徐秉歆，王晗 ，裴棟 ，邸多隆 ，王利濤*，魏鑒騰 , *

1.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院（日照 276826）；2.中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所中國科學(xué)院西北特色植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和甘肅省天然藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（蘭州 730000）；3.青島市資源化學(xué)與新材料研究中心（青島 266100）；4.煙臺(tái)中科先進(jìn)材料與綠色化工產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院（煙臺(tái) 264001）

海洋生物活性肽是來源于海洋且具有生物學(xué)活性的一類化合物的總稱，其具有抗炎癥[1]、抑菌、抗腫瘤[2-3]、抗高血壓[4]、抗衰老[5]等生理功能，在食品、藥品等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[6]。魚籽是水產(chǎn)加工副產(chǎn)品，前期研究發(fā)現(xiàn)，魚籽多肽有抗氧化、降血糖等生理活性[7]。其加工過程中殘留有棕褐色色素，嚴(yán)重影響進(jìn)一步開發(fā)，因此，對(duì)魚籽多肽脫色工藝的探究有重要意義[8]。

大孔吸附樹脂是一類有較好吸附性能的有機(jī)高聚物吸附劑，其具有成本低、穩(wěn)定性高、吸附速度快、可重復(fù)使用等[9]優(yōu)點(diǎn)。試驗(yàn)以魚籽多肽為研究對(duì)象，其脫色率和得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，得到優(yōu)選大孔吸附樹脂，并通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)[10]，篩選出最佳脫色工藝條件，為魚籽多肽進(jìn)一步研究與開發(fā)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚籽（山東省青島市南山市場）；康寧Corning 3599 96孔板（美國康寧公司）；鹽酸、氫氧化鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；95%（V/V）乙醇消毒液（山東省利爾康醫(yī)療科技股份有限公司）；Na+732陽離子樹脂、氯717陰離子樹脂、HPD450、LSCAS、MCI、LSA-21、LSA-40、DM-130、LX69B、YWD12G、HPD100、LX68M、LSA-50型樹脂[南京貝斯特生物技術(shù)有限公司、西安藍(lán)曉科技新材料股份有限公司、麥科儀（北京）科技有限公司、上海紫一試劑廠、安徽三星樹脂科技有限公司]；等。

1.2 儀器與設(shè)備

HWS26型電熱恒溫水浴鍋、DHG-940A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；Sartorius BSA224S電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）]；WD-2102A型酶標(biāo)儀（北京六一儀器廠）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大孔吸附樹脂預(yù)處理

分別將13種樹脂用乙醇浸泡并洗滌，至流出液加水無渾濁，再用去離子水洗至無乙醇味，待用[11]。

1.3.2 魚籽多肽脫色率、得率測定

脫色前后多肽上清液，在630 nm波長處測定吸光度，烘干、稱重，按式（1）和（2）計(jì)算脫色率、得率[12]。

式中：A1為脫色前樣品吸光度；A2為脫色后樣品吸光度。

式中：M1為脫色前樣品質(zhì)量；M2為脫色后樣品質(zhì)量。

1.3.3 脫色大孔吸附樹脂種類的篩選

選取預(yù)處理后的樹脂對(duì)魚籽多肽進(jìn)行脫色處理，分別檢測脫色率和得率，篩選出最佳大孔吸附樹脂。

1.3.4 魚籽多肽脫色的單因素試驗(yàn)

分別考察脫色劑用量（2，3，4，5和6 g/g）、脫色溫度（20，30，40，50和60 ℃）、脫色時(shí)間（1，2，4，6和8 h）以及pH（pH 3，5，7，9和13）對(duì)魚籽多肽脫色率和得率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，依據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以魚籽多肽脫色率和得率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)[13]，見表1。將所得數(shù)據(jù)用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行二次多項(xiàng)式擬合及分析。

表1 響應(yīng)面因素與水平設(shè)計(jì)表

2 結(jié)果與討論

2.1 不同大孔吸附樹脂對(duì)魚籽多肽脫色工藝的影響

由圖1可知，在脫色劑用量2 g/g、脫色溫度20 ℃、脫色時(shí)間8 h、pH 5條件下，綜合考慮脫色率與得率，選擇大孔吸附樹脂LSA-50進(jìn)行脫色工藝優(yōu)化。

圖1 不同大孔吸附樹脂對(duì)魚籽多肽脫色工藝的影響

2.2 魚籽多肽脫色工藝單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖2（a）可知，樹脂用量對(duì)脫色工藝有顯著影響，隨著樹脂用量增加，多肽脫色率先迅速增長后逐漸放緩。得率下降，可能是由于樹脂用量增加，比表面積增大，對(duì)多肽吸附能力增大。故用量最佳為4 g/g。由圖2（b）可知，溫度與脫色率變化呈正相關(guān)。但溫度升高，得率先升后降?？赡苁牵簻囟鹊蜁r(shí)，溫度升高，多肽解吸附加快，得率上升；溫度高時(shí)，樹脂溶脹系數(shù)增加，孔徑變大，多肽進(jìn)入，得率下降。故優(yōu)選40 ℃。由圖2（c）可知，脫色率隨時(shí)間延長而增大，2 h后多肽得率開始下降，因此，最優(yōu)時(shí)間選2 h。由圖2（d）可知，多肽脫色率隨pH升高而增大，酸性條件下脫色效果好。得率隨pH升高，先下降后上升。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)多肽料液pH，最佳pH 5。

圖2 各單因素對(duì)魚籽多肽脫色工藝的影響

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

將表2結(jié)果進(jìn)行擬合得回歸方程：脫色率Y1=79.86+3.42A+4.85B+0.82C+3.38D-1.00AB-0.81AC-0.24AD+0.020BC-0.54BD+0.46CD-0.85A2-1.48B2+0.48C2-1.65D2；得率Y2=60.75-5.23A-0.028B+1.99C-8.36D+0.62AB+1.87AC-0.36AD-0.31BC-1.43BD-4.70CD-1.41A2-1.25B2+0.90C2+2.26D2。

2.3.2 響應(yīng)面方差分析結(jié)果

對(duì)表2進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)及方差分析，結(jié)果見表3。Radj2為95.16%和87.96%，表明擬合值與實(shí)際值相關(guān)性好。模型p值小于0.01，有極顯著差異；失擬項(xiàng)p值大于0.05，無顯著差異；變異系數(shù)（C.V.）分別為1.33%和4.15%，說明該模型相關(guān)性較好，模型構(gòu)建合理。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

對(duì)表3分析可知，對(duì)魚籽多肽脫色率有顯著影響（p＜0.05）的因素有A、B、C、D、B2、D2，其中各單因素對(duì)其脫色效果影響的大小順序?yàn)槊撋珪r(shí)間（B）＞樹脂用量（A）＞pH（D）＞脫色溫度（C）。對(duì)魚籽多肽得率有顯著影響（p＜0.05）的因素有A、C、D、CD、D2，其中各單因素對(duì)得率影響的大小順序?yàn)閜H（D）＞樹脂用量（A）＞脫色溫度（C）＞脫色時(shí)間（B）。

表3 響應(yīng)面方差分析結(jié)果

2.3.3 雙因素的交互影響

由圖3（a）可知：脫色溫度和pH選最優(yōu)值，樹脂用量一定，脫色時(shí)間延長，脫色率顯著升高；脫色時(shí)間一定，脫色率隨樹脂用量增加而增大。由圖3（b）可知：脫色溫度和時(shí)間選最優(yōu)值，樹脂用量一定，脫色率隨pH升高而增大；pH一定，脫色率隨樹脂用量增大緩慢升高。由圖3（c）可知：樹脂用量和脫色溫度均選最優(yōu)值，脫色時(shí)間一定，脫色率隨pH增加先增加后趨于平緩；pH一定，脫色時(shí)間增長，脫色率增大。

圖3 脫色率的雙因素交互影響

由圖4（a）可知：脫色溫度和pH選最優(yōu)值，樹脂用量一定，脫色時(shí)間延長，得率先升高后降低；脫色時(shí)間一定，得率隨樹脂用量增加急速上升。由圖4（b）可知：樹脂用量和脫色時(shí)間選最優(yōu)值，脫色溫度一定，得率隨pH增大而上升；pH一定，得率隨溫度升高先升高后降低。

圖4 得率的雙因素交互影響

2.3.4 魚籽多肽最佳脫色工藝條件驗(yàn)證

綜上所述，大孔吸附樹脂LSA-50對(duì)魚籽多肽脫色最優(yōu)工藝條件：樹脂用量4.94 g/g，脫色時(shí)間2 h，脫色溫度55 ℃，pH 4。在此條件下，多肽理論脫色率為80.07%，理論得率為77.98%。驗(yàn)證結(jié)果顯示，脫色率為80.20%，得率為77.05%。由此可見，脫色率和得率的預(yù)測值與理論值相近，說明構(gòu)建的模型合理，脫色工藝可行。

3 結(jié)論

以魚籽多肽為研究對(duì)象，最優(yōu)脫色大孔吸附樹脂LSA-50對(duì)應(yīng)的最佳脫色工藝條件：樹脂用量4.94 g/g，脫色時(shí)間2 h，脫色溫度55 ℃，pH 4。在此條件下，脫色率為80.20%，得率為77.05%。該工藝對(duì)魚籽多肽脫色效果較好，為魚籽多肽進(jìn)一步研究、開發(fā)提供技術(shù)支持。