馮玉蘭，羅威，孫家美，馬關(guān)浩，石書駿，魏玉梅*

西北民族大學(xué)（蘭州 730030）

藜麥（Chenopodium quinoaWilld）是藜科藜屬植物，原產(chǎn)于南美洲的安第斯山區(qū)和玻利維亞地區(qū)[1]。藜麥蛋白的氨基酸含量達(dá)15%[2-3]，且其氨基酸比例接近聯(lián)合國糧農(nóng)組織推薦的理想蛋白比例，藜麥蛋白的生物學(xué)價值和牛奶相當(dāng)[4-5]，具有抗氧化[6]、降低膽固醇、抗癌癥[7]等生物活性。藜麥蛋白還具有易于吸收，不易過敏[8]的優(yōu)點(diǎn)，因此藜麥可作為一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白來源[9]。關(guān)于藜麥蛋白分離提取的方法，常用的有堿溶酸沉法[10]、酶法、鹽法等。超聲波[11]可以破壞掉植物的細(xì)胞壁及細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)的各種物質(zhì)溶出，從而增加蛋白溶出率。因此，采用超聲輔助堿法提取藜麥蛋白，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法對藜麥蛋白提取工藝進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 設(shè)備器材

AL204電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；RHP-100高速多功能粉碎機(jī)（永康市榮浩工貿(mào)有限公司）；JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；H1850醫(yī)用離心機(jī)（長沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；V-1100D可見分光光度計（上海美普達(dá)儀器有限公司）；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州市億能實(shí)驗(yàn)儀器廠）；DF-101S-2L分體式磁力攪拌機(jī)（南北儀器有限公司）；NKB3000微量凱氏定氮儀（上海祎鴻分析儀器有限公司）；pH試紙；各類試管燒杯等。

1.1.2 材料及試劑

藜麥種子；氫氧化鈉、鹽酸、無水乙醇、石油醚、85%磷酸溶液（西北民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)室）；牛血清蛋白（賽默飛生物有限公司）；G-250考馬斯亮藍(lán)（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）。試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 藜麥蛋白的提取工藝

優(yōu)質(zhì)藜麥種子→粉碎→0.180 mm（80目）過篩→石油醚脫脂→干燥→蒸餾水調(diào)漿→NaOH調(diào)節(jié)pH→超聲波粉碎輔助→過濾上清液→蛋白提取液→測定蛋白質(zhì)含量

稱取一定質(zhì)量的藜麥種子，用溫水清洗除去皂苷，在45 ℃環(huán)境中干燥，用粉碎機(jī)中粉碎，過篩后獲得藜麥粉，此過程中適當(dāng)減小物料的粒徑有利于蛋白的溶出，因此可采用小孔徑目篩。取適量藜麥粉用石油醚進(jìn)行脫脂操作，為保險起見可進(jìn)行2次脫脂，每次脫脂時間不得低于4 h，脫脂完成后放在通風(fēng)廚里揮發(fā)24 h，獲得干燥的脫脂藜麥粉。

利用電子分析天平準(zhǔn)確稱取0.5 g脫脂藜麥粉于試管內(nèi)，按照一定料液比加入蒸餾水，NaOH溶液（1 mol/L）調(diào)節(jié)混合溶液的pH，置于恒溫水浴鍋中振蕩攪拌，保持恒定溫度加熱，可同步利用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)按照一定功率超聲指定的時間，浸提達(dá)到設(shè)置時間后取出，將離心機(jī)轉(zhuǎn)速設(shè)定為3 500 r/min，放入試管離心15 min，分離上清液，取上清液通過G-250考馬斯亮藍(lán)法測定其中的蛋白質(zhì)含量，為避免因溶液中蛋白濃度過大導(dǎo)致超出測試范圍的情況發(fā)生，可先取少量提取液以蒸餾水稀釋10倍后再進(jìn)行測試，通過計算得出超聲波輔助堿法提取藜麥蛋白提取率。

1.2.2 藜麥蛋白提取率的計算

脫脂藜麥粉的總蛋白的含量通常采用凱氏定氮法[12]進(jìn)行測定，通過G-250考馬斯亮藍(lán)染色法[13]測定提取液中的蛋白質(zhì)含量。蛋白提取率按式（1）計算。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計

參考王棐等[14]的試驗(yàn)方法，使用水浴加熱作為整個反應(yīng)過程的外部環(huán)境，將溫度設(shè)置為45 ℃，提取時間設(shè)置為3 h，維持這2個條件不變。研究超聲功率、提取pH、料液比和超聲時間4個因素對藜麥蛋白提取率的影響。選擇：超聲功率的梯度分別為200，280，360和440 W；提取pH分別為8，9，10和11；料液比分別為1︰10，1︰15，1︰20和1︰25 g/mL；超聲時間分別為10，20，30和40 min。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

對單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析后，設(shè)計因素A（超聲功率）、B（pH）、C（料液比）、D（超聲時間）為自變量，以藜麥蛋白提取率作為響應(yīng)值，設(shè)計四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)（共29組），各個因素水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平

1.2.5 統(tǒng)計處理

試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)利用Excel軟件和Design Expert軟件進(jìn)行處理和分析，得出回歸性方程和模型。其中：回歸性方程的顯著性分析判斷標(biāo)準(zhǔn)為p＞0.05，變化不顯著；p＜0.05，變化顯著；p＜0.001，判定為極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明各個單因素在超聲功率280 W、浸提pH 10、料液比1∶20（g/mL）、超聲時間30 min的工藝參數(shù)下，藜麥蛋白的提取率最高。且該試驗(yàn)最佳條件獨(dú)立，互相不影響。

2.1.1 超聲功率對藜麥蛋白提取的影響

由圖1可知，隨著超聲功率升高，藜麥蛋白提取率開始增高，超聲功率280 W時提取率達(dá)到峰值，但是繼續(xù)增加超聲功率后提取率反而開始下降。出現(xiàn)這種情況的原因可能是超聲功率過大，破壞了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)開始部分分解及變性，繼而致使藜麥蛋白提取率降低。因此，最佳提取功率為280 W，且差異性顯著。

圖1 超聲功率對藜麥蛋白提取的影響

2.1.2 pH對藜麥蛋白提取的影響

由圖2可知，初始藜麥蛋白提取率和pH呈現(xiàn)一個正相關(guān)趨勢，在pH 10時達(dá)到峰值，隨后開始降低，可能是因?yàn)檫^高的堿度抑制蛋白活性，使得藜麥蛋白不容易分離出來導(dǎo)致提取率降低。藜麥蛋白的最佳提取條件為pH 10，且差異性顯著。

圖2 提取pH對藜麥蛋白提取的影響

2.1.3 料液比對藜麥蛋白提取的影響

由圖3可知，伴隨提取液比例增大，藜麥蛋白的提取率也隨之升高，總體呈現(xiàn)正相關(guān)趨勢。在1︰20（g/mL）時達(dá)到峰值，繼續(xù)增大提取液比例，藜麥蛋白提取率反而開始下降。這可能是因?yàn)殡S著提取溶劑增加，藜麥蛋白充分浸出，使得蛋白分子開始更多地與水結(jié)合；達(dá)到峰值后，溶劑增多，藜麥蛋白過度膨脹，與水的結(jié)合力隨之降低。1︰20和1︰25（g/mL）差異性不顯著，綜合考慮，最佳料液比選擇1︰20（g/mL）。

圖3 料液比對藜麥蛋白提取的影響

2.1.4 超聲時間對藜麥蛋白提取的影響

由圖4可知，隨著超聲時間增加，藜麥蛋白提取率呈現(xiàn)先升高再下降的波動趨勢，在30 min時藜麥蛋白提取率達(dá)到最高值，隨后開始下降。原因可能是超聲時間過長會導(dǎo)致藜麥蛋白的結(jié)構(gòu)會遭到破壞，讓蛋白分子暴露更多的疏水基團(tuán)，使蛋白分子在溶劑中的溶解度下降，提取率降低。30和40 min差異性不顯著，以試驗(yàn)結(jié)果來看，應(yīng)該選取超聲時間30 min作為藜麥蛋白提取的最佳條件。

圖4 超聲時間對藜麥蛋白提取的影響

2.2 藜麥蛋白超聲輔助堿提法工藝優(yōu)化

根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計（BBD）的試驗(yàn)原理，以單因素試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，把對藜麥蛋白的提取率起主要影響的4個因素作為要考察的因素，把響應(yīng)值即藜麥蛋白的提取率作為考察指標(biāo)，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，使用Design-Expert軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，求出數(shù)學(xué)模型，進(jìn)而分析得到最佳的提取條件。超聲輔助堿提藜麥蛋白的試驗(yàn)的結(jié)果見表2。

對表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，將各個試驗(yàn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Design-Expert軟件，得到藜麥蛋白提取率與超聲功率（A）、pH（B）、料液比（C）和超聲時間（D）相關(guān)性的回歸方程。根據(jù)分析回歸方程可得出試驗(yàn)?zāi)Ｐ褪欠窨煽俊?/p>

表2 超聲輔助堿法提取藜麥蛋白響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

2.2.1 回歸方程及方差分析結(jié)果

回歸模型方差分析見表3，回歸方程為Y=66.84+0.47A+0.099B+10.66C+1.09D-1.00AB-1.97AC-0.12AD+0.35BC-1.16BD+1.55CD+1.69A2-0.94B2-5.77C2-0.62D2。

由表3可知，模型F值為13.24，p值小于0.000 1，表示差異顯著。回歸決定系數(shù)R2=0.930＞0.9，模型相關(guān)性好，Radj2=0.910，表示91%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)可用模型解釋，而失擬項(xiàng)p=0.070 8＞0.05，不顯著，表示模型的擬合程度良好，可以比較真實(shí)反映實(shí)際情況，該模型可靠。綜合考量F值及p值，經(jīng)過比較得出各因素對藜麥蛋白提取率的影響順序按大小排列為C＞D＞A＞B，即料液比＞超聲時間＞超聲功率＞pH。

表3 回歸模型方差分析表

2.2.2 響應(yīng)面分析與條件優(yōu)化

由圖5響應(yīng)面三維圖反映各因素對藜麥蛋白提取率的影響，影響力大小主要通過曲面的弧度進(jìn)行體現(xiàn)。曲面圖的傾斜程度越高，表示此兩因素的交互作用對提取率的影響越顯著，反之則越不顯著。

圖5 兩因素交互作用對藜麥蛋白提取率的響應(yīng)面曲面圖

觀察響應(yīng)面三維圖像，可以直觀看出兩變量交互作用的CD曲面最陡，藜麥蛋白的提取率與料液比和超聲時間二者都呈現(xiàn)正相關(guān)的趨勢，而交互作用AD、BD的曲面陡峭程度最小，提取率相對二者變化不明顯。按影響的大小順序?yàn)榍鍯D＞曲面AC＞曲面BC＞曲面AB＞曲面AD＞曲面BD，即料液比和超聲時間、超聲功率和料液比、pH和料液比、超聲功率和pH，每2個因素間交互作用對提取率影響都很明顯，但是超聲功率和超聲時間、pH和超聲時間的交互作用對于藜麥蛋白的提取影響較弱。

通過Design-Expert軟件預(yù)測得到超聲輔助藜麥蛋白堿提法的最佳工藝參數(shù)預(yù)測結(jié)果：超聲功率200 W、pH 9.205、料液比1∶25（g/mL）、提取時間40 min，蛋白提取率的最高預(yù)測值為77.083%。在實(shí)際操作中，為使操作方便，將試驗(yàn)參數(shù)調(diào)整為超聲功率200 W、pH 9.5、料液比1∶25（g/mL）、提取時間40 min。在該條件下藜麥蛋白提取率為75.24%，與模型的預(yù)測值出入不大，從側(cè)面驗(yàn)證基于響應(yīng)面模型所得的優(yōu)化提取參數(shù)可靠。

3 結(jié)論

相比于其他提取方法，超聲波提取法具有操作簡便、試驗(yàn)操作過程安全節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)。Liang等[15]發(fā)現(xiàn)利用超聲波能夠提高大豆蛋白溶出率，提高大豆蛋白提取率，且與單純的堿法提取相比，提取效率提高11.6%。楊立賓等[16]研究利用超聲波輔助提取松仁蛋白的工藝，相對傳統(tǒng)提取方法，該方法可大幅節(jié)省提取時間，也明顯提高松仁蛋白提取率。試驗(yàn)利用超聲波輔助堿法提取藜麥蛋白，結(jié)果表明，該處理方式確實(shí)能提高藜麥蛋白提取率，達(dá)到75.24%。藜麥蛋白提取的最佳參數(shù)為超聲功率200 W、pH 9.5，料液比1∶25 g/mL、提取時間40 min。4種因素對藜麥蛋白的提取率影響大小次序?yàn)榱弦罕龋境晻r間＞超聲功率＞pH。