(duì)表達(dá)水平，使用單因素方差分析miRNA的組間差異顯著性，以P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序結(jié)果分析

建庫之后，利用Illumina HiSeqTM2500測(cè)序平臺(tái)將原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)過堿基識(shí)別轉(zhuǎn)化為測(cè)序序列，得到的Raw Data以FASTQ格式儲(chǔ)存，原始數(shù)據(jù)已上傳至NCBI(BioProject ID: PRJNA723369, SubmissionID: SUB9504899)。檢查測(cè)序錯(cuò)誤率異常的堿基位置分布，發(fā)現(xiàn)9個(gè)文庫測(cè)序結(jié)果中每個(gè)位置堿基的錯(cuò)誤率都低于0.5%，詳細(xì)結(jié)果見附表1。

2.2 sRNA的測(cè)序分析結(jié)果

為了保證信息分析的質(zhì)量，對(duì)得到的Raw Data數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，得到Lean Data，篩選出sRNA進(jìn)行后續(xù)的分析，詳細(xì)結(jié)果見附表2。

用bowtie將長度篩選后的sRNA比對(duì)到刺參參考基因組序列上，發(fā)現(xiàn)每組中90%以上sRNA能夠比對(duì)上參考基因組，其中HY3組能比對(duì)到參考基因組的數(shù)量最少(91.96%)，HY1組能比對(duì)上參考基因組的數(shù)量最多(98.27%)，與參考基因組方向相同鏈的reads數(shù)占全部clean reads數(shù)的83%以上，方向相反鏈的reads數(shù)占全部clean reads數(shù)的10%以下，結(jié)果如表2所示。

表2 sRNA與參考基因組比對(duì)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.3 已知miRNA與ncRNA分析

所有樣本中共比對(duì)到33個(gè)已知的miRNA，比對(duì)上的sRNA的種類有3 242種。對(duì)Novel miRNA成熟體、前體、種類和總數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，詳細(xì)結(jié)果見附表3?？偣财ヅ涞降那绑w和成熟體的數(shù)目分別為149和159，詳細(xì)結(jié)果見附表4。

2.4 miRNA家族分析

對(duì)檢測(cè)到的已知miRNA和新預(yù)測(cè)到的miRNA進(jìn)行家族分析，結(jié)果顯示，已知miRNA和新miRNA總共屬于31個(gè)不同的miRNA家族，其中l(wèi)et-7在物種中的分布最豐富。大多數(shù)miRNA只檢測(cè)到一個(gè)前體，miR-10、miR-124和miR-25檢測(cè)到3個(gè)前體。miRNA家族分析部分結(jié)果見附表5。

2.5 miRNA差異表達(dá)分析

在HS組中共發(fā)掘出20個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其中11個(gè)上調(diào)，9個(gè)下調(diào)；在HY組中共發(fā)掘出10個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其中6個(gè)上調(diào)、4個(gè)下調(diào)(見表3)。兩組中共同差異表達(dá)的miRNA有6個(gè)：novel-23、novel-43、novel-45、novel-49、miR-200-3p和miR-71。為驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性，分別從高溫組和低氧組中隨機(jī)選取了10個(gè)差異miRNA，其中高溫組選取miR-133、miR-71、miR-10、miR-2012、miR-200-3p和Novel-32，低氧組選取miR-2006、miR-71、miR-200-3p和Novel-43，利用熒光定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，高通量測(cè)序結(jié)果和qRT-PCR結(jié)果趨勢(shì)相同(見圖2)。

圖2 差異表達(dá)miRNAs的qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果

表3 高溫組和低氧組差異表達(dá)miRNA的詳細(xì)結(jié)果

2.6 靶基因預(yù)測(cè)和功能富集分析

我們以刺參的三代全長轉(zhuǎn)錄組中的191 141個(gè)轉(zhuǎn)錄本作為參考文庫，預(yù)測(cè)差異表達(dá)miRNA的靶基因。結(jié)果表明，高溫組中20個(gè)差異表達(dá)miRNA共預(yù)測(cè)到14 827個(gè)靶基因，低氧組中10個(gè)差異表達(dá)的miRNA共預(yù)測(cè)到8 577個(gè)靶基因。

我們對(duì)每組的差異表達(dá)miRNA的靶基因分別進(jìn)行了GO和KEGG富集分析。富集分析結(jié)果顯示，在高溫脅迫組中，差異表達(dá)miRNA的靶向基因在細(xì)胞組分中聚類最明顯的是細(xì)胞成分，在分子功能項(xiàng)中聚類最明顯的是轉(zhuǎn)運(yùn)活性和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體活性(Transmembrane transporter activity)，在生物學(xué)進(jìn)程中跨膜運(yùn)輸(Transmembrane transport)聚類最為明顯。在低氧脅迫組中，差異表達(dá)miRNA的靶向基因在細(xì)胞組分中聚類最顯著的是細(xì)胞成分和膜部分(Membrane part)；在分子功能項(xiàng)中聚類最顯著的是轉(zhuǎn)運(yùn)活性，在生物學(xué)進(jìn)程中內(nèi)肽酶活性(Endopeptidase activity)聚類最顯著，詳細(xì)結(jié)果如圖3所示。

圖3 差異表達(dá)miRNA靶基因的GO富集分析

KEGG富集分析結(jié)果顯示，高溫組中顯著富集的通路有36個(gè)，其中富集到基因數(shù)目較多的通路主要集中在磷脂酰肌醇激酶-絲氨酸/蘇氨酸激酶信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)、癌癥通路(Pathways in cancer)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工(Protein processing in endoplasmic reticulum)和黏著斑(Focal adhesion)。在低氧組中顯著富集的通路有37個(gè)，富集靶基因數(shù)目較多的通路主要集中在黏著斑(Focal adhesion)、癌癥通路、磷脂酰肌醇激酶-絲氨酸/蘇氨酸激酶信號(hào)通路和絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路(MAPK signaling pathway-fly)，結(jié)果如圖4所示。

((a)高溫組；(b)低氧組。(a)Heat stress group；(b)Hypoxia group.)

3 討論

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，刺參不同組織中(腸道、肌肉、體壁、管足以及體腔液等)miRNA表達(dá)譜得到廣泛的構(gòu)建[22]，表達(dá)譜分析表明miRNA在刺參生物學(xué)過程中具有潛在的關(guān)鍵調(diào)控作用，但在刺參體腔液細(xì)胞中miRNA響應(yīng)高溫、低氧脅迫的調(diào)控機(jī)制的研究還少有報(bào)道。

體腔液作為刺參內(nèi)外環(huán)境的滲透介質(zhì)，外界環(huán)境的變化可能影響體腔液細(xì)胞的活性和功能，高溫和低氧是目前影響刺參生存最重要的環(huán)境因子。本研究共構(gòu)建了9個(gè)刺參體腔液細(xì)胞的miRNA文庫，測(cè)序結(jié)果顯示大部分成熟體miRNA長度分布在21～23 nt，峰值大小為22 nt，這與大部分海洋無脊椎動(dòng)物的研究結(jié)果相似，略微的差異可能是由物種差異和組織特異性導(dǎo)致的。

本研究從刺參的體腔液細(xì)胞中共鑒定到33個(gè)已知的miRNA和149個(gè)Novel miRNA。多數(shù)miRNA在各物種中是高度保守的，發(fā)揮了廣泛而重要的調(diào)控作用。其中高溫組中miR-133、miR-10、miR-2012、miR-200-3p、miR-71和低氧組中miR-1、miR-2006、miR-200-3p、miR-71都有顯著差異表達(dá)。有研究表明，miR-10是刺參體腔液細(xì)胞中最豐富的miRNA[16]，且在細(xì)胞凋亡[28]、蛋白合成[29]、胚胎發(fā)育和分化[30-31]、造血干細(xì)胞調(diào)動(dòng)[32]和炎癥[33]等生物過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，這表明miR-10在刺參響應(yīng)高溫脅迫中同樣可能參與調(diào)控多個(gè)生理學(xué)過程。De Lencastreetal等研究發(fā)現(xiàn)miR-71與細(xì)胞的衰老和DNA損傷反應(yīng)有關(guān)[34]，另有研究發(fā)現(xiàn)miR-71同樣可以增強(qiáng)對(duì)熱休克和氧化應(yīng)激的抗性[35]。Huo等最近研究發(fā)現(xiàn)miR-71家族成員在高溫脅迫中是顯著上調(diào)的[26]，這和本文的結(jié)果一致，也暗示了本研究中miR-71在刺參響應(yīng)高溫、低氧脅迫下的潛在功能。miR-1已被證實(shí)與凋亡相關(guān)基因如熱休克蛋白基因相關(guān)，并間接調(diào)節(jié)eNOs以及細(xì)胞凋亡[36]，以往研究也發(fā)現(xiàn)刺參呼吸樹中miR-1在低氧脅迫下顯著上調(diào)[24]，這和本文的研究結(jié)果一致。miR-133家族因?yàn)樵谝种迫祟惏┌Y發(fā)生中的關(guān)鍵作用被充分研究[37]，在心肌細(xì)胞中miR-133通過靶向Hsp70抑制細(xì)胞凋亡[38]，相關(guān)研究還直接證明miR-133通過靶向AjIRAK-1參與Toll樣受體(TLR)級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)，從而促進(jìn)刺參體腔細(xì)胞吞噬功能[39]。本研究中miR-133在高溫脅迫下顯著上調(diào)，這暗示了miR-133可能參與了高溫脅迫下體腔液細(xì)胞抗凋亡過程和免疫應(yīng)激。miR-200家族是哺乳動(dòng)物中最著名的miRNA家族之一。作為該家族的重要一員，miR-200-3p被報(bào)道參與細(xì)胞增殖、凋亡和腫瘤發(fā)生等生物學(xué)過程[40-41]。本課題組在刺參夏眠的研究中也發(fā)現(xiàn)了miR-200-3p能夠通過靶向AjEHHADH和AjCA參與刺參夏眠期間氧化損傷和細(xì)胞周期調(diào)控[42-43]。在本研究中，miR-200-3p在高溫和低氧脅迫下均顯著上調(diào)，揭示了miR-200-3p可能在刺參響應(yīng)高溫、低氧脅迫下參與了廣泛的生物學(xué)功能調(diào)節(jié)。目前關(guān)于miR-2012的功能研究還有待開展。

為進(jìn)一步發(fā)掘miRNA潛在的調(diào)控機(jī)制，我們以三代轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為參考文庫，預(yù)測(cè)了差異表達(dá)miRNA的候選靶基因。單個(gè)miRNA可以靶向多個(gè)靶基因，每個(gè)靶基因也可以被多個(gè)miRNA調(diào)控，因此，miRNA通過介導(dǎo)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)發(fā)揮調(diào)控功能。靶基因GO分析結(jié)果顯示，大多數(shù)靶基因與細(xì)胞組分、轉(zhuǎn)運(yùn)以及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性有關(guān)。靶基因KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)多數(shù)基因在絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路、磷脂酰肌醇激酶-絲氨酸/蘇氨酸激酶信號(hào)通路、寡聚化核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域樣受體信號(hào)通路(NOD-like receptor signaling pathway)、黏著斑等信號(hào)通路中顯著富集。MAPK級(jí)聯(lián)協(xié)同傳遞各種細(xì)胞外信號(hào)，從而控制大量不同甚至相反的細(xì)胞過程，如增殖、分化、生存、發(fā)育、應(yīng)激反應(yīng)和凋亡[44]，有研究發(fā)現(xiàn)MAPK在調(diào)節(jié)凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)、香港牡蠣(Crassostreahongkongensis)等多種水生生物的先天免疫過程中發(fā)揮著重要作用[45-46]。同樣在刺參體腔液高溫脅迫的研究中發(fā)現(xiàn)p44/42MAPK可能通過靶向p90RSK參與溫度誘導(dǎo)的代謝抑制[47]。PKB/Akt通路同樣能夠介導(dǎo)多種細(xì)胞功能，包括血管生成、代謝、生長、增殖、存活、免疫、轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞凋亡[48]，在水產(chǎn)動(dòng)物的研究中發(fā)現(xiàn)Akt基因可能參與介導(dǎo)水產(chǎn)動(dòng)物機(jī)體的免疫防御。如香港牡蠣(Crassostreahongkongensis)在受到溶藻弧菌等病原菌感染后, 其體內(nèi)Akt基因表達(dá)上調(diào)[49]。研究發(fā)現(xiàn)海膽中第二大免疫受體家族是NOD-like受體(NLRs)，而在哺乳動(dòng)物中的NLRs通過充當(dāng)支架蛋白來組裝蛋白復(fù)合物，從而激活NFkB和MAPK信號(hào)通路，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用[6]。在刺參研究中同樣發(fā)現(xiàn)AjNLRP10蛋白參與了對(duì)細(xì)菌感染的先天免疫應(yīng)答[50]。這些都表明了本研究中miRNA通過靶向這些免疫相關(guān)通路參與刺參響應(yīng)高溫、低氧脅迫下的信號(hào)傳導(dǎo)、氧化應(yīng)激以及免疫反應(yīng)等過程。

4 結(jié)語

本研究以高溫組、低氧組和對(duì)照組的體腔液細(xì)胞為研究對(duì)象，利用Illumina測(cè)序平臺(tái)構(gòu)建了9個(gè)miRNA文庫，有效補(bǔ)充了刺參體腔液細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜，并篩選了在高溫脅迫和低氧脅迫下差異表達(dá)的miRNAs?；诓町惐磉_(dá)的miRNAs，以三代全長轉(zhuǎn)錄組為參考文庫預(yù)測(cè)了其候選靶基因，KEGG富集分析表明靶基因主要參與了刺參應(yīng)激、存活和免疫等重要生物學(xué)過程，進(jìn)一步揭示了差異表達(dá)的miRNAs在刺參應(yīng)對(duì)高溫脅迫和低氧脅迫過程中的重要調(diào)控作用。后期將利用功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證關(guān)鍵miRNAs及其靶基因的互作關(guān)系，進(jìn)一步探討關(guān)鍵差異miRNA在刺參應(yīng)對(duì)高溫、低氧脅迫過程中的調(diào)控作用，以期為刺參應(yīng)對(duì)高溫、低氧逆境關(guān)鍵分子標(biāo)記的篩選和刺參抗逆品種與品系的選育提供理論指導(dǎo)。