顧玉卿，殷成芮，潘鳳好，糾敏，汪倫記

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023）

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）隸屬于弧菌科（Vibrionaceae）、氣單胞菌屬，革蘭氏陰性菌，是一種人-畜-魚(yú)共患的條件致病菌[1]。嗜水氣單胞菌不僅是魚(yú)類(lèi)病害的主要病原菌，也是水產(chǎn)品中主要的腐敗菌[2]，其可引起魚(yú)類(lèi)的敗血癥，也可引起蟹類(lèi)顫抖病及蛙類(lèi)的紅腿病等[3]。嗜水氣單胞菌也可感染人體，并具有血液侵襲性，病死率33%～70%[4]?，F(xiàn)代漁業(yè)養(yǎng)殖模式的水體溫度和pH值都接近于嗜水氣單胞菌的最適生長(zhǎng)條件，養(yǎng)殖密度較高，魚(yú)類(lèi)很易受損傷，進(jìn)而增加了魚(yú)類(lèi)感染該菌的概率。同時(shí)，由于飼用抗生素的長(zhǎng)期不合理使用致使其出現(xiàn)了嚴(yán)重的耐藥性[5]。自然界中的嗜水氣單胞菌大多是以生物膜的形式存在，生物膜的形成對(duì)其內(nèi)部菌體具有一定的保護(hù)作用，進(jìn)而提高了其耐藥性[6]。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)中草藥及其活性成分在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面預(yù)防細(xì)菌性感染疾病的相關(guān)報(bào)道逐年增加。已有研究表明，黃連[7]、黃芩[8]、秦皮素[9]、和厚樸酚[10]、白藜蘆醇[11]等中草藥及其活性成分對(duì)嗜水氣單胞菌均有抑菌作用，且對(duì)微生物生物膜的形成具有良好的抑制作用[12]。但由于中草藥活性成分可溶性較差，限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用[13]。納米脂質(zhì)體是指粒徑分布在50 nm～1 000 nm的納米球[14]，可以有效傳遞多種分子，提高藥物的水溶性[15]，能夠擴(kuò)大中草藥及其活性成分的應(yīng)用范圍，并降低藥物的不良反應(yīng)[16]。

冬凌草，學(xué)名碎米椏[Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara]，是我國(guó)一種特色中草藥，在我國(guó)分布廣泛。冬凌草甲素是冬凌草各成分中主要的抑菌活性成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)冬凌草甲素具有抗癌性，并具有抑菌、抗氧化和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用[17]。目前關(guān)于冬凌草甲素納米脂質(zhì)體對(duì)嗜水氣單胞菌生物膜的抑制活性研究鮮有報(bào)道。因此，本研究進(jìn)行了冬凌草甲素納米脂質(zhì)體制備，并研究了其對(duì)嗜水氣單胞菌生物膜形成的抑制作用及清除效果，進(jìn)而為其應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖、水產(chǎn)保鮮等方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

嗜水氣單胞菌（A.hydrophila）：河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。菌株保存于專(zhuān)用菌種保藏管中，使用前挑出管中瓷珠，在液體培養(yǎng)基中活化后接種于平板上，28℃培養(yǎng)12 h后挑取單菌落使用。

1.1.2 材料與試劑

大豆卵磷脂：北京索萊寶科技有限公司；膽固醇（純度＞95%）：上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；聚乙烯吡咯烷酮（polyvidone povidone，PVP）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；冬凌草甲素：上海源葉生物科技有限公司；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（nutrient broth，NB）、營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基（nutrient broth agar，NBA）、水解酪蛋白培養(yǎng)基（Mueller-Hinton，MH）：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；0.22 μm微孔濾膜：島津技邇（上海）商貿(mào)有限公司；MTT試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司；5-（4，6-二氯三嗪基） 氨基熒光素 [5-（4，6-dichlorotriazinyl）aminofluorescein，5-DTAF]：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；其他試劑均為分析純。

1.1.3 試驗(yàn)儀器

RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；UV1800PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；H-2050R低溫超速離心機(jī)：湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；JY92-2D超聲細(xì)胞破碎儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；Infinite F50酶標(biāo)儀：瑞士帝肯（Tecan）公司；Leica DM2500熒光正置顯微鏡：萊卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易有限公司；TM3030Plus掃描電鏡：日本日立高新技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化和菌懸液制備

用接種環(huán)挑取供試菌單菌落，接入NB液體培養(yǎng)基中，置于28℃搖床，180 r/min培養(yǎng)20 h至對(duì)數(shù)期。采用比濁法，用無(wú)菌0.9%NaCl溶液調(diào)整細(xì)菌濃度為1×108cfu/mL。

1.2.2 冬凌草甲素對(duì)嗜水氣單胞菌的抑菌活性

采用牛津杯法測(cè)定抑菌活性。試驗(yàn)組冬凌草甲素質(zhì)量濃度分別為5 mg/mL和2.5 mg/mL，對(duì)照組（CK）加入溶劑為甲醇，28℃培養(yǎng)18 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3 冬凌草甲素納米脂質(zhì)體的制備

稱(chēng)取大豆卵磷脂和膽固醇（5∶1，質(zhì)量比）加入適量氯仿中，充分溶解后，加入冬凌草甲素溶液，使其終濃度為500 μg/mL。40℃減壓蒸餾至瓶?jī)?nèi)壁形成均勻脂質(zhì)膜，放入真空干燥箱中，60℃，真空干燥24 h。然后加入質(zhì)量濃度為0.2%PVP表面活性劑和pH7.4磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS），在水浴條件下進(jìn)行超聲處理形成乳濁液。乳濁液進(jìn)行超聲破碎（運(yùn)行 3 s、間隔 3 s、功率 360 W、時(shí)間 20 min）后過(guò) 0.22 μm微孔濾膜，濾液即為制備的500 μg/mL冬凌草甲素納米脂質(zhì)體，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆肹18]。

1.2.4 冬凌草甲素納米脂質(zhì)體對(duì)嗜水氣單胞菌的最小抑菌濃度測(cè)定

采用二倍稀釋法[19]進(jìn)行測(cè)定。接種環(huán)挑取供試菌單菌落接種于無(wú)菌MH培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min培養(yǎng)過(guò)夜（生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期），將菌液濃度調(diào)整為1×105cfu/mL。取菌懸液和供試液，使供試液在MH培養(yǎng) 基 中 的 終 濃 度 為 250、125、62.5、31.25、15.625、7.812 5 μg/mL，分別取200 μL培養(yǎng)液加入96孔板中，同時(shí)設(shè)置不添加供試液的空白對(duì)照組。28℃恒溫條件下培養(yǎng)過(guò)夜后，用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)OD600，確定冬凌草甲素、冬凌草甲素納米脂質(zhì)體的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）值。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 嗜水氣單胞菌產(chǎn)膜能力鑒定

取制備的菌懸液，用接種環(huán)小心劃線(xiàn)于剛果紅平板上，28℃培養(yǎng)過(guò)夜后觀(guān)察供試菌菌落。判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：菌落有金屬光澤，顏色生長(zhǎng)為黑色，即有產(chǎn)膜能力；反之，沒(méi)有產(chǎn)膜能力[19]。

1.2.6 冬凌草甲素納米脂質(zhì)體對(duì)嗜水氣單胞菌生物膜的抑制活性

采用結(jié)晶紫法[20]測(cè)定抑制活性。96孔板每孔中加入200 μLMH培養(yǎng)基和20 μL制備的菌懸液，28℃靜置培養(yǎng)24 h后，吸出孔中的MH培養(yǎng)基，再加入200 μL含冬凌草甲素納米脂質(zhì)體的MH培養(yǎng)基，使其終濃度分別為 250、125、62.5、31.25 μg/mL。同時(shí)以不含冬凌草甲素納米脂質(zhì)體的MH培養(yǎng)基為空白對(duì)照。28℃靜置培養(yǎng)24 h后，吸出每孔的菌液，使用無(wú)菌PBS漂洗3次后，加入200 μL甲醇，對(duì)孔中生物膜進(jìn)行固定，15 min后吸出，自然風(fēng)干，加入200 μL 1%結(jié)晶紫溶液，在常溫25℃下染色20 min，小心沖洗，倒扣晾干，加入200 μL 30%醋酸，振蕩10 s，使用酶標(biāo)儀測(cè)量OD562值，試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.7 冬凌草甲素納米脂質(zhì)體抗嗜水氣單胞菌生物膜的代謝活性

96孔板中，各孔菌液和藥物的添加同1.2.6。28℃靜置培養(yǎng)24 h后按照MTT試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行MTT染色，用酶標(biāo)儀測(cè)量OD570值[20]。試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.8 冬凌草甲素納米脂質(zhì)體對(duì)嗜水氣單胞菌生物膜形成的抑制作用

熒光顯微鏡法[20]：24孔板每孔加入無(wú)菌的2%瓊脂溶液，凝固后，插入1片無(wú)菌蓋玻片（14 mm×14 mm），然后加入2 mL含冬凌草甲素納米脂質(zhì)體的MH培養(yǎng)基，使其終濃度分別為 250、125、62.5、31.25 μg/mL 和15.625 μg/mL，加入20 μL制備的菌懸液。以不含冬凌草甲素納米脂質(zhì)體的MH培養(yǎng)基為空白對(duì)照。28℃靜置培養(yǎng)24 h后，棄掉培養(yǎng)基，0.9%NaCl漂洗3次。加入適量4%多聚甲醛（將蓋玻片覆蓋），對(duì)蓋玻片上生物膜進(jìn)行固定，30 min后用無(wú)菌PBS漂洗3次。加入適量的100 μg/mL 5-DTAF熒光染料（將蓋玻片覆蓋），25℃避光靜置染色2 h，棄掉熒光染料，用無(wú)菌PBS漂洗，熒光顯微鏡觀(guān)察。

掃描電鏡法[20]：生物膜制備方法同上。培養(yǎng)完成后棄掉培養(yǎng)基，無(wú)菌生理鹽水洗滌3次。4℃條件下（避光），加入適量2.5%戊二醛（將蓋玻片覆蓋），靜置過(guò)夜（約12 h），將生物膜固定，隨后用無(wú)菌PBS洗滌3次；依次用不同濃度乙醇脫水，乙醇濃度分別為50%、70%、80%、90%，每次脫水10 min；然后用100%乙醇脫水，脫水20 min后用叔丁醇置換乙醇，共置換兩次。干燥后噴金儀噴金，掃描電鏡觀(guān)察。

1.2.9 冬凌草甲素納米脂質(zhì)體對(duì)嗜水氣單胞菌成熟生物膜的清除作用

熒光顯微鏡法：24孔板每孔加入無(wú)菌的2%瓊脂溶液，凝固后插入1片無(wú)菌蓋玻片（14 mm×14 mm），每孔加入2 mLMH培養(yǎng)基和20 μL菌懸液，28℃恒溫培養(yǎng)1 d后，棄掉培養(yǎng)基，加入2 mL含冬凌草甲素納米脂質(zhì)體的MH培養(yǎng)基，使其終濃度分別為250、125、62.5、31.25、15.625μg/mL。以不含冬凌草甲素納米脂質(zhì)體的MH培養(yǎng)基為空白對(duì)照。28℃靜置培養(yǎng)24 h后，棄掉培養(yǎng)基。其余操作步驟同1.2.8。掃描電鏡法：生物膜制備方法同上。其余操作步驟同1.2.8。

1.2.10 數(shù)據(jù)分析

本試驗(yàn)用SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間分析采用One-Way ANOVA兩兩比較得到相應(yīng)的P值，P<0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬凌草甲素對(duì)嗜水氣單胞菌的抑菌活性

冬凌草甲素對(duì)嗜水氣單胞菌的抑菌活性結(jié)果如圖1所示。

圖1 冬凌草甲素對(duì)嗜水氣單胞菌的抑菌活性Fig.1 Antibacterial activity of oridonin against A.hydrophila

由圖1可知，冬凌草甲素對(duì)嗜水氣單胞菌具有顯著的抑菌活性。2.5 mg/mL冬凌草甲素作用嗜水氣單胞菌時(shí)的抑菌圈直徑達(dá)15.75 mm，相對(duì)敏感性達(dá)到高度敏感。

2.2 冬凌草甲素納米脂質(zhì)體對(duì)嗜水氣單胞菌MIC

二倍稀釋法測(cè)定冬凌草甲素納米脂質(zhì)體對(duì)供試菌MIC的結(jié)果如圖2所示。

圖2 冬凌草甲素納米脂質(zhì)體對(duì)嗜水氣單胞菌MIC測(cè)定Fig.2 MIC determination of oridonin nanoliposomes against A.hydrophila

由圖2可知，質(zhì)量濃度為62.5 μg/mL冬凌草甲素納米脂質(zhì)體顯著抑制了該菌的生長(zhǎng)（P<0.05），濃度越高其抑制活性越強(qiáng)，當(dāng)冬凌草甲素納米脂質(zhì)體的質(zhì)量濃度大于125 μg/mL時(shí)，供試菌不再生長(zhǎng)。MIC是指經(jīng)24 h培養(yǎng)后藥物組無(wú)明顯生長(zhǎng)的最低濃度，因此冬凌草甲素納米脂質(zhì)體對(duì)該菌的MIC為62.5 μg/mL。

2.3 嗜水氣單胞菌產(chǎn)膜能力鑒定

釆用剛果紅培養(yǎng)基培養(yǎng)法對(duì)嗜水氣單胞菌的產(chǎn)膜能力進(jìn)行了鑒定，結(jié)果如圖3所示。

圖3 剛果紅平板鑒定嗜水氣單胞菌生物膜成膜能力Fig.3 Identification of biofilm forming ability of A.hydrophila by Congo red plate

由圖3可知，平板中形成的菌落顏色呈黑色，有金屬光澤，這表明試驗(yàn)所用供試菌具有生物膜形成能力。

2.4 冬凌草甲素納米脂質(zhì)體對(duì)嗜水氣單胞菌生物膜的抑制活性

冬凌草甲素納米脂質(zhì)體對(duì)嗜水氣單胞菌生物膜形成的抑制作用見(jiàn)圖4。

由圖4可知，亞抑制濃度（31.25 μg/mL）的冬凌草甲素納米脂質(zhì)體對(duì)嗜水氣單胞菌生物膜形成的抑制率為3.59%，抑制活性不明顯，但隨著冬凌草甲素納米脂質(zhì)體含量的增加，對(duì)嗜水氣單胞菌生物膜形成的抑制率有所提高。冬凌草甲素納米脂質(zhì)體質(zhì)量濃度為62.5 μg/mL時(shí)，其對(duì)嗜水氣單胞菌生物膜形成的抑制率達(dá)到51.12%，與亞抑制濃度的冬凌草甲素納米脂質(zhì)體處理組相比，差異顯著（P<0.05）。當(dāng)冬凌草甲素納米脂質(zhì)體質(zhì)量濃度提高到125 μg/mL和250 μg/mL，其對(duì)該菌生物膜形成的抑制率分別達(dá)到66.63%和72.66%，與62.5μg/mL冬凌草甲素納米脂質(zhì)體處理組相比差異顯著（P<0.05）。試驗(yàn)結(jié)果表明，抑制濃度的冬凌草甲素納米脂質(zhì)體能抑制嗜水氣單胞菌的生物膜形成。

圖4 冬凌草甲素納米脂質(zhì)體對(duì)嗜水氣單胞菌生物膜形成的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of oridonin nanoliposomes on A. hydrophila biofilm formation

2.5 冬凌草甲素納米脂質(zhì)體對(duì)嗜水氣單胞菌生物膜代謝活性的影響

活菌體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶可以分解外源性四唑鹽 [3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]并形成甲瓚，因此只有活菌才能代謝MTT，故可用MTT法判斷冬凌草甲素納米脂質(zhì)體對(duì)供試菌生物膜代謝活性的抑制作用。冬凌草甲素納米脂質(zhì)體對(duì)嗜水氣單胞菌生物膜代謝活性的影響見(jiàn)圖5。

圖5 冬凌草甲素納米脂質(zhì)體對(duì)嗜水氣單胞菌生物膜代謝活性的影響Fig.5 Effect of oridonin nanoliposomes on metabolic activity of A.hydrophila biofilm

由圖5可知，亞抑菌濃度（31.25 μg/mL）的冬凌草甲素納米脂質(zhì)體對(duì)該菌生物膜代謝活性的抑制率僅為13.1%，但隨著冬凌草甲素納米脂質(zhì)體含量的增加，對(duì)該菌生物膜代謝活性的抑制率也逐漸提高。冬凌草甲素納米脂質(zhì)體質(zhì)量濃度為62.5 μg/mL時(shí)，其對(duì)該菌生物膜代謝活性的抑制率達(dá)到38.99%，與亞抑菌濃度的冬凌草甲素納米脂質(zhì)體處理組相比，差異顯著（P<0.05）。當(dāng)冬凌草甲素納米脂質(zhì)體質(zhì)量濃度提高到125 μg/mL和250 μg/mL，其對(duì)嗜水氣單胞菌生物膜代謝活性的抑制率分別達(dá)到70.46%和78.60%，與62.5 μg/mL冬凌草甲素納米脂質(zhì)體處理組相比差異顯著（P<0.05）。試驗(yàn)結(jié)果表明，抑制濃度的冬凌草甲素納米脂質(zhì)體能抑制嗜水氣單胞菌生物膜的代謝活性。

2.6 冬凌草甲素納米脂質(zhì)體對(duì)嗜水氣單胞菌生物膜形成的抑制作用

用熒光染料處理后，生物膜會(huì)在相應(yīng)激光供能刺激下釋放綠色熒光。因此，為了直觀(guān)觀(guān)察冬凌草甲素納米脂質(zhì)體對(duì)嗜水氣單胞菌生物膜形成的抑制作用，對(duì)不同質(zhì)量濃度冬凌草甲素納米脂質(zhì)體作用的嗜水氣單胞菌進(jìn)行了熒光顯微鏡觀(guān)察，結(jié)果如圖6所示。

圖6 熒光顯微鏡觀(guān)察冬凌草甲素納米脂質(zhì)體對(duì)嗜水氣單胞菌生物膜形成的抑制作用Fig.6 Inhibitory of oridonin nanoliposomes on A.hydrophila biofilm formation by fluorescence microscope

由圖6可知，隨著冬凌草甲素納米脂質(zhì)體濃度的增加，菌體數(shù)量明顯下降，綠色熒光減少。不同質(zhì)量濃度的冬凌草納米脂質(zhì)體作用于嗜水氣單胞菌的掃描電鏡觀(guān)察結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 掃描電鏡觀(guān)察冬凌草甲素納米脂質(zhì)體對(duì)嗜水氣單胞菌生物膜形成的抑制作用Fig.7 Inhibition of oridonin nanoliposomes on A.hydrophila biofilm formation by scanning electron microscopy

由圖7可知，對(duì)照組嗜水氣單胞菌生物膜形成良好，菌體聚集，形成多層立體結(jié)構(gòu)，而藥物處理組中的菌體數(shù)量則隨著藥物濃度的增加依次減少，未有聚集和形成多層立體結(jié)構(gòu)現(xiàn)象。由此可見(jiàn)，冬凌草甲素納米脂質(zhì)體對(duì)嗜水氣單胞菌生物膜的形成具有顯著的抑制活性。

2.7 冬凌草甲素納米脂質(zhì)體對(duì)嗜水氣單胞菌成熟生物膜的清除作用

為了考察冬凌草甲素納米脂質(zhì)體對(duì)嗜水氣單胞菌成熟生物膜的清除效果，對(duì)不同質(zhì)量濃度冬凌草甲素納米脂質(zhì)體作用的嗜水氣單胞菌進(jìn)行了熒光顯微鏡和掃描電鏡觀(guān)察，結(jié)果見(jiàn)圖8和圖9。

圖8 熒光顯微鏡觀(guān)察冬凌草甲素納米脂質(zhì)體對(duì)嗜水氣單胞菌生物膜形成的清除作用Fig.8 Scavenging effect of oridonin nanoliposomes on A.hydrophila biofilm formation by fluorescence microscope

圖9 掃描電鏡觀(guān)察冬凌草甲素納米脂質(zhì)體對(duì)嗜水氣單胞菌生物膜形成的清除作用Fig.9 Scavenging effect of oridonin nanoliposomes on A.hydrophila biofilm formation by scanning electron microscope

由圖8和圖9可知，亞抑制濃度的冬凌草甲素納米脂質(zhì)體對(duì)嗜水氣單胞菌成熟生物膜的清除效果較弱，藥物處理后，雖然生物膜的結(jié)構(gòu)受到破壞，但仍有大量菌體聚集。隨著冬凌草甲素納米脂質(zhì)體濃度的進(jìn)一步升高，熒光正置顯微鏡視野中綠色熒光顯著減弱，掃描電鏡中菌體數(shù)量顯著減少，這表明抑制濃度的冬凌草甲素納米脂質(zhì)體能有效清除嗜水氣單胞菌生物膜。

3 結(jié)論

本文研究了冬凌草甲素納米脂質(zhì)體對(duì)嗜水氣單胞菌生物膜的抑菌活性。試驗(yàn)結(jié)果表明，冬凌草甲素納米脂質(zhì)體對(duì)嗜水氣單胞菌的最小抑菌濃度為62.5 μg/mL；抑制濃度的冬凌草甲素納米脂質(zhì)體對(duì)嗜水氣單胞菌生物膜的形成具有抑制活性，并顯著抑制其代謝活性，且對(duì)嗜水氣單胞菌的成熟生物膜也具有一定的清除作用。該研究可為冬凌草甲素納米脂質(zhì)體應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖、水產(chǎn)保鮮等方面提供理論依據(jù)。