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（天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科，天津 300070）

口腔鱗狀細(xì)胞癌（OSCC）是口腔最常見(jiàn)的惡性腫瘤，約占口腔癌總數(shù)的90%，其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[1-2]。OSCC 可發(fā)生在舌、頰、牙齦、硬腭、口底等黏膜部位。OSCC 的病因尚不清楚，多數(shù)研究表明吸煙、飲酒、咀嚼檳榔、人乳頭瘤病毒（HPV，主要是16 型）、硬皮病、某些遺傳病（如Zinsser- Engman -Cole 綜合征等）可能是口腔癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素。OSCC 浸潤(rùn)性強(qiáng)，易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，通常在晚期后才被診斷出來(lái)，5年生存率不到50%[3]。目前已有一些研究探討了影響OSCC 發(fā)展和預(yù)后的一些相關(guān)因子，以尋找新的治療靶點(diǎn)，為OSCC 基因靶向治療提供了新方向[4]。

次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶1（hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1，HPRT1）又稱為HPRT、HGPRT。它是一種補(bǔ)救途徑酶，負(fù)責(zé)將核糖單磷酸從磷酸核糖焦磷酸（phosphoribosyl pyrophosphate，PRPP）轉(zhuǎn)移到次黃嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤，分別形成肌苷單磷酸（inosine monophosphate，IMP）和鳥(niǎo)苷單磷酸（guanosine monophosphate，GMP）[5]。HPRT1含有217個(gè)氨基酸，在所有組織中均以低水平表達(dá)[6]，唯一的例外是在中樞神經(jīng)組織中表達(dá)水平異常升高[7]。最近一些研究發(fā)現(xiàn)，HPRT1 在惡性腫瘤組織中的表達(dá)普遍升高。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)HPRT1 的mRNA 水平與受試小鼠的腫瘤負(fù)荷直接相關(guān)，說(shuō)明小鼠體內(nèi)HPRT1 的水平與腫瘤的大小有關(guān)[8]。研究表明，HPRT1 的表達(dá)在前列腺癌患者樣本中增加，在乳腺癌患者的基礎(chǔ)亞型中最高，并與乳腺癌的進(jìn)展相關(guān)，可作為一個(gè)潛在的預(yù)后標(biāo)志物[9]。對(duì)結(jié)腸、直腸癌的研究表明，與正常組織相比，腫瘤樣本中HPRT1 的水平升高[10]。最新研究發(fā)現(xiàn)，HPRT 通過(guò)與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）的直接相互作用，促進(jìn)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）的增殖和轉(zhuǎn)移[11]。也有學(xué)者證實(shí)HPRT1在HNSCC 組織中的高表達(dá)與患者的不良預(yù)后有關(guān)[12]。目前國(guó)內(nèi)對(duì)于HPRT1 在OSCC 中的作用鮮有報(bào)道，因此本研究擬利用TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站分析HPRT1在OSCC 中的表達(dá)及意義。有文獻(xiàn)報(bào)道嘌呤水平顯著降低了癌癥中的免疫細(xì)胞活化，惡性腫瘤組織中HPRT1的上調(diào)是免疫抑制微環(huán)境的一個(gè)促成因素[13]。因此本研究對(duì)HPRT1 在OSCC 免疫環(huán)境中的作用也做了相應(yīng)研究。

1 資料與方法

1.1 TCGA 數(shù)據(jù)收集 從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//can cergenome.nih.gov/）中下載OSCC 轉(zhuǎn)錄樣本394 例（其中362 例癌癥樣本，32 例癌旁樣本）和臨床數(shù)據(jù)（381 例）。

1.2 研究方法

1.2.1 GESA 富集分析 GESA4.1.0 軟件富集分析HPRT1 表達(dá)水平與京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路基因集的相關(guān)性。從MsigDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載通路富集常用的c2.cp.kegg.v7.2.symbols 基因集作為參照基因集。軟件參數(shù)設(shè)置為隨機(jī)組合次數(shù)為1 000 次，計(jì)算富集系數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)化后的富集系數(shù)。按照錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rates，F(xiàn)DR）進(jìn)行排序，利用HPRT1 基因表達(dá)的中位數(shù)值將TCGA 數(shù)據(jù)集中的381 例OSCC 患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，分別篩選出前十條通路。

1.2.2 免疫差異性與相關(guān)性分析 使用R4.1.1 軟件的“l(fā)imma”包和“vioplot”包對(duì)免疫細(xì)胞在HPRT1高低表達(dá)組中的差異性進(jìn)行分析和繪圖；使用“l(fā)imma”包、“ggplot2”包、“ggpubr”包和“ggExtra”包對(duì)HPRT1 的表達(dá)量與免疫細(xì)胞的相關(guān)性進(jìn)行分析和繪圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 利用R4.1.1 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。利用Wilcoxon 法和Kruskal-Wallis 法進(jìn)行臨床相關(guān)性分析。利用Log-Rank 法進(jìn)行生存評(píng)估分析。生存資料中不同變量的風(fēng)險(xiǎn)比采用Cox 回歸分析。因TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中OSCC 患者臨床數(shù)據(jù)中M 分期未知的數(shù)據(jù)過(guò)多，導(dǎo)致刪除臨床信息不完整的數(shù)據(jù)后樣本量過(guò)小，因此在進(jìn)行臨床相關(guān)性分析和Cox 分析時(shí)未將M 分期納入其中。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OSCC 和正常組織中HPRT1 的表達(dá)差異 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中OSCC 組織與正常組織樣本相比，OSCC組織中HPRT1 表達(dá)水平明顯高于正常組織（t=1.856，P<0.001，圖1、2）。

圖1 總樣本中HPRT1 的表達(dá)差異Fig 1 Expression difference of HPRT1 in total samples

圖2 配對(duì)樣本中HPRT1 的表達(dá)差異Fig 2 Expression difference of HPRT1 in paired samples

2.2 HPRT1 基因與OSCC 患者臨床特征的相關(guān)性 HPRT1 表達(dá)水平在腫瘤分級(jí)中的G1 和G2 級(jí)（χ2=0.010，P=0.011）、G1 和G3 級(jí)（χ2=0.806，P< 0.001）以及G2 和G3 級(jí)（χ2=0.001，P=0.047）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3）；在腫瘤臨床分期中的Ⅰ期和Ⅲ期（χ2=0.078，P=0.006）、Ⅲ期和Ⅳ期（χ2=0.091，P=0.038）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4）；在T 分期中的T1 期和T3期（χ2=0.342，P=0.037）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5）。HPRT1 表達(dá)水平與年齡、性別、N 分期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖6~8）。

圖3 HPRT1 與腫瘤分級(jí)的關(guān)系Fig 3 Relationship between HPRT1 and tumor grade

圖4 HPRT1 與臨床分期的關(guān)系Fig 4 Relationship between HPRT1 and clinical stage

圖5 HPRT1 與腫瘤T 分期的關(guān)系Fig 5 Relationship between HPRT1 and tumor T stage

圖6 HPRT1 與年齡的關(guān)系Fig 6 Relationship between HPRT1 and age

圖7 HPRT1 與性別的關(guān)系Fig 7 Relationship between HPRT1 and gender

圖8 HPRT1 與腫瘤N 分期的關(guān)系Fig 8 Relationship between HPRT1 and tumor N stage

2.3 HPRT1 基因表達(dá)與患者生存率的關(guān)系 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中381 例患者的隨訪時(shí)間為0.07 個(gè)月至15 年，HPRT1 基因高表達(dá)組總生存率明顯低于低表達(dá)組（圖9，P＜0.05）。高表達(dá)組5 年生存率為35.2%，低表達(dá)組5 年生存率為50.3%。

圖9 HPRT1 與患者生存率的關(guān)系Fig 9 Relationship between HPRT1 and patients'survival rate

2.4 HPRT1 基因與OSCC 患者預(yù)后的關(guān)系 Cox 單因素分析顯示OSCC 中年齡（HR=1.03，P= 0.001）、腫瘤分級(jí)（HR=1.38，P=0.031）、腫瘤分期（HR=1.74，P＜0.001）、T 分期（HR=1.54，P＜0.001）、N 分期（HR=1.50，P＜0.001）、HPRT1 表達(dá)量（HR=1.03，P＜0.001）與患者的生存預(yù)后相關(guān)（表1）。Cox 多因素分析顯示OSCC 中年齡（HR=1.03，P＜0.001）和HPRT1 表達(dá)量（HR=1.02，P=0.002）與患者生存預(yù)后相關(guān)。因此年齡和HPRT1 的高表達(dá)是影響OSCC 患者預(yù)后的獨(dú)立因素（表1、圖10）。

表1 Cox 單因素及多因素分析Tab 1 Cox single factor and multi factor analysis

圖10 HPRT1 的Cox 多因素分析結(jié)果Fig 10 Cox multivariate analysis results of HPRT1

2.5 HPRT1 可能參與的信號(hào)通路 GSEA 結(jié)果顯示，HPRT1 基因高表達(dá)樣本主要富集在基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子通路、細(xì)胞周期通路、DNA 復(fù)制等通路（FDR＜0.05，P＜0.05）；HPRT1 基因低表達(dá)樣本主要富集在氨酰-tRNA 生物合成通路、堿基切除修復(fù)通路（P＜0.05）（圖11、12）。

圖11 HPRT1 基因高表達(dá)組的GSEA 富集結(jié)果Fig 11 GSEA enrichment results of HPRT1 gene high expression group

2.6 HPRT1 與免疫細(xì)胞的相關(guān)性

2.6.1 免疫細(xì)胞差異分析 幼稚B 細(xì)胞（P=0.048）、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（P=0.001）、休眠NK 細(xì)胞（P=0.029）、休眠肥大細(xì)胞（P＜0.001）、活躍肥大細(xì)胞（P=0.047）、嗜酸性粒細(xì)胞（P=0.035）、中性粒細(xì)胞（P=0.016）的表達(dá)在HPRT1 高表達(dá)組與低表達(dá)組中的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖13）。

圖13 免疫細(xì)胞在兩組患者中的表達(dá)Fig 13 Expression of immune cells in two groups of patients

2.6.2 免疫細(xì)胞相關(guān)性檢驗(yàn) 調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（R＜0，P＜0.001）、休眠肥大細(xì)胞（R＜0，P=0.003）和中性粒細(xì)胞含量（R＜0，P=0.001）與HPRT1 表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)；嗜酸性粒細(xì)胞含量（R＞0，P=0.016）與HPRT1 表達(dá)量呈正相關(guān)（圖14）。

圖12 HPRT1 基因低表達(dá)組的GSEA 富集結(jié)果Fig 12 GSEA enrichment results of HPRT1 gene in low expression group

圖14 HPRT1 與免疫細(xì)胞的相關(guān)性Fig 14 Correlation between HPRT1 and immune cells

3 討論

OSCC 是嚴(yán)重威脅人類健康的一類惡性腫瘤，它的典型特征是高度的局部侵襲性和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，由于OSCC 易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)，因此OSCC 患者的總體5年生存率仍不到50%[14]。目前OSCC 的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，可能是由多基因、多通路聯(lián)合調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程。尋找與OSCC 發(fā)展及預(yù)后的密切相關(guān)因子，對(duì)腫瘤的早期診斷與預(yù)后極其重要。本研究通過(guò)挖掘TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)公開(kāi)發(fā)表的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)HPRT1 在OSCC 組織中高度表達(dá)，對(duì)腫瘤內(nèi)的免疫環(huán)境產(chǎn)生了影響，并且高表達(dá)患者的生存預(yù)后更差，提示HPRT1 可能是OSCC 的一個(gè)潛在的預(yù)后因子。

HPRT1 是一種蛋白質(zhì)，已顯示在多種腫瘤類型中顯著升高[8-10]，HPRT1 在神經(jīng)發(fā)育和嘌呤合成中具有次要調(diào)節(jié)作用，嘌呤過(guò)剩分解與HPRT1 功能的喪失直接相關(guān)[15]。HPRT1 在腫瘤中的表達(dá)普遍升高，說(shuō)明HPRT1 在腫瘤中的調(diào)節(jié)作用可能是獨(dú)特的，HPRT1 的異常調(diào)節(jié)可能會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞增殖并促進(jìn)腫瘤發(fā)展。腫瘤微環(huán)境不僅由惡性細(xì)胞組成，實(shí)質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、血管、淋巴管和免疫細(xì)胞之間存在復(fù)雜的相互作用，它們結(jié)合起來(lái)形成復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境[16]。本研究顯示HPRT1 升高會(huì)影響調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Tregs）、休眠肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的含量，因此HPRT1 可能對(duì)腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子表達(dá)有影響。有學(xué)者研究HPRT1在幾種腫瘤中的免疫浸潤(rùn)發(fā)現(xiàn)，HPRT1 表達(dá)與B 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞的免疫浸潤(rùn)之間存在顯著的負(fù)相關(guān)；在前列腺腺癌（PRAD）、肺鱗狀細(xì)胞癌（LUSC）和甲狀腺癌（THCA）中，HPRT1 升高后所有類型的免疫細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)減少，但THCA 中的CD8+T 細(xì)胞除外；而HPRT1 升高后免疫浸潤(rùn)幾乎沒(méi)有變化的是食道癌（ESCA）、腎嫌色細(xì)胞癌（KICH）和子宮癌肉瘤（UCS）[13]。Tregs 在維持自身耐受和免疫穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用，但它們參與促進(jìn)了腫瘤周圍的免疫抑制環(huán)境[17]，而腫瘤微環(huán)境也促進(jìn)了Tregs 的積累[18]。Tregs 可以高度浸潤(rùn)各種腫瘤類型（如皮膚癌、胰腺癌、乳腺癌等），在晚期腫瘤（Ⅲ期和Ⅳ期）經(jīng)常表現(xiàn)出更高的積累[18]。有報(bào)道指出腫瘤內(nèi)Tregs 的浸潤(rùn)與生存率呈負(fù)相關(guān)[19]。而本研究發(fā)現(xiàn)HPRT1 的高表達(dá)與Tregs 的含量呈負(fù)相關(guān)，并且在3 種與HPRT1 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)的免疫細(xì)胞中差異最大，推測(cè)HPRT1 的表達(dá)對(duì)Tregs 在腫瘤微環(huán)境中的產(chǎn)生與積累密切相關(guān)，關(guān)于HPRT1 與Tregs 在腫瘤微環(huán)境中表達(dá)的機(jī)制還有待進(jìn)一步探究。休眠肥大細(xì)胞是與軟組織肉瘤的復(fù)發(fā)和生存率相關(guān)的免疫細(xì)胞[20]，并與透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌（ccRCC）的良好預(yù)后有關(guān)，盡管其在ccRCC 中的含量較低[21]。本研究發(fā)現(xiàn)休眠肥大細(xì)胞在HPRT1 高低表達(dá)組中含量差異最大，表明HPRT1高表達(dá)可能抑制休眠肥大細(xì)胞產(chǎn)生。腫瘤相關(guān)的中性粒細(xì)胞增多是黑色素瘤、胃癌、肺癌、頭頸癌等的不良預(yù)后特征[22]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)CD16（high）CD62L（dim）中性粒細(xì)胞的增加與頭頸癌的良好預(yù)后相關(guān)[23]。本研究發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞隨HPRT1表達(dá)增高而減少，關(guān)于中性粒細(xì)胞在OSCC 中的作用還有待證實(shí)。嗜酸性粒細(xì)胞可分泌多種可溶性介質(zhì)和效應(yīng)分子，它們對(duì)腫瘤微環(huán)境中其他免疫細(xì)胞亞群具有調(diào)節(jié)功能，或?qū)δ[瘤細(xì)胞具有直接的細(xì)胞毒性功能，而產(chǎn)生抗腫瘤或促腫瘤作用[24]。在以腫瘤相關(guān)組織嗜酸性粒細(xì)胞增多（TATE）為特征的致癌物誘導(dǎo)的倉(cāng)鼠OSCC模型，用抗白細(xì)胞介素-5 單克隆抗體治療，可抑制腫瘤生長(zhǎng)，嗜酸性粒細(xì)胞可能具有促腫瘤作用[25]。而本研究發(fā)現(xiàn)HPRT1 的高表達(dá)與嗜酸性粒細(xì)胞含量正相關(guān)，嗜酸性粒細(xì)胞在OSCC 中可能具有促腫瘤作用。HPRT1 參與嘌呤調(diào)節(jié)和產(chǎn)生，HPRT1 升高會(huì)產(chǎn)生更多的嘌呤。實(shí)質(zhì)性腫瘤微環(huán)境可表現(xiàn)為缺氧，而嘌呤對(duì)缺氧條件下免疫細(xì)胞活化有顯著影響，因此這也可能是HPRT1 對(duì)腫瘤微環(huán)境的作用之一。HPRT1 在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期中起重要作用，其參與的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子通路、細(xì)胞周期通路、DNA 復(fù)制等通路可能對(duì)OSCC 預(yù)后也有影響。盡管本研究確定了OSCC 中HPRT1 基因的表達(dá)水平增加，但這種現(xiàn)象的潛在機(jī)制仍不清楚，還需更深入的探討。

綜上所述，本研究結(jié)果表明HPRT1 過(guò)表達(dá)與OSCC 的進(jìn)展顯著相關(guān)。腫瘤組織中HPRT1 表達(dá)的上調(diào)可能是OSCC 診斷、預(yù)后和靶向治療的生物標(biāo)志物。然而，必須進(jìn)行進(jìn)一步的調(diào)查和臨床試驗(yàn)來(lái)闡明HPRT1 在OSCC 中的作用機(jī)制。