侯榮軒，趙 燁，田彥挺，佀化玙，張華新，李 娟，紀(jì)清巨，楊慶山，孫宇涵＊，李 云＊

(1.北京林業(yè)大學(xué)林木育種國家工程實(shí)驗(yàn)室，林木花卉遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院，北京 100091；3.鹽山縣自然資源和規(guī)劃局，河北 滄州 061300；4.滄州市自然資源和規(guī)劃局種苗站，河北 滄州 061001；5.山東省林業(yè)科學(xué)研究院，山東 濟(jì)南 250014)

據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全球鹽漬化土地約1.0 ×109hm2，達(dá)到了世界土地面積的10%[1-2]，全球20%的耕地和水澆地受到鹽漬化的影響，而且數(shù)量還在持續(xù)上升[3]。我國鹽漬化情況尤為嚴(yán)重，鹽漬土總面積高達(dá)3.6 × 107hm2，占可用耕地的4.88%，且有9.2 × 107hm2的耕地正面臨著鹽漬化的威脅[4]。因此，在林業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域，選育耐鹽堿林木新品種工作迫在眉睫。楊樹是世界上最重要的紙漿原料和工業(yè)原料之一[5]，并廣泛應(yīng)用于生態(tài)防護(hù)、道路綠化和園林景觀等用途。毛白楊（Populus tomentosaCarr.）是我國特有的鄉(xiāng)土樹種，生長速度快，主干通直粗壯，抗病蟲害，適應(yīng)能力強(qiáng)[6-7]。毛白楊屬于輕度耐鹽樹種，當(dāng)土壤中NaCl 含量超過0.3%時(shí)就會影響其正常生長，這也是影響其在我國進(jìn)一步推廣的原因[8]。所以，培育耐鹽毛白楊新品種更能充分發(fā)揮其生態(tài)和生產(chǎn)效益。相較于傳統(tǒng)育種手段，基因工程育種可以突破種屬限制，具有高效和專一的特點(diǎn)[9]。自1986 年楊樹首次實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化和外源基因表達(dá)[10]以來，楊樹轉(zhuǎn)基因研究發(fā)展迅速。我國于1996 年培育出第一批具有較高抗鹽性的轉(zhuǎn)化楊樹植株[11]，截至目前，有10 例轉(zhuǎn)基因楊樹進(jìn)入田間試驗(yàn)階段，有2 例進(jìn)入商品化應(yīng)用階段[12]。

化感作用是指各種植物所釋放的化學(xué)物質(zhì)引起的直接或者間接作用[13]?；形镔|(zhì)主要是在植物體內(nèi)通過生物途徑合成的次生代謝物質(zhì)，以游離或特定的形式貯存于植物體內(nèi)各組織器官、周圍根際土壤及其凋落物中，能直接或間接的影響自身或周圍其它生物的生存及生長發(fā)育[14]。楊樹作為我國重要的經(jīng)濟(jì)林木，對生態(tài)系統(tǒng)的影響也是備受矚目的問題[15-16]。本試驗(yàn)用Sandwich 方法選擇常用的十字花科、蕓薹屬植物白菜（Brassica pekinensis(Lour.) Rupr.）的種子作為萌發(fā)試驗(yàn)處理對象[17-18]。

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)越來越多的應(yīng)用于林木遺傳改良工作，轉(zhuǎn)基因林木的生物安全性也日益受到關(guān)注?，F(xiàn)階段轉(zhuǎn)基因安全性評價(jià)主要包括4 各方面：（1）外源基因是否穩(wěn)定存在；（2）轉(zhuǎn)基因過程中載體攜帶的抗性基因轉(zhuǎn)移；（3）外源基因的轉(zhuǎn)移；（4）轉(zhuǎn)基因林木可能通過植物殘?bào)w或根際代謝影響土壤微生物數(shù)量，從而破壞土壤微生物群落多樣性[19-22]。

AhDREB1基因是從一種鹽生植物山菠菜（Atriplex hortensisL.）中分離出來的DREB 轉(zhuǎn)錄因子，是植物特有且含有一個高度保守的AP2 結(jié)構(gòu)域，可以通過正調(diào)控下游脅迫相關(guān)基因的表達(dá)和提高活性氧清除能力，提高植物鹽脅迫下耐鹽能力。本實(shí)驗(yàn)室杜寧霞于2003 年成功將AhDREB1基因轉(zhuǎn)入三倍體毛白楊雜種（（Populus tomentosa×P.bolleana）×P.tomentosa）中，獲得多個轉(zhuǎn)基因株系，實(shí)驗(yàn)室繼代保存14 年后于2017 年開展野外試驗(yàn)。本研究以2017 年栽植于天津?yàn)I海的轉(zhuǎn)基因毛白楊自根苗株系（T12、T46、T 轉(zhuǎn)）和河北滄州的轉(zhuǎn)基因毛白楊嫁接苗株系（T12、T46、T 轉(zhuǎn)）為對象，通過PCR 技術(shù)，檢測天津和滄州轉(zhuǎn)基因毛白楊外源基因穩(wěn)定性和水平轉(zhuǎn)移問題，對天津基地轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因毛白楊根際土壤微生物數(shù)量進(jìn)行連續(xù)檢測，并對兩地轉(zhuǎn)基因毛白楊對非目標(biāo)植物化感作用進(jìn)行研究，以期能夠較為全面的研究轉(zhuǎn)基因毛白楊生態(tài)安全性問題。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)基地概況

2017 年春，將轉(zhuǎn)AhDREB1基因毛白楊自根苗株系T12、T46、T 轉(zhuǎn)種植于天津市濱海新區(qū)耐鹽堿植物科技園區(qū)，種植面積2 500 m2，株行距3 m × 1.5 m，土壤鹽堿度0.2%。嫁接苗株系T12、T46、T 轉(zhuǎn)種植在河北省滄州市鹽山縣國家抗鹽堿樹種良種基地，砧木小葉楊（Populus simoniiCarr.）種植面積10 000 m2，株行距3 m × 3 m，土壤鹽堿度0.4%～0.6%。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 外源基因穩(wěn)定性檢測 外源基因在受體植物中長期穩(wěn)定存在且表達(dá)是轉(zhuǎn)基因植物新品種培育的重要依據(jù)[23]。本課題組采集了4 年生的轉(zhuǎn)基因楊樹和非轉(zhuǎn)基因楊樹葉片，共4 個株系，每個株系隨機(jī)采集3 棵樣本植物的幼嫩葉片，放置于干冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室低溫保存。使用天根生物植物基因組DNA 提取試劑盒，提取葉片基因DNA，對目的片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。

本研究中轉(zhuǎn)基因毛白楊采用植物表達(dá)載體PBI121，該載體攜帶35S 啟動子控制下的AhDREB1和胭脂堿合酶(NOS)啟動子控制下的新霉素磷轉(zhuǎn)移酶基因(NPTⅡ)（圖1）。在本實(shí)驗(yàn)中，利用軟件Primer 5.0 中根據(jù)AhDREB1基因（GenBank accession No.AF274033）序列設(shè)計(jì)特異性引物：

圖1 表達(dá)載體構(gòu)建示意圖譜Fig.1 Structural drawing of AhDREB1 in the expression vector

F:5′-GAAGAAAGATGTTGCTAATAATAAC-3 ′;R:5 ′-AATAATAATACTTCACTAAAAATGAT C-3′。

PCR 擴(kuò)增條件如表1，預(yù)期擴(kuò)增片段長度為666 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，電泳結(jié)果使用UVP 凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察拍照。

表1 PCR 擴(kuò)增條件Table 1 PCR conditions

1.2.2 根際土壤微生物培養(yǎng)與計(jì)數(shù) 為了檢測轉(zhuǎn)基因毛白楊對土壤微生物的影響，對天津?qū)嶒?yàn)地土壤于2021 年3、4、5 月進(jìn)行連續(xù)動態(tài)監(jiān)測。每個月采集土壤樣品，培養(yǎng)土壤微生物并進(jìn)行計(jì)數(shù)。細(xì)菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（3.0 g·L-1牛肉膏 +10.0 g·L-1蛋白胨+5.0 g·L-1NaCl+15.0 g·L-1瓊脂，pH=7.4～7.6），真菌用馬丁氏培養(yǎng)基（10.0 g·L-1葡萄糖+5.0 g·L-1蛋白胨+1.0 g·L-1KH2PO4+0.5 g·L-1MgSO4·7H2O+20.0 g·L-1瓊脂+3.0 mL·L-11%孟加拉紅水溶液），放線菌使用改良高氏一號培養(yǎng)基（20.0 g·L-1可溶性淀粉+1.0 g·L-1KNO3+0.5 g·L-1K2PO4+0.5 g·L-1MgSO4·7H2O+0.5 g·L-1NaCl+0.01 g·L-1FeSO4·7H2O+20.0 g·L-1瓊脂，pH=7.4～7.6）。

土壤采樣具體方法：每個系號隨機(jī)選取樣樹3 棵，以樣樹為中心，選取距離主干30 cm 距離的等邊三角形的3 個頂點(diǎn)，采集10～20 cm 土層處土壤樣品約100 g，該土層處微生物最為豐富[1]。將采集好的土壤樣本裝入自封袋中密封保存，并置于冰盒中干冰低溫保存運(yùn)輸帶回實(shí)驗(yàn)室，冰箱4 ℃存放。

準(zhǔn)確稱取新鮮土樣10 g，倒入裝有90 mL無菌水的培養(yǎng)瓶中，在恒溫?fù)u床上200 r·min-1、25 ℃、震蕩 10 min，使微生物細(xì)胞充分分散，然后靜置5 min，得到10-1土壤稀釋液，再吸取10 mL懸浮液加入90 mL 無菌水得到10-2土壤稀釋液，照此方法獲得每個樣本的10-3土壤稀釋液。用移液器吸取100 μL 的10-3土壤懸浮液接種于培養(yǎng)基上，每個樣本3 次重復(fù)，放入恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。細(xì)菌37 ℃培養(yǎng)1 d 計(jì)數(shù)，真菌25 ℃下培養(yǎng)4 d 計(jì)數(shù)，放線菌28 ℃培養(yǎng)3 d 計(jì)數(shù)。

土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量計(jì)數(shù)方法：菌落數(shù)量（CFU）=（微生物數(shù)量 × 稀釋倍數(shù)）/土壤干質(zhì)量。

1.2.3 外源基因以及抗性水平轉(zhuǎn)移情況 監(jiān)測土壤總DNA 的提?。菏褂锰旄锕镜耐寥阑蚪MDNA 提取試劑盒，以土壤總DNA 為模板，用原核生物16S DNA 通用引物(F:5′-ACG GGC GGT GTG TAC-3′;R:5′-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3′)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，檢測土壤總DNA提取質(zhì)量，預(yù)期擴(kuò)增片段長度為1 050 bp。以根系土壤總DNA為模板，使用AhDREB1基因特異性引物和NPTⅡ基因引物（F：5′-ATG ATT GAA CAA GAT GGA TTG C-3′;R：5′-TCA GAA GAA CTC GTC AAG AAG G-3′）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，檢測外源基因和抗性基因。

抗性菌株基因組DNA 提?。悍謩e用添加有50 mg·L-1卡那霉素的細(xì)菌、真菌、放線菌培養(yǎng)基篩選抗性菌株，使用天根生物公司植物基因組DNA 提取試劑盒提取真菌基因組DNA，真核生物18S DNA 通用引物（F:5′-GGG GGA GTA TGG TCG CAA GGC-3′;R:5′-TCA GTG TAG CGC GCG TGC GGC-3′）檢測質(zhì)量，預(yù)期擴(kuò)增片段367 bp。使用天根生物公司細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取細(xì)菌和放線菌DNA，原核生物16S DNA通用引物檢測質(zhì)量。分別使用AhDREB1基因特異性引物和NPTⅡ基因引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，檢測外源基因和抗性基因。進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，檢測外源基因和抗性基因。

為檢測滄州嫁接苗轉(zhuǎn)基因毛白楊外源基因是否轉(zhuǎn)移到砧木當(dāng)中，采集滄州轉(zhuǎn)基因株系砧木根系樣本，提取總DNA，用外源基因特異性引物檢測。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因毛白楊枯落物降解情況及外源基因檢測 2020 年9 月和2021 年3 月在滄州和天津?qū)嶒?yàn)林中開展轉(zhuǎn)基因毛白楊枯落物降解試驗(yàn)，模擬野外中轉(zhuǎn)基因植株自然掉落情況，分別采集每個系號莖（新生嫩芽，多年生枝條）、根（新生根尖、多年生側(cè)根）、葉片（新生嫩葉、當(dāng)年生老葉）分別裝入帶孔網(wǎng)兜中，然后用釘子固定于樣樹下雜草表面、土壤表面和土壤中（深度20 cm），2 個月后回收提取DNA 檢測外源基因。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因毛白楊葉片化感活性的檢測 分別采集滄州和天津轉(zhuǎn)基因毛白楊和非轉(zhuǎn)基因毛白楊葉片，在烘箱中60 ℃烘干處理24 h 后在粉碎機(jī)中打碎成葉粉。配制0.5%的瓊脂溶液，加熱至瓊脂完全溶解后先在6 cm 一次性無菌培養(yǎng)皿中加入5 mL瓊脂溶液，然后在培養(yǎng)皿中加入100 mg 毛白楊葉粉，待下層瓊脂冷凝后再向培養(yǎng)皿中加入5 mL瓊脂溶液。放置培養(yǎng)皿至瓊脂凝固冷卻至室溫，選取種粒飽滿的白菜種子，用尖嘴鑷子夾取白菜種子均勻放置于培養(yǎng)基表面，每個培養(yǎng)皿放置5 粒種子，每個系號5 次重復(fù)?？瞻讓φ諡椴患尤肴~粉，僅加入10 mL0.5%的瓊脂的培養(yǎng)皿，其他處理與實(shí)驗(yàn)組相同。將所有培養(yǎng)皿放入人工氣候箱中遮光培養(yǎng)3 d，人工氣候箱的條件設(shè)置為溫度25 ℃、相對濕度60%、黑暗72 h，3 d 后測量萌發(fā)白菜種子的胚根和胚軸長度。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源基因穩(wěn)定檢測

從天津和滄州兩地實(shí)驗(yàn)田的轉(zhuǎn)基因以及非轉(zhuǎn)基因楊樹植株葉片中提取基因組DNA，設(shè)計(jì)特異性引物，對目的片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。結(jié)果顯示：天津和滄州（圖2）兩地的轉(zhuǎn)基因楊樹植株基因組DNA 中均能擴(kuò)增出與預(yù)期片段長度相符的PCR 產(chǎn)物。初步證明AhDREB1外源基因依舊穩(wěn)定存在于轉(zhuǎn)基因植株當(dāng)中。

圖2 轉(zhuǎn)基因毛白楊穩(wěn)定性檢測Fig.2 Stability test of transgenic Populus tomentosa

2.2 轉(zhuǎn)基因毛白楊對根際可培養(yǎng)微生物種群數(shù)量的影響

對天津轉(zhuǎn)基因毛白楊株系T12、T46、T 轉(zhuǎn)和非轉(zhuǎn)基因毛白楊的根際土壤微生物（細(xì)菌、放線菌、真菌）進(jìn)行連續(xù)3 個月的計(jì)數(shù)監(jiān)測（表2），不同株系毛白楊的根際微生物種群數(shù)量變化趨勢一致，不同微生物的數(shù)量都呈現(xiàn)增長趨勢，猜測可能和季節(jié)變化相關(guān)。細(xì)菌、放線菌、真菌的群落數(shù)量隨時(shí)間變化存在差異，但轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因毛白楊之間根際土壤微生物的菌落數(shù)量沒有顯著差異。這一結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因毛白楊對土壤中可培養(yǎng)的微生物（細(xì)菌、放線菌、真菌）數(shù)量沒有造成顯著影響。

表2 天津?qū)嶒?yàn)田根際土壤可培養(yǎng)微生物統(tǒng)計(jì)（平均菌落數(shù)）Table 2 Statistics of soil culturable microorganisms in Tianjin trial plots

2.3 外源基因以及抗性水平轉(zhuǎn)移情況

2.3.1 土壤外源基因以及抗性基因檢測 提取兩地轉(zhuǎn)基因楊樹植株根際土壤DNA（圖3），使用原核生物16S rDNA 通用引物和外源基因特異性引物以及NPTⅡ基因引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（圖4～6），結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)基因毛白楊植株根際土壤DNA 提取質(zhì)量良好，但并未擴(kuò)增出與外源基因預(yù)期目的片段長度相符的擴(kuò)增產(chǎn)物，初步斷定天津和滄州兩地均沒有外源基因以及抗性基因的轉(zhuǎn)移。

圖3 根際土壤DNAFig.3 Rhizosphere soil DNA

圖4 根際土壤DNA 質(zhì)量檢測Fig.4 DNA quality detection of rhizosphere soil

2.3.2 土壤抗性微生物檢測 對轉(zhuǎn)基因楊樹植株根際土壤中微生物用卡那霉素進(jìn)行篩選。天津土壤樣本共篩選出28 株抗性細(xì)菌、18 株抗性真菌、15 株抗性放線菌；滄州土壤樣本篩選出23 株抗性細(xì)菌、16 株抗性真菌、11 株抗性放線菌。以篩選出抗性菌株（細(xì)菌、真菌、放線菌）DNA 為模板，PCR 檢測外源基因。結(jié)果（圖7～8）顯示：轉(zhuǎn)基因毛白楊根際土壤中的抗性微生物DNA 中，沒有擴(kuò)增出外源基因片段長度相符的PCR 產(chǎn)物，初步判斷外源基因沒有轉(zhuǎn)移到根際微生物中。

圖7 抗性真菌（部分）外源基因檢測Fig.7 Exogenous gene detection of (part) resistant fungi

2.3.3 滄州嫁接苗砧木檢測 采集滄州基地轉(zhuǎn)基因株系砧木根系樣本，提取基因組DNA，使用AhDREB1基因特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，電泳結(jié)果（圖9）顯示：沒有擴(kuò)增出目的片段，外源基因沒有轉(zhuǎn)移到砧木中。

圖9 滄州嫁接苗砧木檢測Fig.9 Root stock detection of grafted seedlings in Cangzhou

2.4 轉(zhuǎn)基因毛白楊枯落物降解情況及外源基因檢測

2020 年11 月和2021 年5 月對轉(zhuǎn)基因毛白楊枯落物中外源基因進(jìn)行檢測，結(jié)果（圖10）表明：天津自根苗與滄州嫁接苗轉(zhuǎn)基因毛白楊不同發(fā)育階段的不同器官，無論是飄落在雜草上，飄落在土表面，還是埋在土里，在2 個月后腐爛的材料里都不能檢測到外源基因。

圖10 轉(zhuǎn)基因毛白楊枯落物外源基因檢測Fig.10 Exogenous gene detection in litter of transgenic Populus tomentosa

2.5 轉(zhuǎn)基因毛白楊葉片化感活性的檢測

利用imageJ 軟件測量不同處理白菜種子的胚根和胚軸長度，結(jié)果（圖11）顯示：加入轉(zhuǎn)基因毛白楊葉粉和非轉(zhuǎn)基因毛白楊葉粉的胚根、胚軸長度均無顯著差異。通過計(jì)算白菜種子胚根、胚軸相對生長量，添加轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因毛白楊葉粉處理的胚根、胚軸生長均受到抑制，胚根生長受抑制情況更嚴(yán)重。通過對比發(fā)現(xiàn)：天津轉(zhuǎn)基因自根苗和滄州轉(zhuǎn)基因嫁接苗葉粉對胚根生長的影響沒有顯著差異，但是胚軸長度有一定差異。本實(shí)驗(yàn)初步斷定轉(zhuǎn)基因毛白楊葉片對白菜種子的抑制與非轉(zhuǎn)基因毛白楊葉片相比差異不明顯，轉(zhuǎn)基因毛白楊不會對環(huán)境中其他植物生長產(chǎn)生額外的抑制，兩地轉(zhuǎn)基因苗葉粉對胚軸生長的差異影響還需進(jìn)一步探索。

圖11 毛白楊葉片化感作用對白菜種子生長的影響Fig.11 Effects of allelopathy of Populus tomentosa leaves on growth of Brassica pekinensis

3 討論

轉(zhuǎn)基因植物中外源基因穩(wěn)定表達(dá)和遺傳是商品化的首要條件。甲基化、基因沉默、共抑制、外界環(huán)境的變化都可能會影響外源基因的穩(wěn)定性。Lu 等通過熒光定量PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，外源基因在實(shí)驗(yàn)室繼代保存9 a 的轉(zhuǎn)AhDREB1基因毛白楊組培苗各器官中均穩(wěn)定表達(dá)[24]。本研究通過對轉(zhuǎn)基因毛白楊葉組織基因組 DNA 進(jìn)行PCR 特異性擴(kuò)增檢測，初步證明經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室14 a 繼代與4 a 田間環(huán)境生長后轉(zhuǎn)AhDREB1基因毛白楊外源基因仍然存在。

圖5 根際土壤外源基因檢測Fig.5 Exogenous gene detection in rhizosphere soil

圖6 根際土壤NPT Ⅱ基因檢測Fig.6 NPT Ⅱ gene detection in rhizosphere soil

土壤是整個生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，土壤微生物是保持土壤生態(tài)系統(tǒng)健康和穩(wěn)定的基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)基因植物可能對土壤微生物產(chǎn)生影響[25]。馬曉星等研究1 年生轉(zhuǎn)基因PeTLP基因‘南林 895’楊株系，朱文旭等研究 8 年生轉(zhuǎn)基因庫安托楊（P.×euramericana ‘Guariento）’，呂秀華等研究轉(zhuǎn)基因銀中楊（P.alba‘Berolinensis）’結(jié)果均顯示轉(zhuǎn)基因植物對其根際土壤微生物主要類群的數(shù)量影響不顯著[26-28]。本實(shí)驗(yàn)對天津不同系號轉(zhuǎn)基因以及非轉(zhuǎn)基因毛白楊根際微生物數(shù)量進(jìn)行連續(xù)3 個月的動態(tài)監(jiān)測，研究結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因毛白楊沒有對實(shí)驗(yàn)地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)造成顯著影響。

外源基因的轉(zhuǎn)移主要包括通過花粉向非轉(zhuǎn)基因或野生近緣植物傳播的垂直轉(zhuǎn)移[29-31]和遺傳物質(zhì)通過枯落物或分泌物等向土壤環(huán)境轉(zhuǎn)移的水平轉(zhuǎn)移[32]。北京林業(yè)大學(xué)呂威等對種植13 年生的轉(zhuǎn)AhDREB1基因三倍體毛白楊T46 進(jìn)行花粉活力檢測以及雜交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明花粉可育性極低，因此，通過花粉傳播水平轉(zhuǎn)移外源基因的可能性也很低[33]。轉(zhuǎn)基因植物凋落的器官、花粉以及分泌物進(jìn)入土壤環(huán)境存在一定的降解周期，在這個階段中，外源基因以及抗性標(biāo)記基因存在轉(zhuǎn)移的可能性。土壤中的微生物也有可能通過轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化、結(jié)合等方式，攝入外源基因甚至抗性基因。外國學(xué)者曾發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因黑芥菜（Brassica nigra(L.) Czern.et Coss.）、油菜（Brassica napusL.）中抗性基因轉(zhuǎn)移到了黑曲霉（Aspergillus nigerv.Tiegh.）中[34]。本研究利用外源基因與抗性基因特異性引物，采用PCR 方法檢測土壤以及抗性微生物DNA，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因毛白楊沒有發(fā)生水平轉(zhuǎn)移。通過對兩地轉(zhuǎn)基因毛白楊不同生長階段的不同器官的田間降解試驗(yàn)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因毛白楊枯落物中的外源基因在自然條件下2 個月后無法被檢測到。

圖8 抗性細(xì)菌放線菌（部分）外源基因檢測Fig.8 Exogenous gene detection (part) resistant bacteria actinomycetes

嫁接是常見的林木培育方式，接穗和砧木之間存在重要的物質(zhì)運(yùn)輸與交流。陳發(fā)毅發(fā)現(xiàn)，部分mRNA 可以在嫁接柑橘（Citrus reticulataBlanco）的砧木和接穗間移動，陳盼飛等利用酶聯(lián)免疫法證實(shí)Bt 毒蛋白可以在同砧嫁接8 年生轉(zhuǎn)基因741 楊（Populus alba× (P.davidiana+P.simonii) ×P.tomen-tosa)的接穗和砧木間運(yùn)輸，陳興浩等研究發(fā)現(xiàn)，在異砧嫁接的轉(zhuǎn)基因歐美楊107 楊（Populus×euramericana cv.'Neva'）中，外源基因的mRNANA不能在砧木和接穗間運(yùn)輸，但是Bt 毒蛋白可以運(yùn)輸[35-37]。所以，也存在外源基因通過轉(zhuǎn)基因接穗進(jìn)入砧木中的可能。本實(shí)驗(yàn)對滄州嫁接苗砧木的檢測，沒有檢測到外源基因。

轉(zhuǎn)基因毛白楊的生理生化特征是否會因?yàn)橥庠椿虿迦攵淖?，使其與非轉(zhuǎn)基因樹種相比，化感作用對環(huán)境中其他植物生長產(chǎn)生更強(qiáng)的影響。孫偉博等通過“三明治”方法研究了三類轉(zhuǎn)基因‘南林895 楊（’Populus deltoides × P.euramericana cv.‘Nanlin 895）’對萵苣（Lactuca sativaLinn.）種子的影響，研究發(fā)現(xiàn)，萵苣種子胚根和胚軸生長并未受到影響[38]。本實(shí)驗(yàn)通過對比不同系號的轉(zhuǎn)基因毛白楊與非轉(zhuǎn)基因毛白楊影響下白菜種子胚軸和胚根的生長長度與相對生長量，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因毛白楊沒有對環(huán)境造成額外的影響。

4 結(jié)論

本研究通過對種植在天津?yàn)I海和河北滄州的4 年生轉(zhuǎn)AhDREB1基因毛白楊3 個株系和非轉(zhuǎn)基因毛白楊株系進(jìn)行研究，獲得對外源基因穩(wěn)定性檢測、外源基因水平轉(zhuǎn)移、根際可培養(yǎng)微生物數(shù)量監(jiān)測以及葉片化感作用等初步結(jié)果，表明無論是自根苗還是嫁接苗，轉(zhuǎn)AhDREB1基因毛白楊都沒有對環(huán)境造成明顯影響。