黃盼玲，肖穎梅，李泊村，李和梅，蔣怡萱，夏星，3*

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200；2.桂林市人民醫(yī)院，廣西 桂林 541000；3.廣西高校中藥藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530200）

糖尿病是糖代謝紊亂導(dǎo)致血糖偏高的代謝性疾病。據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟（The International Diabetes Federation，IDF）公布數(shù)據(jù)顯示，每年約有百萬人死于糖尿病及其并發(fā)癥，且將近一半為60歲以下人群[1]。糖尿病患者的胰島素（insulin，INS）缺乏或者機(jī)體產(chǎn)生胰島素抵抗，在葡萄糖攝入后形成血糖不能迅速被利用，引起體內(nèi)血糖堆積，對(duì)機(jī)體各個(gè)器官造成慢性損傷。因此調(diào)節(jié)血糖的攝入和促進(jìn)血糖分解代謝，是改善患者高血糖的關(guān)鍵途徑。α-葡萄糖苷酶是位于小腸刷狀緣細(xì)胞微絨毛的水解酶，參與并調(diào)節(jié)糖代謝過程，在Ⅱ型糖尿病的前期階段，糖耐量異常時(shí)，抑制α-葡萄糖苷酶活性可減少餐后機(jī)體對(duì)食物糖分的攝取，抑制餐后血糖異常升高[2]，對(duì)糖尿病的防治有積極效果[3]。

羅漢果是葫蘆科植物羅漢果 [Siraitia grosvenorii（Swingle）]的干燥果實(shí)[4]。分布于我國(guó)廣西、廣東、湖南等地，性涼、味甘，具有清肺利咽、化痰止咳的功效，是常見的藥食同源食品[5]。現(xiàn)代人飲食結(jié)構(gòu)中碳水?dāng)z入過多，易引起肥胖、糖尿病等一系列健康問題。羅漢果甜味來源羅漢果皂苷，因具有甜度高、無毒性、低卡路里、不引起血糖升高等特點(diǎn)成為理想的非糖類替代甜味劑[6]。研究表明，羅漢果皂苷能顯著降低四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠空腹血糖（fasting blood-glucose，F(xiàn)BG），調(diào)節(jié)糖尿病小鼠餐后血糖異常[7]。并且羅漢果皂苷能調(diào)節(jié)妊娠糖尿病大鼠血糖血脂紊亂，緩解胰腺組織氧化應(yīng)激損傷[8]。何超文等[9]還發(fā)現(xiàn)羅漢果苷在體外對(duì)α-葡萄糖苷酶活性具有直接的抑制作用，表明羅漢果皂苷可能抑制腸道α-葡萄糖苷酶活力，減緩腸道對(duì)葡萄糖的吸收，起到降低餐后血糖的作用。前期研究證實(shí)羅漢果皂苷對(duì)Caco2細(xì)胞的α-葡萄糖苷酶活性具有顯著抑制作用，并與劑量呈正相關(guān)[10]。但是羅漢果皂苷在體內(nèi)是否有與體外一致的抑制α-葡萄糖苷酶作用，且其對(duì)血糖控制相關(guān)內(nèi)分泌激素的影響尚不明確，為進(jìn)一步探明羅漢果皂苷對(duì)動(dòng)物血糖代謝的影響，本研究觀察了羅漢果皂苷對(duì)正常小鼠和糖尿病小鼠α-葡萄糖苷酶的作用，以及其對(duì)重要的血糖調(diào)節(jié)因子INS和胰高血糖素樣肽的影響，為羅漢果及其衍生產(chǎn)品的應(yīng)用與開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

羅漢果皂苷：桂林實(shí)力科技有限責(zé)任公司；胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）ELISA試劑盒、INS ELISA試劑盒：武漢華美生物工程有限公司；鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）、4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl α-D-glucopyranoside，PNPG）：美國(guó)SIGMA-ALDRICH公司；鹽酸吡格列酮片：四川迪康科技藥業(yè)股份有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒：碧云天生物技術(shù)研究所；高脂飼料（基礎(chǔ)飼料74.5%、膽固醇1%、蛋白粉5%、蔗糖10%、豬油9%、膽酸鈉0.5%）：廣西中醫(yī)藥研究院制。

三諾安穩(wěn)（調(diào)碼型）血糖測(cè)試儀：長(zhǎng)沙三諾生物傳感技術(shù)股份有限公司；SQP型電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；HVE-50高壓滅菌鍋：日本HiraYama公司；Aqualix-5純水儀：默克密理博實(shí)驗(yàn)室設(shè)備（上海）有限公司；EPOCH全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀：美國(guó)伯騰儀器有限公司；UV-1800紫外分光光度計(jì)：日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠，全雄，18 g～22 g，4周齡左右：湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004，No.43004700009905。飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 糖尿病模型建立

雄性KM小鼠以高脂飼料連續(xù)喂養(yǎng)4周。第29天，小鼠禁食不禁水12h后，腹腔注射檸檬酸緩沖液配制的STZ100mg/kg造模，另取正常小鼠采用相同方式注射溶劑檸檬酸鹽緩沖液，造模后第3天禁食12 h，測(cè)定FBG，血糖大于11 mmol/L的小鼠即認(rèn)為造模成功[11]。

1.4 分組和處理

為觀察羅漢果皂苷對(duì)糖尿病模型動(dòng)物腸道α-葡萄糖苷酶活性、血糖和血糖調(diào)節(jié)因子的影響，取造模成功的小鼠隨機(jī)分為模型組、吡格列酮組（2.57 mg/kg）、羅漢果皂苷高劑量組（200.00 mg/kg）、羅漢果皂苷低劑量組（100.00 mg/kg），取正常小鼠設(shè)置為空白組?？瞻捉M和模型組灌胃蒸餾水，其余各組灌胃相應(yīng)藥物，每日1次，同時(shí)糖尿病造模動(dòng)物持續(xù)以高脂飼料喂養(yǎng)，連續(xù)3周，每周測(cè)量一次FBG。為觀察羅漢果皂苷對(duì)正常動(dòng)物腸道α-葡萄糖苷酶活性的影響，正常動(dòng)物服用羅漢果皂苷高劑量（200.00 mg/kg）及羅漢果皂苷低劑量（100.00 mg/kg），灌胃1周。

1.5 口服糖耐量（oral glucose tolerance test，OGTT）檢測(cè)

小鼠灌胃第23天，測(cè)量小鼠FBG值作為0時(shí)血糖，再對(duì)小鼠灌胃給予淀粉作為糖源（2 g/kg），測(cè)量灌胃后30、60、120 min時(shí)血糖值，以灌胃后時(shí)間為橫坐標(biāo)，血糖值為縱坐標(biāo)繪制血糖曲線，并用GraphPad軟件計(jì)算血糖曲線所覆蓋的面積，為血糖曲線下面積（area under curve，AUC），代表動(dòng)物的糖耐量水平[12]。

1.6 腸組織α-葡萄糖苷酶活性檢測(cè)

按照1.4的分組處理，為觀察羅漢果皂苷對(duì)正常小鼠腸道α-葡萄糖苷酶的影響，灌胃1周后處死羅漢果皂苷高劑量組和低劑量組的正常小鼠，取小腸組織。為觀察在糖尿病模型中羅漢果皂苷對(duì)α-葡萄糖苷酶的影響，連續(xù)灌胃羅漢果皂苷3周，觀察到對(duì)血糖的控制效果后，處死空白組小鼠、模型組小鼠、吡格列酮組小鼠、羅漢果皂苷高、低劑量組小鼠，取小腸組織檢測(cè)α-葡萄糖苷酶活力。具體做法為末次灌胃后1 h，脫頸椎處死小鼠，取小腸中段腸組織剪碎，按體重質(zhì)量比 1∶9加入預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）緩沖液勻漿，4℃ 3 000 r/min離心15 min，取上清，依照試劑盒說明，進(jìn)行α-葡萄糖苷酶活性測(cè)定。小腸酶提取液與PBS緩沖液、PNPG混合，置于37℃溫育箱中反應(yīng)15 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)405 nm處OD值，酶活力單位定義為37℃下每反應(yīng)15 min，吸光度值增加1即為1個(gè)活力單位（U），根據(jù)以下公式計(jì)算單位蛋白量下的α-葡萄糖苷酶活力。

1.7 血漿INS與GLP-1水平檢測(cè)

為觀察在糖尿病模型中羅漢果皂苷對(duì)關(guān)鍵的血糖調(diào)節(jié)因子的影響，末次灌胃1h后，對(duì)空白組小鼠、模型組小鼠、吡格列酮組小鼠、羅漢果皂苷高、低劑量組小鼠進(jìn)行眼眶后靜脈叢取血，肝素抗凝，4℃、3 500 r/min離心15 min取上清，進(jìn)行INS與GLP-1水平檢測(cè)，分別按照小鼠INS酶聯(lián)免疫法試劑盒及小鼠GLP-1酶聯(lián)免疫試劑盒要求進(jìn)行檢測(cè)操作，用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量OD值，計(jì)算出血漿中INS和GLP-1的濃度。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用GraphPad Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用t檢驗(yàn)方法比較組間差異，P<0.05表明差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅漢果皂苷對(duì)糖尿病小鼠FBG水平的影響

羅漢果皂苷對(duì)糖尿病小鼠FBG的影響結(jié)果見表1。

表1 羅漢果皂苷對(duì)糖尿病小鼠FBG的影響（±s，n=10）Table 1 Effect of mogroside on FBG in diabetic mice（±s，n=10）

表1 羅漢果皂苷對(duì)糖尿病小鼠FBG的影響（±s，n=10）Table 1 Effect of mogroside on FBG in diabetic mice（±s，n=10）

注：與空白組比較，##表示差異極顯著（P<0.01）；與模型組比較，**表示差異極顯著（P<0.01）。

組別FBG/（mmol/L）0 d 7 d 14 d 21 d空白組 5.08±1.19 4.23±1.03 4.76±0.89 5.52±1.20模型組 18.07±3.48##23.87±2.72##20.58±5.28##22.22±2.15##吡格列酮組 18.03±3.99 23.17±3.84 19.57±8.06 15.58±5.32**羅漢果皂苷高劑量組17.94±3.87 22.04±6.70 23.01±2.80 16.87±4.20**羅漢果皂苷低劑量組17.99±3.82 23.99±4.59 23.20±2.85 16.23±6.04**

由表1可知，首次給藥前，糖尿病造模小鼠的FBG皆高于11 mmol/L，并出現(xiàn)進(jìn)食飲水增加、排尿增加、體重下降、精神萎靡、皮毛晦暗的現(xiàn)象，表明糖尿病模型比較穩(wěn)定。給藥期間，吡格列酮組小鼠在治療14 d后FBG開始出現(xiàn)下降趨勢(shì)。21 d時(shí)，吡格列酮組、羅漢果皂苷高、低劑量組小鼠FBG值較模型組極顯著下降（P<0.01），吡格列酮組雖然低于羅漢果皂苷組FBG，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明羅漢果皂苷能改善糖尿病小鼠糖代謝能力，具有顯著的降血糖作用。

2.2 羅漢果皂苷對(duì)糖尿病小鼠腸道α-葡萄糖苷酶活力的影響

羅漢果皂苷對(duì)糖尿病小鼠腸道α-葡萄糖苷酶活力的影響結(jié)果見表2。

表2 羅漢果皂苷對(duì)小鼠腸道α-葡萄糖苷酶活力的影響（±s，n=10）Table 2 Effect of mogroside on intestinal α-glucosidase activity in mice（±s，n=10）

表2 羅漢果皂苷對(duì)小鼠腸道α-葡萄糖苷酶活力的影響（±s，n=10）Table 2 Effect of mogroside on intestinal α-glucosidase activity in mice（±s，n=10）

注：與空白組比較，##表示差異極顯著（P<0.01）；與模型組比較，*表示差異顯著（P<0.05），**表示差異極顯著（P<0.01）。

α-葡萄糖苷酶活力/（U/mg protein）正常小鼠 空白組 76.70±15.21羅漢果皂苷高劑量組 200.00 69.28±23.02羅漢果皂苷低劑量組 100.00 79.12±15.07糖尿病小鼠 模型組 175.39±30.20##吡格列酮組 2.57 207.59±28.09羅漢果皂苷高劑量組 200.00 129.09±30.85**羅漢果皂苷低劑量組 100.00 133.11±44.28*動(dòng)物類型 組別 劑量/（mg/kg）

由表2可知，正常小鼠羅漢果皂苷高、低劑量組的腸道α-葡萄糖苷酶活力與空白組相近，無顯著性差異，表明羅漢果皂苷對(duì)正常小鼠小腸α-葡萄糖苷酶活力無明顯的影響。在糖尿病動(dòng)物中，模型組小鼠腸道中α-葡萄糖苷酶活性極顯著升高（P<0.01），羅漢果皂苷高、低劑量都能下降糖尿病小鼠小腸α-葡萄糖苷酶的活力，與模型組比較有顯著差異（P<0.01，P<0.05），該結(jié)果表明羅漢果皂苷對(duì)糖代謝異常小鼠異常升高的α-葡萄糖苷酶活性有抑制作用。

2.3 羅漢果皂苷對(duì)糖尿病小鼠OGTT的影響

羅漢果皂苷對(duì)糖尿病小鼠OGTT的影響結(jié)果見表3。

表3 羅漢果皂苷對(duì)糖尿病小鼠OGTT的影響（±s，n=10）Table 3 Effect of mogroside on OGTT in diabetic mice（±s，n=10）

表3 羅漢果皂苷對(duì)糖尿病小鼠OGTT的影響（±s，n=10）Table 3 Effect of mogroside on OGTT in diabetic mice（±s，n=10）

注：與空白組比較，##表示差異極顯著（P<0.01）；與模型組比較，*表示差異顯著（P<0.05），**表示差異極顯著（P<0.01）。

血糖值/（mmol/L）AUC/（min·mmol/L）0 min 30 min 60 min 120 min空白組 4.44±1.04 6.07±2.40 4.49±1.01 4.19±1.09 508.65±141.36模型組 19.25±2.65## 22.25±3.78## 23.59±3.43## 22.50±2.93## 2 692.875±213.09##吡格列酮組 10.75±3.29 20.92±5.12 21.03±5.42 16.77±7.84 2 238.45±577.65羅漢果皂苷高劑量組 9.02±3.16** 18.31±6.20 16.62±6.07* 12.82±7.07** 1 817.2±665.52**羅漢果皂苷低劑量組 7.96±4.44** 20.33±5.77 19.15±7.25 14.28±8.00* 2 084.53±770.87*組別

由表3可知，所有小鼠在灌胃淀粉后，血糖水平均增高，在30 min時(shí)空白組與羅漢果皂苷高劑量組小鼠血糖值達(dá)到最高值；60 min時(shí)，空白組與羅漢果皂苷高劑量組血糖值開始下降，與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，P<0.05）。模型組與吡格列酮組的血糖值60 min時(shí)達(dá)到峰值，120 min時(shí)模型組血糖值仍處于較高水平，可見糖尿病小鼠抑制餐后血糖上升的能力較差，吡格列酮組餐后血糖雖有明顯下降，但與模型組比較無顯著性差異（P>0.05）。計(jì)算每組各時(shí)間點(diǎn)血糖值曲線下面積AUC，結(jié)果表明，羅漢果皂苷高、低劑量組AUC較模型組顯著下降（P<0.01，P<0.05）?？梢娊?jīng)羅漢果皂苷干預(yù)后，糖尿病小鼠的餐后血糖調(diào)控能力得到改善。

2.4 羅漢果皂苷對(duì)糖尿病小鼠血漿GLP-1及INS的影響

羅漢果皂苷對(duì)糖尿病小鼠血漿GLP-1及INS的影響結(jié)果見表4。

表4 羅漢果皂苷對(duì)糖尿病小鼠血漿中INS和GLP-1的影響（±s，n=10）Table 4 Effect of mogroside on INS and GLP-1 in diabetic mice（±s，n=10）

表4 羅漢果皂苷對(duì)糖尿病小鼠血漿中INS和GLP-1的影響（±s，n=10）Table 4 Effect of mogroside on INS and GLP-1 in diabetic mice（±s，n=10）

注：與空白組比較，##表示差異極顯著（P<0.01）；與模型組比較，**表示差異極顯著（P<0.01）。

組別INS/（IU/mL）GLP-1/（pg/mL）空白組 17 972.81±2 331.25 85.256±9.624模型組 8 165.63±1 685.39## 64.216±10.383##吡格列酮組 8 964.16±2 241.08 73.016±26.681羅漢果皂苷高劑量組 11 343.17±1 796.10** 93.433±19.374**羅漢果皂苷低劑量組 8 770.42±1 409.37 83.534±7.244**

由表4可知，與空白組比較，糖尿病模型組小鼠血漿INS與GLP-1含量極顯著減少（P<0.01），通過羅漢果皂苷干預(yù)后，與模型組比較，高、低劑量組小鼠血漿中GLP-1極顯著升高（P<0.01），并且高劑量組小鼠血漿中INS水平明顯提高（P<0.01）。說明羅漢果皂苷能促進(jìn)腸道生成GLP-1和INS分泌。

3 討論

α-葡萄糖苷酶能催化小腸內(nèi)的麥芽糖、蔗糖等水解，抑制其活性可減慢碳水化合物分解為葡萄糖的速度[13]。α-葡萄糖苷酶抑制劑（α-glucosidase inhibitor，AGI）主要從干預(yù)糖耐量受損方面調(diào)節(jié)糖代謝，通過減緩餐后血糖上升，減少飲食葡萄糖對(duì)胰腺的刺激，保護(hù)機(jī)體INS敏感性，且不影響基礎(chǔ)血糖，故不會(huì)引起低血糖等副作用[14]。市面上常用α-葡萄糖苷酶抑制劑有阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇等，但也存在一些不足，因其降糖作用單一，常要與其他降糖藥物聯(lián)用，不良反應(yīng)包括胃腸系統(tǒng)紊亂會(huì)出現(xiàn)胃脹、腹脹、腹瀉、胃腸痙攣性疼痛等[15]。研究發(fā)現(xiàn)，從一些天然產(chǎn)物提取的例如黃酮[16]、多糖[17]、皂苷[18]等，具有顯著抑制 α-葡萄糖苷酶作用，是開發(fā)更安全、副作用更低的新型AGI的重要方向。

前期研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的羅漢果皂苷能抑制Caco2細(xì)胞α-葡萄糖苷酶活力，進(jìn)一步開展體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，STZ聯(lián)合高脂飲食造2型糖尿病模型，證明羅漢果皂苷對(duì)正常小鼠α-葡萄糖苷酶活性無明顯抑制作用，卻能抑制糖尿病小鼠α-葡萄糖苷酶活性。對(duì)于糖代謝正常的機(jī)體，腸道α-葡萄糖苷酶活性過低會(huì)影響機(jī)體的正常食物吸收過程，而不影響正常機(jī)體腸道α-葡萄糖苷酶活性的羅漢果皂苷，不會(huì)在進(jìn)食后引起血糖補(bǔ)充。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)糖尿病小鼠OGTT，結(jié)果顯示模型組小鼠進(jìn)食淀粉2 h內(nèi)血糖持續(xù)升高，自身對(duì)高血糖幾乎沒有調(diào)控作用，經(jīng)羅漢果皂苷作用糖尿病小鼠的OGTT顯著降低。研究發(fā)現(xiàn)90 d生長(zhǎng)期羅漢果提取物顯著降低了小鼠血糖應(yīng)答曲線下面積，這與本研究中糖尿病小鼠食用羅漢果皂苷后糖耐量水平得到改善是一致的[19]。研究表明羅漢果皂苷對(duì)餐后血糖的生成有抑制作用。本研究中發(fā)現(xiàn)的羅漢果皂苷直接抑制糖尿病小鼠腸道α-葡萄糖苷酶活力的作用，可能是其改善糖尿病小鼠餐后血糖調(diào)節(jié)能力的直接原因。

研究表明α-葡萄糖苷酶活性降低，導(dǎo)致小腸內(nèi)碳水化合物濃度增加，刺激小腸L細(xì)胞分泌GLP-1，GLP-1是一種腸促胰素分泌劑，能與胰腺β細(xì)胞表面G蛋白偶聯(lián)受體GLP-1R結(jié)合并激活，引起環(huán)磷酸腺苷與細(xì)胞內(nèi)鈣水平升高，刺激葡萄糖依賴性INS釋放[20]。研究表明，STZ聯(lián)合高脂飲食引起糖尿病小鼠INS合成障礙，INS含量降低，在高、低劑量羅漢果皂苷的干預(yù)下，糖尿病小鼠血漿中GLP-1水平隨給藥劑量增大而增大，相應(yīng)的INS水平也逐漸增加。提示羅漢果皂苷有可能通過抑制腸道α-葡萄糖苷酶活性，刺激GLP-1分泌，促進(jìn)INS釋放調(diào)節(jié)機(jī)體血糖。此外，研究表明GLP-1還具有多項(xiàng)調(diào)節(jié)作用，抑制胰島β細(xì)胞凋亡、促進(jìn)胰島β細(xì)胞增殖和新生等[21]。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，羅漢果皂苷能抑制高脂高糖損傷的胰島INS-1細(xì)胞caspase 3凋亡通路的激活[22]。李寶銅等[23]通過羅漢果皂苷干預(yù)改善糖尿病大鼠胰島細(xì)胞變形萎縮，并且增加胰島細(xì)胞數(shù)量。這些藥理作用都有可能與羅漢果皂苷刺激腸道GLP-1分泌有關(guān)，機(jī)制如何還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

研究表明羅漢果皂苷對(duì)高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合STZ所致的糖尿病小鼠具有顯著的降血糖作用。羅漢果皂苷能抑制糖尿病動(dòng)物腸道α-葡萄糖苷酶活性，但不影響正常動(dòng)物腸道α-葡萄糖苷酶活性，能改善糖尿病小鼠OGTT，提高糖尿病小鼠的餐后血糖調(diào)節(jié)能力。此外，羅漢果皂苷能增加內(nèi)源性GLP-1和INS分泌。羅漢果皂苷甜度高，食用后不會(huì)引起血糖升高，并且通過影響腸道α-葡萄糖苷酶活性及GLP-1的分泌，來降低糖尿病動(dòng)物血糖水平。由此可見，羅漢果皂苷用于糖尿病治療的潛力較大，亦有利于應(yīng)用在保健食品的開發(fā)上，后期可通過研究GLP-1分泌相關(guān)途徑進(jìn)一步研究羅漢果皂苷降血糖的作用機(jī)制。