齊睿，牛文彥

（天津醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院免疫學系，天津 300070）

2 型糖尿病是由于胰島素作用及分泌障礙所致的以高血糖為主要特征的代謝性疾病[1]。胰島素是體內(nèi)重要的血糖負調(diào)節(jié)激素，由胰島β 細胞分泌，通過結(jié)合胰島素受體，誘導受體及隨后一系列信號蛋白如蛋白激酶B（Akt）的磷酸化。Akt 通過磷酸化Akt 底物AS160，促進葡萄糖攝取[2]。胰島素抵抗是指肝臟、肌肉和脂肪組織對胰島素的反應降低，胰島素信號通路受損，促進葡萄糖轉(zhuǎn)運的作用減弱，被認為是2 型糖尿病的常見病因[3]。炎癥是肥胖所致的2型糖尿病和胰島素抵抗的原因之一，肥胖會增加循環(huán)中飽和脂肪酸含量，激活抑制蛋白（IκB）激酶（IKK）/核因子-κB（NF-κB）促炎途徑，NF-κB 介導通路的激活會刺激促炎細胞因子的表達，如白細胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α），它們會干擾胰島素信號通路，在胰島素抵抗和2 型糖尿病的發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4]。骨骼肌是胰島素作用的重要靶組織，是機體消耗利用葡萄糖的重要外周組織，攝取80%餐后血糖，對維持血糖穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用，骨骼肌代謝失調(diào)嚴重影響全身葡萄糖代謝和胰島素敏感性[5]。

雄激素由性腺和腎上腺產(chǎn)生，由類固醇轉(zhuǎn)化為雄激素前體脫氫表雄酮，經(jīng)過類固醇脫氫酶轉(zhuǎn)化為睪酮，再經(jīng)5α-還原酶轉(zhuǎn)化為最有效的雄激素雙氫睪酮（DHT）[6]。雄激素參與糖、脂和蛋白質(zhì)代謝，在肥胖等代謝性疾病中發(fā)揮作用[7]，1/3 的肥胖或糖尿病男性游離睪酮和生物可利用睪酮濃度低于正常水平[8]。骨骼肌是雄激素直接作用的靶組織，可以促進骨骼肌細胞的增殖和分化，提高肌肉質(zhì)量、強度和骨密度[9-11]。而關于雄激素與骨骼肌胰島素敏感性及炎癥之間的關系仍不明確，本研究旨在探討DHT在體外對PA 誘導的C2C12 細胞胰島素抵抗及炎癥分子的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 小鼠骨骼肌細胞株C2C12（美國ATCC公司），DMEM 培養(yǎng)基（美國GIBO 公司），胎牛血清（以色列Bioind 公司），馬血清（以色列Bioind 公司），牛血清白蛋白（中國鼎國生物技術公司），棕櫚酸（美國Sigma 公司），雙氫睪酮（中國Selleck 公司），Trizol 裂解液（美國Ambion），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京TransGen Biotech 有限公司），實時熒光定量RT-PCR Mix（北京TransGen Biotech 有限公司），羅氏96 實時熒光定量PCR 儀，磷酸化Akt 抗體、磷酸化AS160抗體、磷酸化IKK 抗體、磷酸化NF-κB 抗體（美國CST 公司），IL-6 抗體（Affinity 公司），TNF-α 抗體（萬類生物公司），actinin1 抗體（美國Sigma 公司），β-actin 抗體（中國Abclonal 公司），耦聯(lián)HRP 的山羊抗兔抗體和耦聯(lián)HRP 的山羊抗鼠抗體（美國JacksonImmuno Research 公司），增強化學發(fā)光底物檢測試劑盒（美國Millipore 公司），Tannon-5200 化學發(fā)光成像系統(tǒng)（北京原平皓生物技術有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與處理 C2C12 細胞用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM 高糖培養(yǎng)基接種于細胞培養(yǎng)板中，在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，待細胞密度達90%時，換含5%馬血清（HS）的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細胞融合分化為肌管后，分別用BSA、300 μmol/L PA 或300 μmol/L PA+1 μmol/LDHT孵育C2C12 細胞24 h，加或不加100 nmol/L 胰島素刺激10 min。

1.2.2 RNA 的提取和實時熒光定量PCR 不同條件孵育C2C12 細胞的12 孔板棄去上清，冷1×PBS 清洗兩遍，吸凈，每孔加入500 μL Trizol 裂解細胞并收集到RNase free 管中，加入100 μL 氯仿，移液槍吹打并劇烈震蕩15 s 充分混勻后室溫靜置5 min，12 000 r/min 4℃離心15 min，可見樣品分為4 層，底層為紅色有機相，中、上層為水相，中間層為白色DNA 層，上層為透明RNA 層，將上層透明RNA 吸至新的RNase free 管。加入與上清液等體積的異丙醇，充分混勻，室溫靜置10 min 后，12 000 r/min，4℃離心10 min，使RNA 從水相中沉淀。離心后可見沉淀于管底的白色膠樣RNA，棄掉上清，加入75%乙醇（DEPC 水配置），8 000 r/min，4℃離心5 min，再棄去乙醇，重復兩遍后，吸干乙醇。乙醇揮發(fā)后，加入25 μL 無酶水，金屬浴58℃，2 min 助溶。使用分光光度計Nanodrop 2000 測RNA 濃度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 并進行5倍稀釋，按照cDNA 4 μL，上下游引物各0.5 μL，2×TransStart Tip Green Qpcr SuperMix10 μL，無酶水補至20 μL 的體系加入八連排并置于羅氏96 實時熒光定量PCR 儀反應。具體的逆轉(zhuǎn)錄程序如下：預變性：95℃，300 s；設置45 個循環(huán)：變性：95℃，20 s，退火：60℃，20 s，延伸：72℃，20 s；溶解：95℃，10 s，65℃，60 s，97℃，1s；冷卻：37℃，30 s。程序結(jié)束后拷貝數(shù)據(jù)，并用LightCycler 96 system 軟件整理數(shù)據(jù)。根據(jù)qPCR 得出的熒光曲線的Ct 值，以β-actin 基因為內(nèi)參，ΔCt=Ct-目的基因-Ct-β-actin，ΔΔCt=實驗組ΔCt 值-對照組ΔCt 值，用2-ΔΔCt 計算結(jié)果。實驗重復3 次。所用到的引物序列見表1。

表1 擴增反應所需引物序列Tab 1 Primer sequences for amplification reaction

1.2.3 Western 印跡 配置RIPA 裂解液（含蛋白酶抑制劑Na3VO41 mmol/L，NaF 0.5 mmol/L，PIC 11 μmol/L和PMSF 200 μmol/L）。棄去不同條件孵育C2C12細胞的12 孔板上清，用冷1×PBS 緩沖液清洗兩遍，用細頭吸管吸凈，加入200 μL RIPA 裂解液，置于冰上20 min，并收集。預冷離心機至4℃，13 000 r/min，離心20 min，取上清。將5×LSB 與上清液按1∶4 的比例混勻，金屬浴65℃加熱15 min。制備7.5%的聚丙烯酰胺凝膠，待膠凝固后，正確安置在電泳槽中，每孔加入50 μg 的樣品分離蛋白，根據(jù)目的蛋白的分子量確定電泳何時結(jié)束。按照“三明治”的模式將海綿-濾紙-凝膠-PVDF 膜-濾紙-海綿放置在轉(zhuǎn)膜夾中，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)到PVDF 膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用3%牛血清白蛋白室溫封閉2 h，一抗（β-actin按1∶10 000 比例，actinin1 按1∶5 000 比例，Akt、AS160、IKK、NF-κB、IL-6 按1∶1 000 比例，TNF-α按1∶500 比例，用1%BSA 稀釋配置）4℃過夜孵育，次日用TBST 緩沖液洗4 次，每次10 min，然后使用偶聯(lián)辣根過氧化物酶標記二抗（按1∶5 000 比例，用1%BSA 稀釋配置）室溫孵育2 h，再用TBST 緩沖液洗4 次，每次10 min。最后ECL 顯色后曝光，Image J 進行定量分析。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用GraphPad Prism6 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，符合正態(tài)分布的計量資料均以±sx表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 DHT對C2C12細胞胰島素信號蛋白的影響 Western 印跡檢測DHT 對C2C12 細胞胰島素信號通路的作用（圖1），與BSA 孵育相比，PA 孵育后胰島素刺激的Akt S473 和AS160 S318 均顯著降低（均P＜0.05）。PA 和DHT 混合孵育后胰島素刺激的Akt S473和AS160 S318 磷酸化水平顯著升高（F=59.29、7.829，均P＜0.05）。

圖1 C2C12 細胞中Akt 和AS160 磷酸化水平Fig1 The phosphorylation levels of Akt and AS160 in C2C12 cells

2.2 DHT 對C2C12 細胞炎癥信號通路相關蛋白的影響 Western 印跡檢測DHT 對C2C12 細胞IKK/NF-κB 信號通路的作用（圖2），與BSA 孵育相比，PA 孵育后，IKKα/β pS176/177 和NF-κBp65 S536磷酸化水平顯著升高（均P＜0.05）；而PA 和DHT 混合孵育后，IKKα/β pS176/177 和NF-κB p65 S536磷酸化水平相比于PA 孵育后顯著降低（F=13.94、10.65，均P＜0.05）。

圖2 C2C12 細胞中IKKα/β pS176/177 和NF-κBp65S536磷酸化水平Fig 2 Phosphorylation levels of IKKα/β pS176/177 and NF-κB p65 S536 in C2C12 cells

2.3 DHT 對C2C12 細胞促炎細胞因子的影響qPCR 和Western 印跡分別檢測PA 及DHT 對C2C12 細胞促炎細胞因子IL-6 和TNF-α mRNA和蛋白水平的影響，結(jié)果見圖3，與BSA 孵育相比，PA 孵育后IL-6 和TNF-α mRNA 水平明顯升高（均P＜0.01）；而PA 和DHT 混合孵育后顯著降低了IL-6 和TNF-α mRNA 水平（F=13.71、12.77，均P＜0.05）。同時，與BSA 孵育相比，PA 孵育后IL-6 和TNF-α 蛋白表達明顯升高（均P＜0.01）；而PA 和DHT 混合孵育后IL-6 和TNF-α 蛋白表達降低（F=10.82、15.14，均P＜0.05）。

圖3 C2C12 細胞中IL-6 和TNF-α 的表達Fig 3 The expression of IL-6 and TNF-α in C2C12 cells

3 討論

越來越多的研究證明，雄激素缺乏與能量失衡、胰島素敏感性降低和血脂異常有關。在肥胖模型db/db 小鼠中，血液中雄激素水平的降低會顯著加重葡萄糖耐受不良，而外源性雄激素的補充可降低空腹胰島素水平，改善胰島素敏感性[12]。雄激素缺乏會使男性更易患代謝綜合征，容易導致男性胰島β細胞功能障礙和衰竭，而補充雄激素通過增強胰高血糖素樣肽（GLP）-1 的促胰島素作用，增強葡萄糖刺激的胰島素分泌[13]。雄激素可以通過磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMPK）/過氧化物酶體增殖物激活受體γ 共激活因子（PGC）-1α/核呼吸因子（NRF）-1改善高脂誘導的線粒體功能障礙和能量代謝紊亂，并通過激活Akt 信號通路，緩解高脂誘導的大鼠肝臟胰島素抵抗[14]；通過肝激酶B1（LKB1）/AMPK 信號通路促進3T3-L1 脂肪細胞中葡萄糖攝取[15]；而關于雄激素對骨骼肌胰島素抵抗的影響尚不明確。因此，本研究選擇C2C12 小鼠骨骼肌細胞體外探討。

PA 在細胞內(nèi)水平超過其線粒體氧化水平，會轉(zhuǎn)化為有害的脂質(zhì)如二酰甘油和神經(jīng)酰胺。二酰甘油會激活蛋白激酶C（PKC），PKC 會直接或通過激活IKK/NF-κB 信號通路介導炎癥，間接損害胰島素信號通路，誘導胰島素抵抗[16-18]。本研究用PA 孵育C2C12 細胞后，胰島素作用下的Akt、AS160 磷酸化水平降低，胰島素作用受損，表明細胞發(fā)生胰島素抵抗。而在DHT 孵育后，胰島素作用下的Akt 和AS160磷酸化水平升高，逆轉(zhuǎn)了PA 對胰島素作用下的Akt和AS160 的抑制作用，提示DHT 可以改善PA 誘導的C2C12 細胞胰島素抵抗。

炎癥與胰島素抵抗和糖尿病密切相關。在高脂環(huán)境中，骨骼肌細胞也會發(fā)生炎癥反應，主要表現(xiàn)為細胞的促炎信號通路激活，促炎細胞因子分泌增加等，進而影響胰島素敏感性。研究報道，DHT 具有抗炎作用[19]，可以抑制人瞼板腺上皮細胞促炎基因的表達[20]；緩解小鼠燒傷引起的炎癥，減少傷口浸潤巨噬細胞的數(shù)量，加速炎癥的消退促進傷口愈合[21]。因此，本研究進一步檢測了炎癥相關分子的表達。PA 孵育后，IKK、NF-κB 磷酸化水平升高，促炎細胞因子IL-6、TNF-α 的表達增加，表明細胞發(fā)生炎癥。而DHT 孵育后，C2C12 細胞中IKK、NF-κB 磷酸化明顯降低，促炎細胞因子IL-6、TNF-α mRNA和蛋白表達降低，抑制了PA 對C2C12 細胞的促炎作用，提示DHT 可能通過抑制炎癥信號逆轉(zhuǎn)PA 誘導的骨骼肌細胞胰島素抵抗。

綜上所述，本研究證明了DHT 通過Akt/AS160途徑可以改善PA 誘導的C2C12 細胞的胰島素抵抗，其機制可能與DHT 抑制IKK/NF-κB 通路，減少促炎細胞因子的表達有關。