吳紹梅，張 立，王 晶，馬 濤

無錫市婦幼保健院檢驗科，無錫 214000

卵巢癌是婦科常見惡性腫瘤，具有高復發(fā)率和高死亡率的特點。在腫瘤細胞減滅術后應用以順鉑(cis-platinum，DDP)為主的聯合化療是當前最常見的卵巢癌臨床治療方案[1-2]。但卵巢癌患者常出現原發(fā)性或獲得性的順鉑耐藥，嚴重影響了順鉑聯合化療的效果[3]。組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)在調控細胞核組蛋白乙?；揎椫芯哂兄匾饔?，許多HDAC抑制劑被發(fā)現可以調控腫瘤的增殖、侵襲及多藥耐藥，具有重要的臨床應用價值[4-7]。羅米地辛(Romidepsin，又稱FK228)是Class Ⅰ家族HDACs的抑制劑，在臨床上已被應用于治療皮膚T淋巴瘤和外周T淋巴瘤[8-9]。本研究使用順鉑耐藥卵巢癌細胞系COC1/DDP，系統(tǒng)研究了羅米地辛對COC1/DDP細胞順鉑敏感性、PD-L1表達水平的影響和可能的調控機制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

超凈工作臺、酶標儀、凝膠電泳儀和凝膠成像儀均購自上海天能科技有限公司；蛋白轉印儀(Bio-Rad)、流式細胞儀(BD)、熒光定量PCR儀均購自美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 試藥

人卵巢癌順鉑耐藥細胞株COC1/DDP(中國醫(yī)學科學院細胞庫)；Romidepsin(德國Merck公司)；CCK-8細胞增殖試劑盒(日本同仁化學所)；Annexin V/PI細胞凋亡試劑盒(invitrogen)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(hyclone)、熒光素偶聯PD-L1抗體(FITC-anti-PD-L1 antibody)均購自北京義翹神州科技股份有限公司；總RNA提取試劑盒、SYBRgreen qPCR Mix均購自北京天根生物公司；細胞核蛋白提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；抗組蛋白H3抗體(anti-histone H3)、抗乙?；M蛋白H3抗體(anti-acetylated H3)、HRP-anti-mouse IgG均購自美國CST公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

將COC1/DDP細胞株接種在含有青霉素/鏈霉素和體積分數10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃、體積分數5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d進行傳代。

2.2 CCK-8法檢測細胞存活率

將處于對數生長期的COC1/DDP細胞消化、離心并進行細胞計數，調整細胞密度至2×105個·mL-1，接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔200 μL，讓細胞充分貼壁生長。細胞貼壁生長24 h后，將細胞分為2組，Romidepsin組加入終濃度為5 nmol·L-1的Romidepsin，Control組加入等體積的二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)。各組細胞均分別加入質量濃度梯度為0、2.5、5、10、20、40、80 μg·mL-1的DDP，隨后放置于細胞培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，最后用酶標儀檢測各孔450 nm波長處的吸光度(A)，并計算細胞活力。細胞活力(%)=(A-A空白)/(A0-A空白)×100%。

2.3 細胞凋亡率檢測

將處于對數生長期的COC1/DDP細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板，并分為4組：Control組加等體積的DMSO，Romidepsin組加入終濃度為5 nmol·L-1的Romidepsin，DDP組加入終質量濃度為20 μg·mL-1的DDP，Romidepsin+DDP組同時加Romidepsin和DDP。加藥培養(yǎng)24 h后，消化、離心收集細胞，用500 μL Annexin V結合緩沖液重懸，并加入10 μL FITC-Annexin V，室溫避光孵育15 min后，加入5 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)，隨后用流式細胞儀檢測凋亡細胞。

2.4 實時熒光PCR

Control組細胞和Romidepsin組細胞培養(yǎng)24 h后，離心收集細胞，使用總RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，取1 μg總RNA，使用反轉錄試劑盒進行反轉錄得到cDNA。隨后用SYRB green qPCR mix進行實時熒光PCR，分別檢測PD-L1和STAT3 mRNA的表達水平，以GAPDH作為內參。

2.5 流式細胞染色檢測PD-L1表達

貼壁生長的Control組和Romidepsin組COC1/DDP細胞經過胰酶消化、離心收集細胞，調整細胞密度為2×106個·mL-1。取50 μL細胞懸液，加入0.5 μL FITC-anti-PD-L1抗體，4 ℃避光孵育1 h，隨后加入450 μL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)，用流式細胞儀檢測PD-L1的表達水平。

2.6 Western blot檢測組蛋白乙?；?/h3>

離心收集各組細胞，使用細胞核蛋白提取試劑盒分離細胞核蛋白，加入5×SDS上樣緩沖液，置于100 ℃沸水浴中加熱10 min。使用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白樣品，隨后使用蛋白轉印儀將凝膠上的蛋白樣品轉印到聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride，PVDF)膜上。PVDF膜經過體積分數5%脫脂奶粉室溫封閉40 min后，分別用抗組蛋白H3抗體、抗乙?；M蛋白H3抗體孵育和HRP二抗孵育，用化學發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)底物檢測蛋白條帶。

2.7 統(tǒng)計學方法

采用Graphpad Prism 7.0軟件對數據進行統(tǒng)計學分析，組間差異采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 細胞存活率

與Control組相比，使用5 nmol·L-1Romidepsin處理的COC1/DDP細胞在各質量濃度梯度(2.5、5、10、20、40、80 μg·mL-1)順鉑處理下，細胞存活率均顯著下降(P<0.05)，結果見圖1。計算順鉑IC50值，Control組細胞IC50值為24.8 μg·mL-1，Romidepsin組細胞IC50值為10.3 μg·mL-1，逆轉指數為2.43。

圖1 細胞存活曲線

3.2 細胞凋亡率

與Control組相比，Romidepsin組COC1/DDP細胞早期凋亡率和晚期凋亡率稍微升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.058、P=0.103)，而DDP組細胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均升高(P=0.009、P=0.011)。與DDP組相比，Romidepsin+DDP組細胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均顯著升高(P=0.004、P=0.003)。結果見表1。

表1 各組細胞的凋亡率

3.3 實時熒光PCR實驗檢測PD-L1 mRNA的表達水平

與Control組相比，Romidepsin組COC1/DDP細胞PD-L1 mRNA的表達水平上升了(2.43±0.57)倍(P=0.012 7)，表明Romidepsin可以促進COC1/DDP細胞PD-L1 mRNA的表達，結果見圖2A。

3.4 流式細胞染色檢測細胞表面PD-L1表達水平

與Control組相比，Romidepsin組COC1/DDP細胞表面PD-L1信號明顯增強，細胞峰值右移，表明Romidepsin處理可以促進細胞PD-L1蛋白在細胞膜上的表達，結果見圖2B。

3.5 組蛋白乙?；?/h3>

Control組與Romidepin組細胞組蛋白H3(histone H3)表達水平無明顯變化，但Romidepin組細胞乙酰化組蛋白H3(acetylated H3)水平顯著上升，計算條帶灰度值，與Control組相比，Romidepin組細胞組蛋白H3乙?；缴吡?32.7±8.95)倍(P<0.000 1)，表明Romidepin可以促進組蛋白H3的乙?；?。結果見圖3。

注：A.Western blot檢測結果；B.灰度值分析。

3.6 熒光定量PCR檢測STAT3表達水平

與Control組相比，Romidepsin組COC1/DDP細胞轉錄因子STAT3的相對表達水平顯著下降(1.00±0.09vs.0.69±0.13，P=0.027 4)。

4 討論

本研究發(fā)現HDAC抑制劑Romidepsin可以在體外培養(yǎng)條件下，增強順鉑耐藥的卵巢癌細胞COC1/DDP對順鉑的敏感性，順鉑聯合Romidepsin處理顯著促進了卵巢癌細胞的凋亡?？寡苄律幬镏委?、順鉑聯合化療等卵巢癌術后的常用化療方案，由于許多卵巢癌患者存在多藥耐藥性，導致化療效果并不理想[2, 9-11]。因此，探究卵巢癌細胞順鉑耐藥的機制、尋找新的聯合化療藥物、增強卵巢癌細胞對順鉑的敏感性是解決該問題的主要手段。

Romidepsin是重要的HDAC抑制劑，主要抑制Class Ⅰ家族HDAC(包括HDAC1、HDAC2和HDAC3)的去乙酰化活性，促進組蛋白乙酰化水平的升高[12-13]。在本研究中，用Western blot驗證了Romidepsin對COC1/DDP細胞組蛋白H3乙?；降拇龠M作用。在臨床上，Romidepsin已經被應用于治療T細胞淋巴瘤[9]。當前，越來越多的研究表明，Romidepsin對于多種實體腫瘤也表現出顯著的抗腫瘤活性。陳柯宇等[14]發(fā)現Romidepsin與阿糖胞苷聯合用藥可以通過增強CASP3啟動子的轉錄活性抑制肺腺癌細胞的增殖和侵襲；PATTARAWAT P等[15]的研究發(fā)現Gemcitabine(吉西他濱)、Romidepsin和順鉑聯合用藥可以顯著抑制三陰性乳腺癌的疾病進展。本研究也發(fā)現Romidepsin和順鉑聯合用藥可以顯著抑制體外培養(yǎng)的卵巢癌細胞的增殖，促進細胞凋亡。這一發(fā)現提示Romidepsin在卵巢癌臨床治療中的潛在應用價值。此外，本研究還發(fā)現經Romidepsin處理的COC1/DDP細胞PD-L1的表達水平也顯著升高。PD-L1常高表達于腫瘤細胞，可以通過與殺傷性T細胞表面PD-1蛋白的結合幫助腫瘤逃避免疫系統(tǒng)的殺傷作用[16-18]。Romidepsin處理導致的卵巢癌細胞高表達PD-L1可能會引起免疫抑制，從而促進腫瘤的免疫逃逸。但從另一方面考慮，高表達的PD-L1可能會促進靶向PD-L1的單抗藥物的作用。

STAT3是促進細胞增殖、遷移的重要轉錄因子，一些研究也發(fā)現STAT3的高表達和活化與腫瘤細胞的多藥耐藥性密切相關[19-20]。本研究通過實時熒光PCR實驗檢測發(fā)現經Romidpesin處理的卵巢癌細胞STAT3的表達水平也顯著升高，表明Romidepsin可能通過對組蛋白去乙?；傅囊种平档土薙TAT3的轉錄和表達水平，從而進一步逆轉卵巢癌細胞對順鉑的耐藥性。

綜上所述，本研究發(fā)現了Romidepsin聯合順鉑用藥可以逆轉對順鉑耐藥的卵巢癌細胞的耐藥性，促進細胞凋亡，揭示了Romidepsin在卵巢癌術后化療中潛在的重要作用。然而Romidepsin可以促進卵巢癌細胞PD-L1的表達，提示其可能會引起腫瘤的免疫抑制，促進腫瘤免疫逃逸。