王娜 王記圓 李瀟 張宇 劉文波 林春花 繆衛(wèi)國

摘? 要：暹羅炭疽菌（）是一種重要的病原真菌，是我國橡膠樹炭疽病（ leaf disease， CLD）的田間優(yōu)勢病原種，也是熱帶、亞熱帶地區(qū)許多其他農(nóng)林作物炭疽病的主要病原種。脂滴是細(xì)胞的中性脂，存在于絕大多數(shù)真核細(xì)胞中，是細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的主要貯存形式。脂滴在細(xì)胞內(nèi)可以參與脂質(zhì)代謝、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白降解和信號(hào)傳導(dǎo)等。包被蛋白（perilipin）是脂滴表面最豐富的脂質(zhì)相關(guān)蛋白，主要存在于動(dòng)植物體內(nèi)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)脂滴代謝起著重要的調(diào)控作用。Cap20是暹羅炭疽菌中包被蛋白的同源蛋白，前期證實(shí)Cap20是一個(gè)致病相關(guān)蛋白，它參與了炭疽菌附著胞膨壓形成、脂滴數(shù)量和致病性。了解其互作蛋白和互作的生物學(xué)意義可能為深入了解脂滴包被蛋白參與的致病分子機(jī)制具有重要意義。課題組前期通過酵母雙雜交技術(shù)在暹羅炭疽菌cDNA文庫中篩選到一個(gè)與Cap20互作的候選蛋白乙酸激酶，本研究克隆了該乙酸激酶的編碼基因，并進(jìn)行了蛋白結(jié)構(gòu)和同源蛋白聚類分析。結(jié)果表明，乙酸激酶編碼基因的DNA大小為1312 bp，包括一個(gè)內(nèi)含子，cDNA為1248 bp，編碼415個(gè)氨基酸，含有一個(gè)乙酸激酶結(jié)構(gòu)域，命名為CsAck。然后構(gòu)建含6×his標(biāo)簽的原核表達(dá)載體PET32a-CsAck，利用其和含GST標(biāo)簽的pGEX6p-1-Cap20（先前構(gòu)建）進(jìn)行蛋白表達(dá)和純化，獲得含有6×His標(biāo)簽的融合蛋白CsAck和含有GST標(biāo)簽的Cap20。通過Pull down驗(yàn)證了Cap20和CsAck蛋白之間的體外互作。最后，構(gòu)建含有潮霉素轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)載體PXY203-CsAck-S和含有氯嘧磺隆抗性基因的表達(dá)載體pCB1532-GFP-Cap20，將它們共同轉(zhuǎn)化暹羅炭疽菌野生型菌株獲得轉(zhuǎn)化子。Co-IP（Co-immunoprecipitation）的結(jié)果證實(shí)Cap20和CsAck在暹羅炭疽菌中可以相互作用。該結(jié)果證實(shí)了致病性相關(guān)蛋白Cap20和乙酸激酶CsAck在體外和體內(nèi)均可發(fā)生蛋白互作，可為進(jìn)一步研究Cap20在暹羅炭疽菌中的致病功能和調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：暹羅炭疽菌;Cap20;CsAck;蛋白互作驗(yàn)證;Pull down;CO-IP中圖分類號(hào)：S31 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Lipid Droplet Coating Protein Cap20 and Acetate Kinase CsAck Interaction Verification in

WANG Na， WANG Jiyuan， LI Xiao， ZHANG Yu， LIU Wenbo， LIN Chunhua， MIAO Weiguo

College of Plant Protection， Hainan University / Key Laboratory of Green Prevention and Control of Tropical Plant Diseases and Pests， Ministry of Education， Haikou， Hainan 570228， China

is an important pathogenic fungus， which is the dominant pathogenic species of leaf disease （CLD） in the field of rubber trees in China. And it is also the main pathogen of anthracnose of many other agricultural and forestry crops in tropical and subtropical regions. Lipid droplets， the neutral lipids of cells， are present in most eukaryotic cells and are the storage form of intracellular triglycerides. Lipid droplets can be involved in lipid metabolism， membrane transport， protein degradation and signaling in the cell. Perilipin is the most abundant lipid-associated protein on the surfaces of lipid droplets， mainly existed in animals and plants， and plays an important role in regulate lipid metabolism. Cap20 is a homologue of perilipin in genus. It was previ-ously confirmed that Cap20 is a pathogenic associated protein that involved in the formation of turgor pressure of ap-pressorium， the number of lipid droplets and the pathogenicity of genus. Understanding the interaction proteins of Cap20 and the biological significance of the interactions may be important for gaining insight into how Cap20 is involved in the molecular mechanisms of pathogenesis. In the previous stage， a candidate protein， acetate kinase， which interacts with Cap20， was screened from the cDNA library of by yeast two-hybrid technology. In this study， the full length of acetate kinase coding gene was cloned， and the protein structure and phylogenetic analy-sis were analyzed firstly. The results showed that the acetate kinase coding gene had a DNA size of 1312 bp including an intron， a cDNA of 1248 bp encoding 415 amino acids and containing an acetate kinase structural domain， which was named as CsAck. Then， the prokaryotic expression vector PET32a-CsAck with 6×His tag was constructed， and the fu-sion protein CsAck with a 6×His tag and Cap20 with a GST tag was obtained by using it and the GST-tag-containing pGEX6p-1-Cap20 （previously constructed） for protein expression and purification. The interaction between the Cap20 and CsAck proteins was verified by Pull down expriments. Finally， the expression vectors PXY203-CsAck-S containing the hygromycin transferase gene and the pCB1532-GFP-Cap20 with the sulfonylurea resistant gene were constructed and co-transformed into wild-type strain to obtain transformants. The results of Co-IP （Co-Im-munoprecipitation） confirmed that Cap20 and CsAck could interact with each other in . The results confirm that the pathogenesis-related protein Cap20 interacts with the acetate kinase CsAck both and ， which could lay the foundation for further studies on the pathogenic function and regulatory mechanism of Cap20 in .

; Cap20; CsAck; protein interaction verification; Pull down; CO-IP

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.03.017

在橡膠生長過程中炭疽病是危害葉片較為嚴(yán)重的病害之一，從橡膠樹的小苗、幼樹直至成齡的橡膠樹均可受到炭疽病的危害，通過侵染橡膠樹葉柄、嫩葉、嫩梢、膠果等部位，造成幼葉剝落、嫩梢回枯、結(jié)果后枯萎等癥狀。炭疽病嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致橡膠樹的重復(fù)落葉、嫩梢返枯，甚至推遲橡膠的開割時(shí)間，影響天然橡膠的生產(chǎn)。引起橡膠樹炭疽病的病原炭疽菌有許多，主要是膠胞炭疽復(fù)合群（species complex）和尖孢炭疽復(fù)合群（ species complex），其中主要的優(yōu)勢病原種是膠胞炭疽復(fù)合群中的暹羅炭疽菌（）。該病原菌也是熱帶、亞熱帶地區(qū)各種農(nóng)林作物炭疽病的主要病原種類，可侵染橡膠樹、可可、咖啡、芒果、木瓜、柑橘等許多熱帶作物。目前暹羅炭疽菌的相關(guān)致病分子機(jī)制研究較少。

大多數(shù)病原真菌在侵染寄主植物的過程中會(huì)形成一種侵染結(jié)構(gòu)——附著胞，附著胞的形成對(duì)于病原真菌穿透寄主表皮促進(jìn)真菌侵染具有重要作用。脂滴（lipid droplet）是細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的主要貯存形式，它能隨細(xì)胞骨架移動(dòng)并與其他細(xì)胞器相互作用，在脂質(zhì)代謝、存儲(chǔ)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白降解和信號(hào)傳遞等方面發(fā)揮重要作用。病原真菌附著胞成熟過程中，脂質(zhì)體可進(jìn)入附著胞被甘油三酯脂肪酶降解，促進(jìn)膨壓的形成。脂滴包被蛋白緊密地結(jié)合在脂滴的表面，是脂滴的主要結(jié)構(gòu)蛋白。在哺乳動(dòng)物中，脂滴包被蛋白（perilipin）是脂滴表面的一種可磷酸化蛋白，受蛋白激酶A的調(diào)節(jié)，在脂滴表面形成一層生理“屏障”，具有調(diào)控脂解和促進(jìn)脂滴融合的雙重調(diào)控作用，對(duì)脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)具有重要意義。在病原真菌中，已證實(shí)了脂滴包被蛋白與附著胞膨壓和致病性關(guān)系密切。如昆蟲致病真菌綠僵菌（）的MPL1（perilipin同源蛋白）是附著胞膨壓形成的重要因子，MPL1基因缺失會(huì)引起綠僵菌分生孢子和菌絲中的脂滴數(shù)量減少，附著胞膨壓降低，從而通過影響附著胞的穿透能力來影響病原菌的致病能力。本實(shí)驗(yàn)室前期證實(shí)了Cap20是炭疽菌的脂滴包被蛋白，它與炭疽菌附著胞膨壓形成相關(guān)，Cap20的缺失導(dǎo)致附著胞膨壓降低從而影響了炭疽菌的致病性。但病原真菌中脂滴包被蛋白的調(diào)控分子機(jī)制仍不清楚。

實(shí)驗(yàn)室前期利用酵母雙雜技術(shù)從酵母文庫中篩選到16個(gè)與Cap20互作的候選蛋白，并證實(shí)了蛋白激酶催化亞基（protein kinase A catalytic subunit）PKAC1與Cap20間的互作關(guān)系和基因表達(dá)正調(diào)控關(guān)系。在所篩選的候選互作蛋白中，還含有乙酸激酶（acetate kinase），乙酸激酶是磷酸轉(zhuǎn)移酶超家族中的一個(gè)成員，存在于許多生物體內(nèi)，在生物體的碳源代謝和能量代謝中發(fā)揮了重要的作用，其主要是在乙酰磷酸和二磷酸腺苷（ADP）生成乙酸和腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）的可逆反應(yīng)中起著催化作用。乙酸激酶是否參與脂滴包被蛋白狀態(tài)或功能調(diào)控仍未知。本研究基于前期研究結(jié)果，利用Co-IP技術(shù)與Pull down技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證Cap20與CsAck在炭疽菌菌體內(nèi)和菌體外的互作關(guān)系，為下一步開展炭疽菌脂滴包被蛋白Cap20的功能及調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

?材料

1.1.1? 供試菌株及質(zhì)粒? 暹羅炭疽菌（）野生型菌株WT-HN08、載體PET32a（含6×His標(biāo)簽）、載體PXY203（S-tag標(biāo)簽）由本實(shí)驗(yàn)室保存。載體PMD-18T（TaKaRa），Cap20表達(dá)載體pGEX6p-1-Cap20和pCB1532- GFP-Cap20為實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建。

1.1.2? 試劑? 限制性內(nèi)切酶、T連接酶（TaKaRa），普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒（北京，天根），質(zhì)粒小量提取試劑盒（美國，Omega），GST、His、GFP、S-tag單克隆一抗以及熒光二抗（Abcam），IPTG（Thermo scientific），考馬斯亮藍(lán)染色液（Biosharp），His Sepharose beads、GFP-Trap Sepharose bead和PMSF（苯甲基磺酰氟）（上海，碧云天），引物合成和測序由華大基因公司完成。

? 方法

1.2.1 ?炭疽菌乙酸激酶CsAck編碼基因的克隆和分析? 設(shè)計(jì)引物W-Ack-F（5-ATGAAGATTATC CTGGCCATC-3）和W-Ack-R（5-TCAAGACCA AAGCTCACTCTTC-3），參照廖小淼等的方法進(jìn)行CsAck編碼基因的克隆與結(jié)構(gòu)域分析（simple modular architecture research tool， SMART; http：//smart.embl-heidelberg.de/smart/set_ mode.cgi）。下載同源蛋白利用MEGA軟件進(jìn)行蛋白序列的聚類分析。

1.2.2? Pull down驗(yàn)證Cap20和CsAck體外互作 ?（1）His-CsAck融合蛋白的表達(dá)和純化。設(shè)計(jì)引物His-Ack-F（5-CGCGGATCCGCGATGAAG ATTATCCTGGCCATC-3）和His-Ack-R（5-CC GGAATTCCGGTCAAGACCAAAGCTCACTCTTC-3），以cDNA為模板擴(kuò)增CsAck序列，將該序列利用HⅠ和RⅠ雙酶切，參照廖小淼等的方法構(gòu)建原核表達(dá)載體PET32a-CsAck。

參照廖小淼等的方法表達(dá)融合蛋白，設(shè)置不同的IPTG濃度（0、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L）誘導(dǎo)表達(dá)，提取總蛋白開展SDS-PAGE和Western blot檢測。剩余的上清液蛋白利用His Sepharose beads進(jìn)行純化。

（2）Pull down體外驗(yàn)證Cap20與CsAck互作。利用帶有GST標(biāo)簽的融合表達(dá)載體pGEX6p- 1-Cap20獲得含有GST-Cap20的蛋白上清液，將其與融合蛋白His-CsAck（已親和固化在His Sepharose beads上）共孵育5～8 h，孵育結(jié)束后對(duì)His Sepharose beads進(jìn)行清洗，進(jìn)行Western blot檢測。

1.2.3? Co-IP驗(yàn)證Cap20和CsAck體內(nèi)互作? （1）載體構(gòu)建、共轉(zhuǎn)化和篩選。設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)Ⅰ的引物Co-Ack-F（5-ACTCACTATAG GGCGAATTGGGTACTCAAATTGGTTATGAAGATTATCCTGGCCATC-3）和Co-Ack-R（5-TT CGAATTTAGCAGCAGCGGTTTCTTTTCAAGACCAAAGCTCACTCTTC-3），擴(kuò)增CsAck基因的cDNA序列，用Ⅰ酶切載體PXY203，將CsAck擴(kuò)增片段和PXY203載體共轉(zhuǎn)酵母菌XK-125，經(jīng)過SD-Trp平板篩選驗(yàn)證后獲得的陽性克隆轉(zhuǎn)到大腸桿菌DH5α中進(jìn)行擴(kuò)繁，PCR、測序驗(yàn)證正確后，獲得帶有S-tag標(biāo)簽的重組表達(dá)載體PXY203-CsAck-S。

利用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，將質(zhì)粒pCB1532-GFP-Cap20和PXY203-CsAck-S共轉(zhuǎn)暹羅炭疽菌野生型菌株WT-HN08的原生質(zhì)體，設(shè)置陰性對(duì)照（質(zhì)粒pCB1532-GFP和PXY203-CsAck-S共轉(zhuǎn)WT-HN08原生質(zhì)體），先用DCM（含100 μg/mL氯嘧磺?。┏鹾Y，再用PDS（含200?μg/mL潮霉素）復(fù)篩獲得轉(zhuǎn)化子，經(jīng)PCR驗(yàn)證正確后，獲得成功轉(zhuǎn)入2個(gè)表達(dá)載體的炭疽菌轉(zhuǎn)化子。

（2）Co-IP體內(nèi)驗(yàn)證Cap20和CsAck互作。提取炭疽菌轉(zhuǎn)化子的總蛋白，取20?μL GFP-Trap Sepharose beads于1.5?mL 離心管中，用1×PBS緩沖液平衡3次，加入800 μL炭疽菌轉(zhuǎn)化子總蛋白與GFP-Trap Sepharose在4℃條件下孵育4～ 6?h，用1×PBS緩沖液對(duì)GFP-Trap Sepharose清洗3次，棄上清。加入蛋白電泳上樣Buffer沸水浴7～10 min，隨后用于Western blot檢測。

? 結(jié)果與分析

? 暹羅炭疽菌乙酸激酶編碼基因的克隆和分析

擴(kuò)增獲得的乙酸激酶CsAck編碼基因DNA長為1312 bp，cDNA長為1248 bp（圖1A），序列包含一個(gè)內(nèi)含子，編碼415個(gè)氨基酸（登錄號(hào)

為MZ733402）。其蛋白序列含有一個(gè)乙酸激酶結(jié)構(gòu)域（圖1B），通過蛋白序列的聚類分析（MEGA），該蛋白與炭疽菌的乙酸激酶蛋白成功聚為一類（圖1C）。根據(jù)NAKASHIMADA等對(duì)克雷伯氏菌的研究中發(fā)現(xiàn)乙酸激酶基因的功能，沿用前人命名規(guī)則，將暹羅炭疽菌乙酸激酶命名為CsAck。

驗(yàn)證和體外互作

2.2.1 ?His-CsAck和GST-Cap20融合表達(dá)載體的構(gòu)建? 利用引物對(duì)His-Ack-F/R擴(kuò)增得到CsAck基因的cDNA片段經(jīng)TDNA連接酶連接至載體PET32a上，得到重組載體PET32a-CsAck，通過測序和雙酶切（HⅠ、RⅠ）證實(shí)目的片段插入正確（圖2）。

2.2.2? His-CsAck融合蛋白的表達(dá)和純化? PET32a-CsAck融合蛋白表達(dá)載體分別經(jīng)過不同濃度IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)過SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色后，在預(yù)期蛋白大小為65?kDa（CsAck分子量約為45?kDa，6×His標(biāo)簽蛋白分子量約為20?kDa）處可見一條蛋白條帶（圖3A）?？偟鞍滓航?jīng)過His單抗孵育后，Western blot結(jié)果顯示該條帶為目的融合蛋白His-CsAck（圖3B）。誘導(dǎo)表達(dá)的上清液蛋白用His Sepharose beads純化，用于下一步的試驗(yàn)。

2.2.3? Pull down體外驗(yàn)證Cap20與CsAck互作? 為了驗(yàn)證His-CsAck與GST-Cap20間的蛋白互作，

提取含有GST-Cap20融合蛋白的菌體上清液蛋白，將其分別與結(jié)合了His-CsAck和6×His的His Sepharose beads共孵育，Western blot結(jié)果（圖4）表明陰性對(duì)照6×His不能與GST-Cap20結(jié)合（泳道2），而His-CsAck能夠與GST-Cap20在體外特異性結(jié)合（泳道3），說明CsAck與Cap20存在體外的相互作用。

驗(yàn)證和體內(nèi)互作

2.3.1? 載體構(gòu)建、共轉(zhuǎn)化和篩選? 上述方法構(gòu)建的PXY203-CsAck-S驗(yàn)證正確后，將其與質(zhì)粒pCB1532-GFP-Cap20共轉(zhuǎn)暹羅炭疽菌WT-HN08的原生質(zhì)體后，經(jīng)過抗性藥劑篩選和PCR驗(yàn)證后，最終獲得含有2個(gè)重組質(zhì)粒的炭疽菌轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子的炭疽菌總蛋白分別進(jìn)行GFP-Cap20和CsAck-S蛋白的Western blot檢測，2種蛋白在相應(yīng)位置均有條帶，表明融合蛋白GFP-Cap20（圖5A）和CsAck-S（圖5B）在炭疽菌內(nèi)均成功表達(dá)。

2.3.2? Co-IP體內(nèi)驗(yàn)證Cap20和CsAck互作? 提取含有融合蛋白GFP-Cap20和CsAck-S的炭疽菌轉(zhuǎn)化子總蛋白，利用GFP-Trap Sepharose beads沉淀Cap20及與其互作的蛋白，Western blot結(jié)果（圖5C）顯示陰性對(duì)照GFP不能與CsAck-S結(jié)合，而GFP-Cap20能夠與CsAck-S特異性結(jié)合，表明Cap20與CsAck在暹羅炭疽菌菌體內(nèi)存在互作關(guān)系。

討論

暹羅炭疽菌是橡膠樹及許多熱帶和亞熱帶作物炭疽病的主要病原種，探究暹羅炭疽菌的致病分子機(jī)制具有重要意義。附著胞是炭疽菌侵染寄主植物的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，附著胞能否正常形成以及附著胞是否能形成具有一定穿透力的膨壓，對(duì)炭疽菌的致病力有重要的影響。在附著胞成熟過程中，脂滴可進(jìn)入附著胞被甘油三酯脂肪酶降解，促進(jìn)膨壓的形成。脂滴包被蛋白是病原真菌脂滴表面的結(jié)構(gòu)蛋白，綠僵菌中的MLP1和炭疽菌的Cap20均可參與附著胞膨壓的形成，影響附著胞的穿透能力，從而影響病原菌的致病性。但脂滴包被蛋白是如何影響附著胞膨壓，如何參與致病的分子機(jī)制仍未知。

在哺乳動(dòng)物中脂滴包被蛋白（perilipin）在脂滴表面可以形成一層生理“屏障”，其磷酸化狀態(tài)會(huì)受到蛋白激酶A的調(diào)節(jié)，從而影響脂滴脂解和脂滴融合，這個(gè)過程對(duì)脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)室前期利用酵母雙雜技術(shù)，從炭疽菌cDNA酵母文庫中篩選獲得脂滴包被蛋白Cap20的候選互作蛋白，也證實(shí)了炭疽菌脂滴包被蛋白Cap20與蛋白激酶A催化亞基PKAC1互作，且表達(dá)具有協(xié)同性，推測炭疽菌中脂滴包被蛋白Cap20和哺乳動(dòng)物中的脂滴包被蛋白類似，均受到蛋白激酶A的雙向調(diào)控脂解過程。但脂滴包被蛋白是否與其他蛋白酶互作，是否受到其他酶的調(diào)控并不知。

乙酸激酶是磷酸轉(zhuǎn)移酶超家族中的成員，已知其在生物體內(nèi)參與ATP和乙酸的形成，參與生物體的碳源代謝和能量代謝等。乙酸激酶與蛋白水解活性有關(guān)，對(duì)細(xì)菌的生長具有重要作用。乙酸激酶的生理功能在細(xì)菌中的研究較多，但未見在真菌中的相關(guān)報(bào)道。本研究在前期所獲得的Cap20候選互作蛋白中有乙酸激酶，本文進(jìn)一步克隆了炭疽菌中乙酸激酶編碼基因CsAck，且通過Pull down技術(shù)和Co-IP技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證了脂滴包被蛋白Cap20和CsAck間的互作。乙酸激酶參與能量代謝同時(shí)也能控制乙酸的合成，而乙酸能改善真菌的環(huán)境。脂滴包被蛋白與乙酸激酶的互作，可能是其本身在炭疽菌致病過程中需要大量的能量以及特殊的生理生化環(huán)境，而這些條件的滿足能有利于炭疽菌的致病。該研究結(jié)果可推測脂滴包被蛋白Cap20可能不僅僅受到蛋白激酶A的調(diào)控，還受到乙酸激酶CsAck的調(diào)控，亦或乙酸激酶在行使功能時(shí)需要脂滴包被蛋白的參與。本研究為進(jìn)一步分析Cap20和CsAck互作的生物學(xué)意義，探究Cap20和CsAck的生物學(xué)功能，以及為研究暹羅炭疽菌等病原真菌的致病分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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