梅國(guó)榮，徐紅應(yīng)，黃 宇，黃美華，陳 蓉，周靖惟,2，胡昌江,2，孫紀(jì)元*

1. 四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司，國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥配方顆粒質(zhì)量與療效評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611900；2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都 611137

川射干為鳶尾科植物鳶尾(IristectorumMaxim.)的干燥根莖，具有清熱解毒、祛痰、利咽的功效，用于治療熱毒痰火郁結(jié)、咽喉腫痛、痰涎壅盛、咳嗽氣喘[1]。川射干配方顆粒是以川射干飲片為原料，經(jīng)提取、濃縮、干燥、制粒、包裝制成的單味顆粒。川射干的化學(xué)成分主要為黃酮類、異黃酮類、苯醌類及酚類化合物[2-4]，其中異黃酮類化合物是鳶尾科植物的特征性化學(xué)成分，具有抗炎、解熱、止咳、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗腫瘤、保護(hù)神經(jīng)等作用[5-11]。《中華人民共和國(guó)藥典》(以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》)2020年版一部?jī)H對(duì)川射干中射干苷的含量進(jìn)行了控制，未能反映其他異黃酮類成分的含量水平。王智民等[12]提出的一測(cè)多評(píng)法(quantitative analysis of multi-components with single-marker, QAMS)的多指標(biāo)質(zhì)控模式符合中藥化學(xué)成分復(fù)雜的特點(diǎn)，即在進(jìn)行多指標(biāo)質(zhì)量控制時(shí)，以樣品中廉價(jià)易得的典型成分為內(nèi)標(biāo)，建立該成分與其他成分間的相對(duì)校正因子(fk/s)，再通過(guò)fk/s計(jì)算其他成分的含量，從而實(shí)現(xiàn)多成分的同時(shí)評(píng)價(jià)，此方法在實(shí)踐中得到了廣泛應(yīng)用，取得了較好的效果[12-21]。目前《中國(guó)藥典》2020年版一部使用QAMS對(duì)丹參、黃連等藥材進(jìn)行質(zhì)量控制[1]。為全面控制川射干配方顆粒的質(zhì)量，本研究采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)建立了測(cè)定5種異黃酮類成分含量的QAMS。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 5 TC-C18色譜柱(安捷倫股份有限公司)、YMC-Tiart C18(YMC 股份有限公司)、WondaSil C18(日本島津公司)；Agilent 1260液相色譜儀(安捷倫股份有限公司)；Wsters e2695液相色譜儀(沃特世科技有限公司)；XPE26百萬(wàn)分之一天平(梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司)；ME204E萬(wàn)分之一天平(梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司)；Mocell 1820A制水機(jī)(重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司)；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

射干苷(批號(hào)111632-202003，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.7%，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；野鳶尾苷(批號(hào)wkq18010404，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.1%)，鳶尾黃素(批號(hào)wkq1802201，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.2%)，鳶尾甲黃素A(批號(hào)wkq18052903，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.3%)，鳶尾甲黃素B(批號(hào)wkq18021107，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%)，均購(gòu)自維克奇生物科技有限公司；乙腈(Sigma-Aldrich貿(mào)易有限公司)；水為超純水；其他試劑均為分析純。

川射干配方顆粒(批號(hào)分別為1608062、1708001、1803049、1806001、1901001，四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC方法的建立

2.1.1色譜條件 色譜柱為Agilent 5 TC C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。以乙腈為流動(dòng)相A，2 mL·L-1磷酸水溶液為流動(dòng)相B。梯度洗脫：0～30 min，18% A；30～40 min，18%A～25%A；40～45 min，25%A～38% A；45～60 min，38%A。流速為0.9 mL·min-1。檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm。柱溫為40 ℃。結(jié)果見圖1。

2.1.2混合對(duì)照品溶液的制備 分別取射干苷、野鳶尾苷、鳶尾黃素、鳶尾甲黃素A、鳶尾加黃素B適量，精密稱定，加體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇制成含射干苷403.56 μg·mL-1、野鳶尾苷74.754 μg·mL-1、鳶尾黃素200.312 μg·mL-1、鳶尾甲黃素A 59.247 6 μg·mL-1、鳶尾甲黃素B 104.664 μg·mL-1的溶液，作為混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液5 mL轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。

2.1.3供試品溶液的制備 精密稱定川射干配方顆粒0.2 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

注：a.對(duì)照品；b.供試品；1.射干苷；2.野鳶尾苷；3.鳶尾黃素；4.鳶尾甲黃素A；5.鳶尾甲黃素B。

2.1.4線性關(guān)系考察 取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液分別稀釋0、2、5、10、25、50倍，分別制成標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液Ⅰ～Ⅵ，分別取10 μL，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 5種成分線性關(guān)系考察結(jié)果

2.1.5精密度實(shí)驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，記錄各成分的峰面積并計(jì)算峰面積的RSD值，射干苷、野鳶尾苷、鳶尾黃素、鳶尾甲黃素A、鳶尾甲黃素B峰面積的RSD值分別為0.46%、0.52%、0.65%、0.63%和0.68%，表明儀器的精密度良好。

2.1.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批號(hào)(批號(hào)1806001)川射干配方顆粒供試品，按2.1.3項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，進(jìn)樣分析，記錄各成分的峰面積，用外標(biāo)法(external standard method，ESM)計(jì)算各成分的含量和含量的RSD值。計(jì)算得射干苷、野鳶尾苷、鳶尾黃素、鳶尾甲黃素A、鳶尾甲黃素B的含量分別為29.97、2.50、12.69、1.23、3.26 mg·g-1，樣品中以上5種成分的含量均在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)；RSD值分別為0.56%、0.92%、0.69%、0.86%、0.67%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.1.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一批號(hào)(批號(hào)1806001)川射干配方顆粒供試品，按2.1.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析，記錄各成分的峰面積和峰面積的RSD值。計(jì)算得射干苷、野鳶尾苷、鳶尾黃素、鳶尾甲黃素A、鳶尾甲黃素B峰面積的RSD值分別為0.25%、0.93%、0.07%、0.28%、0.09%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知5種成分含量的川射干配方顆粒供試品(批號(hào)1806001)0.1 g，精密稱定6份，加入混合對(duì)照品儲(chǔ)備液5 mL，按2.1.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析。計(jì)算得射干苷、野鳶尾苷、鳶尾黃素、鳶尾甲黃素A、鳶尾甲黃素B的平均加樣回收率分別為97.58%、94.32%、97.81%、98.34%、95.67%，RSD值分別為2.22%、1.57%、2.41%、1.89%、0.96%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

2.2 相對(duì)校正因子確定

2.2.1相對(duì)校正因子計(jì)算 取標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液Ⅰ～Ⅵ 10 μL，進(jìn)樣分析，記錄各成分的峰面積，選擇射干苷為內(nèi)參物確定其他成分的fk/s，結(jié)果見表2。

表2 相對(duì)校正因子的計(jì)算

2.2.2重復(fù)性考察 考察了采用不同色譜系統(tǒng)(Agilent 1260和Waters e2695)及不同色譜柱(Agilent 5 TC C18250 mm×4.6 mm，5 μm；YMC C18250 mm×4.6 mm，5 μm；Wondasil C18250 mm×4.6 mm，5 μm)對(duì)fk/s的影響，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，各待測(cè)成分fk/s使用不同色譜系統(tǒng)、不同色譜柱時(shí)重復(fù)性較好。

表3 不同色譜系統(tǒng)、不同色譜柱對(duì)fk/s的影響

2.2.3QAMS待測(cè)成分定位 通過(guò)相對(duì)保留時(shí)間對(duì)待測(cè)化合物進(jìn)行定位，以射干苷保留時(shí)間為參照，分別考察相對(duì)保留時(shí)間在不同色譜系統(tǒng)和不同色譜柱的重復(fù)性，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，各待測(cè)成分相對(duì)保留時(shí)間在使用不同色譜系統(tǒng)、不同色譜柱時(shí)差異較小，可用于待測(cè)組分的定位。

表4 QAMS待測(cè)成分定位

2.2.4樣品含量測(cè)定 取川射干配方顆粒5批，按2.1.3項(xiàng)下方法平行配制3份供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，分別采用ESM、QAMS計(jì)算各待測(cè)成分的含量，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，2種方法測(cè)得的川射干配方顆粒中有效成分的含量無(wú)明顯差異。

表5 各成分含量測(cè)定結(jié)果 (n=3)

3 討論

3.1 QAMS中內(nèi)參物的選定

野鳶尾苷、鳶尾黃素、鳶尾甲黃素A、鳶尾甲黃素B等對(duì)照品價(jià)格昂貴，射干苷為常用的對(duì)照品，廉價(jià)易得、性質(zhì)穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)射干苷對(duì)照品即使溶液長(zhǎng)時(shí)間放置，其峰面積亦不會(huì)發(fā)生較大的變化。因此，本研究以射干苷為內(nèi)參物對(duì)川射干配方顆粒中其他4種異黃酮類成分的含量進(jìn)行測(cè)定。

3.2 供試品溶液制備方法的篩選

本研究利用單因素實(shí)驗(yàn)，分別對(duì)提取方式、提取溶劑、溶劑用量、提取時(shí)間進(jìn)行考察，結(jié)果表明采用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇作為提取溶劑、溶劑用量50 mL、超聲提取30 min制備的供試品溶液檢測(cè)出的色譜峰的數(shù)量相對(duì)較多，各峰高比例適中，分離度較好，基線平穩(wěn)，最終確定2.1.3項(xiàng)下的供試品制備方法。

3.3 流動(dòng)相的篩選

本研究對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了篩選，分別采用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-2 mL·L-1磷酸水溶液、乙腈-2 mL·L-1磷酸水溶液等作為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)乙腈-2 mL·L-1磷酸水溶液按2.1.1項(xiàng)下比例梯度洗脫，各目標(biāo)峰的理論板數(shù)、分離度、對(duì)稱性均較好。

3.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

通過(guò)在200～400 nm下對(duì)射干苷、野鳶尾苷、鳶尾黃素、鳶尾甲黃素A、鳶尾甲黃素B進(jìn)行光譜掃描，發(fā)現(xiàn)各成分的最大吸收波長(zhǎng)分別為264.4、264.6、264.5、266.1、265.5 nm，通過(guò)波長(zhǎng)耐用性考察，發(fā)現(xiàn)波長(zhǎng)為(265±2)nm時(shí)，各目標(biāo)化合物的峰形、分離度、對(duì)稱因子、理論板數(shù)及含量均無(wú)明顯差異，最終將265 nm作為該方法的檢測(cè)波長(zhǎng)。

本研究采用ESM及QAMS對(duì)川射干配方顆粒中5種異黃酮類成分的含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明，2種方法測(cè)定結(jié)果的相對(duì)偏差均小于1.0%，可在缺少野鳶尾苷、鳶尾黃素、鳶尾甲黃素A、鳶尾甲黃素B對(duì)照品的情況下通過(guò)各成分的fk/s和tk/s確定各成分的含量，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)川射干配方顆粒5種異黃酮類成分含量的測(cè)定。本研究建立的QAMS可用于川射干配方顆粒的質(zhì)量控制。