謝克英 ，劉冠慧*，錢志偉，石明生，岳麗敏，喬寶營(yíng)

1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院（邯鄲 056038）；2.河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院食品工程學(xué)院（鄭州 451450）

桑葚含有糖、蛋白質(zhì)、維生素等營(yíng)養(yǎng)元素[1]和多糖、黃酮、花色苷、生物堿[2]等多種功能活性成分，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值。成熟桑葚質(zhì)地柔嫩，不耐貯運(yùn)，易腐爛變質(zhì)，難以滿足市場(chǎng)需求。近年來(lái)果桑發(fā)展迅速，果實(shí)采摘、銷售不及時(shí)造成大量損失。將桑葚進(jìn)行加工是提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值的有效方法，常見(jiàn)的加工產(chǎn)品有果酒[3]、果汁[4]、果醬[5]等。桑葚酒保留桑葚果實(shí)中黃酮、多酚、花色苷、生物堿等生物活性物質(zhì)，受到廣泛關(guān)注[6-8]。生產(chǎn)中提高桑葚酒發(fā)酵速度，縮短發(fā)酵時(shí)間，從而提高設(shè)備利用率，加快桑葚處理速度，可以有效緩解桑葚不易貯藏的難題。發(fā)酵過(guò)程中菌種選擇和繁殖條件都可以影響發(fā)酵速度。酵母菌在釀酒過(guò)程中利用糖、氨基酸、無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)酸、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長(zhǎng)、繁殖和代謝，將糖轉(zhuǎn)化成乙醇。這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)中氮元素是關(guān)鍵物質(zhì)之一，酵母菌能夠直接利用的氮主要有游離α-氨基酸態(tài)氮、小分子肽和游離銨離子，稱為酵母可同化氮。研究發(fā)現(xiàn)葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中添加可同化氮可以顯著提高葡萄酒發(fā)酵速度和乙醇產(chǎn)量[9]。添加可同化氮對(duì)葡萄酒發(fā)酵影響的研究較多，桑葚釀酒過(guò)程中添加可同化氮也有相關(guān)報(bào)道[10]，但添加可同化氮對(duì)桑葚酒發(fā)酵的影響尚未見(jiàn)系統(tǒng)的研究報(bào)道。試驗(yàn)以桑葚原漿為原料，通過(guò)添加不同類型氮源提高可同化氮含量，測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中的理化指標(biāo)，研究可同化氮類型對(duì)桑葚酒發(fā)酵的影響，為桑葚酒生產(chǎn)中補(bǔ)加可同化氮提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葚原漿（5月份采摘新鮮成熟桑葚，采摘后迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，于-20 ℃保存）；釀酒酵母（活性干酵母，La Bayanus，法國(guó)Oenofrance公司）。

果膠酶、偏重亞硫酸鉀、山梨酸鉀（煙臺(tái)帝伯仕有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；EX31生物顯微鏡[舜宇光學(xué)科技（集團(tuán)）有限公司]；pH計(jì)（上海雷磁儀器有限公司）；離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)有限公司）；破壁機(jī)（山東九陽(yáng)小家電有限公司）；GC7900氣相色譜儀（天美科技有限公司）；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭（美國(guó)Supelco公司）；7890B-5977A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GCMS，安捷倫科技有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

桑葚酒釀造工藝流程：桑葚解凍、去梗、清洗、晾干，破壁機(jī)打漿，桑葚原漿按照13 g/100 g添加蔗糖，按照120 mg/kg和30 mg/kg分別加入偏重亞硫酸鉀和果膠酶，按照0.02%接種活性干酵母。將勻漿分裝到15個(gè)1 L三角瓶中，每瓶裝500 g處理后的桑葚原漿。三角瓶用棉塞封口，發(fā)酵溫度為21 ℃，還原糖含量基本保持不變時(shí)，加入320 mg/kg偏重亞硫酸鉀和200 mg/kg的山梨酸終止發(fā)酵。

試驗(yàn)設(shè)添加硫酸銨、谷氨酸、色氨酸、丙氨酸、不添加（CK）5個(gè)處理，可同化氮添加量為150 mg N/kg。

1.4 測(cè)定方法

發(fā)酵過(guò)程中酵母菌數(shù)量采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法，還原糖含量采用DNS法，可同化氮含量采用甲醛值法。

乙醇含量采用氣相色譜法[11]，乙醇含量測(cè)定采用ZKAT FFAP（30 m×0.25 mm×0.25 μm）毛細(xì)管色譜柱。載氣為氮?dú)?，流? mL/min，空氣流量380 mL/min，氫氣流量30 mL/min。色譜柱初溫45 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升至50 ℃，保持5 min，以20 ℃/min升至230 ℃，保持2 min；分流比25︰1，進(jìn)樣口溫度250 ℃，F(xiàn)ID溫度280 ℃，尾吹氣氮?dú)饬髁?0 mL/min，進(jìn)樣量1 μL。

樣品中高級(jí)醇包括異丙醇、異丁醇、正戊醇、異戊醇、β-苯乙醇，采用頂空固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法（HS-GC-MS）進(jìn)行測(cè)定，參考李智慧等[12]的方法，略有改動(dòng)。處理?xiàng)l件：向20 mL頂空瓶中加入20 μL 210 mg/L的2-辛醇內(nèi)標(biāo)、3 g NaCl、轉(zhuǎn)子和10 mL發(fā)酵液，使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，用PTFE墊密封，并置于磁力攪拌器上，在350 r/min條件下攪拌，在45 ℃下預(yù)熱10 min，吸附30 min。250 ℃解吸4 min，用于GC-MS測(cè)定。

氣相色譜條件：安捷倫GC7890B氣相色譜儀，安捷倫DB-WAX毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。色譜柱初溫40 ℃，保持2 min，以6 ℃/min升至230 ℃，穩(wěn)定1 min，以20 ℃/min升至230 ℃，穩(wěn)定2 min；載氣為氦氣，不分流。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；檢測(cè)器溫度250 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z30~400。

2 結(jié)果與分析

2.1 可同化氮類型對(duì)酵母菌數(shù)量的影響

酵母菌生長(zhǎng)過(guò)程需要氮源，當(dāng)發(fā)酵液氮源含量較低時(shí)添加氮源有利于酵母菌繁殖[13]。發(fā)酵初期較高的糖濃度不利于酵母生長(zhǎng)，酵母需要一個(gè)適應(yīng)時(shí)期。結(jié)果表明發(fā)酵的第1天酵母菌數(shù)量各處理處于較低水平，差異不顯著。發(fā)酵前3 d，各處理的酵母菌數(shù)量迅速增加，其中以添加硫酸銨處理酵母菌數(shù)量最高，達(dá)到2.83×108個(gè)/mL，添加丙氨酸、色氨酸處理酵母菌數(shù)量低于硫酸銨處理，達(dá)到2.38×108個(gè)/mL，添加谷氨酸和對(duì)照處理酵母菌最低，分別為2.18×108個(gè)/mL和2.12×108個(gè)/mL。第2天酵母菌數(shù)量各處理增加最多，說(shuō)明酵母菌此時(shí)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，這與胡永正[3]研究結(jié)果一致。第3天后添加硫酸銨處理酵母菌數(shù)量不變，其他處理緩慢提高，但增加速度慢，說(shuō)明添加硫酸銨處理酵母菌生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，其他各處理酵母菌數(shù)量繼續(xù)提高，但增速顯著低于前3 d。隨后各處理酵母菌數(shù)量基本保持不變。酵母發(fā)酵過(guò)程中添加可同化氮可以提高酵母生長(zhǎng)速率，但酵母菌對(duì)不同氮源利用有選擇性[14]，試驗(yàn)結(jié)果表明其優(yōu)先利用硫酸銨態(tài)氮源，其次為丙氨酸、色氨酸類氮源，對(duì)谷氨酸利用較低（圖1）。

圖1 可同化氮類型對(duì)酵母菌數(shù)量的影響

2.2 可同化氮類型對(duì)還原糖利用的影響

桑葚汁發(fā)酵過(guò)程中，酵母菌將發(fā)酵液中糖轉(zhuǎn)化成乙醇，還原糖含量降低，還原糖含量受酵母菌數(shù)量影響。還原糖為發(fā)酵過(guò)程提供能量和碳源，還原糖含量可以作為發(fā)酵進(jìn)程的指標(biāo)。第1天還原糖含量添加硫酸銨處理降低最大，低于200 mg/L，與其他處理差異顯著。第1天對(duì)照和添加其他氮源處理還原糖降低緩慢，高濃度還原糖產(chǎn)生較高滲透壓，抑制酵母菌的生長(zhǎng)，因此酵母菌含量較低[15]，從而影響還原糖轉(zhuǎn)化。第1天以后，添加硫酸銨處理還原糖含量降低量最大，顯著高于其他添加處理。添加谷氨酸和對(duì)照處理還原糖含量降低量最小，添加丙氨酸和色氨酸處理還原糖含量降低量居于中間。添加硫酸銨處理在發(fā)酵第4天后還原糖含量低于5 mg/L，對(duì)照和添加其他氮源處理第5天后還原糖含量低于5 mg/L。各處理間的變化趨勢(shì)與酵母菌數(shù)量變化的趨勢(shì)相關(guān)（圖2）。

圖2 可同化氮類型對(duì)還原糖質(zhì)量濃度的影響

2.3 可同化氮類型對(duì)可同化氮利用的影響

酵母生長(zhǎng)過(guò)程中可以利用游離氨基酸和銨離子等可同化氮源，對(duì)不同的氮源利用有選擇性。發(fā)酵前3 d，可同化氮含量大幅度下降至最低點(diǎn)；隨后可同化氮含量趨于穩(wěn)定。添加硫酸銨處理，可同化氮含量顯著降低，其他處理和對(duì)照差異不顯著。酵母數(shù)量進(jìn)入穩(wěn)定期后，可同化氮含量開始保持穩(wěn)定（圖3）。發(fā)酵液添加氨基酸后，氨基酸被酵母吸收，然后合成作為細(xì)胞骨架的各種蛋白質(zhì)和酶類[16]。不同氨基酸吸收、合成不同，葡萄酒釀造過(guò)程中研究發(fā)現(xiàn)丙氨酸、色氨酸先被迅速消耗，后面又生成，谷氨酸迅速消耗后，后面不再生成[17]。不同葡萄汁氨基酸含量差異大，酵母種類不同，發(fā)酵條件不同都會(huì)影響到酵母對(duì)氮源的吸收和生成[18-19]。桑葚和葡萄汁中氨基酸含量與組成不同。因此，試驗(yàn)結(jié)果中添加谷氨酸處理雖然酵母菌數(shù)量和還原糖含量與添加丙氨酸、色氨酸差異顯著，但可同化氮含量和添加丙氨酸、色氨酸差異不顯著。

圖3 可同化氮類型對(duì)可同化氮利用的影響

2.4 可同化氮類型對(duì)乙醇生成量的影響

添加硫酸銨處理第3天后乙醇生成量顯著高于其他處理，第5天后可達(dá)12.89%。添加丙氨酸、色氨酸處理從第5天后高于對(duì)照處理和添加谷氨酸處理。添加谷氨酸處理和對(duì)照乙醇生成量無(wú)差異（圖4）。張斌等[20]研究發(fā)現(xiàn)荔枝酒發(fā)酵前添加谷氨酸或谷氨酸和精氨酸的混合氨基酸可以明顯提高發(fā)酵速率，促進(jìn)酵母生長(zhǎng)、增大乙醇產(chǎn)率。商玉薈等[21]研究發(fā)現(xiàn)荔枝酒發(fā)酵前添加不同種類與濃度的氨基酸可以加快可溶性固形物的消耗速率，提高總醇類含量。黃酒發(fā)酵添加不同氨基酸的研究結(jié)果表明添加谷氨酸對(duì)乙醇產(chǎn)量無(wú)顯著影響。不同試驗(yàn)結(jié)果可能與發(fā)酵條件、菌種、發(fā)酵原料中氨基酸含量不同有關(guān)[12]。

圖4 可同化氮類型對(duì)乙醇生產(chǎn)量的影響

2.5 可同化氮類型對(duì)高級(jí)醇的影響

果酒釀造過(guò)程中通過(guò)支鏈氨基酸分解以及糖代謝合成途徑都可以產(chǎn)生各種高級(jí)醇[22]。高級(jí)醇本身構(gòu)成果酒的風(fēng)味，與乙酸等酸反應(yīng)生成酯類也影響果酒風(fēng)味，含量低果酒風(fēng)味寡淡，含量過(guò)高辛辣刺激感重，容易致醉（俗稱上頭）。高級(jí)醇中含量最高的是異丁醇和異戊醇[23]，果酒內(nèi)高級(jí)醇含量最好不要超過(guò)400 mg/L[24]。通過(guò)敲除支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因，可有效降低釀酒酵母中高級(jí)醇的生成量[25]。試驗(yàn)結(jié)果表明不同可同化氮添加處理影響高級(jí)醇的生成，高級(jí)醇類型中異丁醇和異戊醇含量高，丙醇和苯乙醇含量較低。添加硫酸銨處理顯著降低丙醇、異丁醇、異戊醇和苯乙醇含量，添加谷基酸處理高級(jí)醇含量與對(duì)照無(wú)差異，不同氨基酸添加間丙醇、苯乙醇含量差異不顯著。添加丙氨酸和色氨酸處理與谷氨酸處理和對(duì)照處理異丁醇和異戊醇含量差異顯著（表1）。孫時(shí)光等[26]研究發(fā)現(xiàn)添加丙氨酸、精氨酸和磷酸氫二銨后可以顯著降低桑葚酒高級(jí)醇含量，谷氨酸效果不明顯，試驗(yàn)結(jié)果與之相似。李智慧等[12]研究可同化氮素對(duì)黃酒酵母產(chǎn)高級(jí)醇的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氯化銨等無(wú)機(jī)氮素降低高級(jí)醇的效果最好，添加苯丙氨酸產(chǎn)生更多高級(jí)醇，添加谷氨酸可以降低高級(jí)醇含量，原因與黃酒中氨基酸組成和發(fā)酵采用酵母差異有關(guān)。商玉薈等[21]在荔枝酒中添加不同氨基酸的研究結(jié)果表明，在中高質(zhì)量濃度的精氨酸與谷氨酰胺處理之后，正丙醇的含量有著較明顯增加，而丙氨酸處理則沒(méi)有明顯變化，不同氨基酸對(duì)高級(jí)醇影響不同。

表1 可同化氮類型對(duì)高級(jí)醇的影響 單位：mg/L

3 結(jié)論

桑葚酒發(fā)酵前，添加150 mg N/L不同類型可同化氮后，硫酸銨能促進(jìn)酵母生長(zhǎng)，加快還原糖消耗，提高可同化氮的消耗，提高乙醇產(chǎn)量，降低高級(jí)醇含量。丙氨酸和色氨酸能夠促進(jìn)酵母生長(zhǎng)，加快還原糖消耗，但對(duì)可同化氮消耗影響不顯著，提高乙醇含量和降低高級(jí)醇含量效果低于硫酸銨處理。添加谷氨酸對(duì)酵母生長(zhǎng)、還原糖消耗、乙醇產(chǎn)量和高級(jí)醇含量均無(wú)影響。酵母可同化氮類型影響桑葚酒發(fā)酵，添加硫酸銨有利于桑葚酒生產(chǎn)。