陳 婷，陳亞萍，許曉麗，曹亞俊，南麗紅

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

急性肝損傷是誘發(fā)肝硬化、肝癌的重要使動因素，具有病因多、發(fā)病急的特點，若疾病沒有得到及時治療會逐漸加重，發(fā)展為具有高致死率的急性肝衰竭［1］。炎癥反應(yīng)在肝損傷發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，而核轉(zhuǎn)錄因子kappa B（NF-κB）是細(xì)胞內(nèi)炎癥信號傳遞最重要的核轉(zhuǎn)錄因子，在肝損傷發(fā)生發(fā)展中，NF-κB 被磷酸化后激活，暴露出核定位信號，從而啟動下游腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）等炎癥因子轉(zhuǎn)錄表達(dá)，此外，NF-κB 還能調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)趨化蛋白-1（MCP-1）以及細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）［2-3］，從而增加炎癥介質(zhì)釋放，放大炎性反應(yīng)，進(jìn)一步誘發(fā)或加重肝損傷?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明：大黃具有較好的保肝作用［4］，其中大黃主要活性成分大黃素甲醚和蘆薈大黃素均可發(fā)揮對急性肝損傷的保護(hù)作用［5-6］，但大黃素甲醚為多羥基的蒽醌類物質(zhì)，口服后血藥濃度較低，而以大黃素甲醚為苷元的大黃素甲醚-8-Oβ-D-葡萄糖苷（PMG）是含蒽醌結(jié)構(gòu)的糖苷類化合物，口服后血藥濃度相對較高［7-8］，但其對急性肝損傷是否具有保肝作用未見相關(guān)報道，故本實驗通過復(fù)制CCl4致小鼠急性肝損傷模型，探討PMG 的保肝作用及可能機(jī)制，為進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用中藥大黃提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材 料

1.1 實驗動物 SPF 級雄性ICR 小鼠60 只，體質(zhì)量（18±2）g，購于上海斯萊克實驗動物責(zé)任有限公司，許可證號為：SCXK（滬）2017-0005，在福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF 級飼養(yǎng)室飼養(yǎng)1 周，合格證號為：SYXK（閩）2019-0007。

1.2 藥物與試劑 PMG 粉末（成都普思生物科技股份有限公司，CAS 號：26296-54-8，純度≥98%）；聯(lián)苯雙酯滴丸（北京協(xié)和藥廠，批號：201201）；四氯化碳（CCl4，羅恩試劑，批號：RH280952）；二甲基亞砜（DMSO，貨號：67-68-5）、CMC-Na（貨號：9004-32-4）均購自北京索萊寶科技有限公司；花生油溶液（品牌：胡姬花，批號：20210409）；谷丙轉(zhuǎn)氨酶試劑盒（ALT，貨號：C009-2-1）、谷草轉(zhuǎn)氨酶試劑盒（AST，貨號：C0010-2-1）均購自南京建成生物工程研究所；TNF-α 一抗（貨號：CPA2174）、IL-6 一抗（貨號：CPA4914）均購自英國Cohesion Biosciences公司；NF-κBp65 一抗（美國CST 公司，貨號：8242）；免疫組化試劑盒（貨號：SA1020）、DAB 顯色試劑盒（貨號：AR1027-3）均購自武漢博士德生物工程有限公司；Trizol 試劑（貨號：R401-01）、ChamQ SYBR qPCR Master Mix 試劑盒（貨號：Q311-02）、QRT Su-perMix for qPCR（+gDNA wiper）試劑盒（貨號：R123-01）均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；所用引物均由Sangon Biotech 公司根據(jù)設(shè)計合成。

1.3 主要儀器 BSA223S-CW 型分析天平（德國Sartorius 公司）；7900 HT 實時熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）；Infinite 200PRO 多功能酶標(biāo)儀（瑞士TECAN 公司）；DMi8 熒光倒置顯微鏡（德國Leica 公司）；FastPrep-24 5G 勻漿機(jī)（美國MP 公司）；HM 325石蠟切片機(jī)（美國Thermo Fisher 公司）；Centrifuge 5418 高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）。

2 方 法

2.1 實驗方法

2.1.1 藥物制備 精密稱取200 mg PMG 粉末溶于0.25 mL DMSO，震蕩混勻后加入0.5% CMC-Na 溶液將其配置成高劑量4 mg/mL PMG 混懸液，取部分高劑量PMG 混懸液按1∶1 分步稀釋為2 mg/mL及1 mg/mL PMG 混懸液。取660 mg 聯(lián)苯雙酯滴丸于研缽中磨成粉末，加入0.5%CMC-Na 溶液將其配制成30 mg/mL 聯(lián)苯雙酯混懸液。取0.1 mL CCl4分析純?nèi)芤?，加入花生油溶液配制?.5%CCl4油溶液。

2.1.2 分組與給藥 將60 只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組，模型組，低、中、高劑量組，聯(lián)苯雙酯組，每組10 只。每組小鼠每次均按照0.1 mL/10 g體質(zhì)量灌胃給藥，正常對照組和模型組灌服0.5%CMC-Na溶液，低、中、高劑量組分別灌胃1、2、4 mg/mL PMG 混懸液，聯(lián)苯雙酯組灌胃30 mg/mL 聯(lián)苯雙酯混懸液。2 次/d，連續(xù)灌胃3 d。

2.1.3 急性肝損傷模型的制備 末次給藥1 h 后，除正常對照組外，其余各組均按照0.1 mL/10 g 體質(zhì)量一次性腹腔注射0.5% CCl4油溶液，建立急性肝損傷小鼠模型。血清ALT、AST 水平明顯高于正常對照組則提示模型成功［9］。

2.1.4 取材 各組小鼠禁食不禁水16 h，摘眼球取血后處死，并分離肝組織，用預(yù)冷的生理鹽水清洗肝臟表面后，再用濾紙吸干表面液體并拍照留存。取肝左葉置于4%多聚甲醛中于4℃冰箱中固定48 h；另取肝右葉凍存于液氮中，后轉(zhuǎn)至-80℃冰箱保存。

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 肝功能指標(biāo)檢測 將血液于高速冷凍離心機(jī)（4000 r/min、4℃）中離心10 min，取上清液，根據(jù)轉(zhuǎn)氨酶試劑盒說明書檢測小鼠血清ALT、AST 水平。

2.2.2 肝組織病理形態(tài)學(xué)觀察 將固定好的肝左葉組織采用梯度脫水后，石蠟包埋，切成4 μm 薄片，進(jìn)行HE 染色，封片后通過倒置熒光顯微鏡200倍鏡下觀察組織病理形態(tài)并攝片。

2.2.3 免疫組織化學(xué)法檢測肝組織中NF-κBp65、TNF-α、IL-6 蛋白表達(dá) 每組隨機(jī)選取6 只小鼠肝左葉的石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷液，室溫反應(yīng)45 min；采用微波輻射法修復(fù)抗原，滴加5%BSA，室溫封閉1 h；除去封閉液，滴加相應(yīng)一抗（NF-κBp65 稀釋比為1∶400，TNF-α、IL-6 稀釋比均為1∶50），4℃孵育過夜；滴加二抗和SABC，各孵育1 h；DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片，于倒置熒光顯微鏡400 倍鏡拍攝，NF-κB、TNF-α、IL-6 陽性表達(dá)部位分別是細(xì)胞核、細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)［10-12］。結(jié)果判定：呈棕黃染色為陽性表達(dá)。應(yīng)用Image J 圖像分析軟件統(tǒng)計各組每張切片中5 個不同部位的陽性細(xì)胞表達(dá)。

2.2.4 RT-PCR 法檢測肝組織中ICAM-1、MCP-1 mRNA 相對表達(dá)量 每組隨機(jī)選取6 只小鼠，取肝右葉組織約100 mg 置于含1 mLTrizol 的勻漿管中，按照gDNA wiper 試劑盒說明提取純化RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后進(jìn)行熒光實時定量PCR 檢測（SYBR熒光染料法），反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃10 s，60℃30 s，40 個循環(huán)；95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。反應(yīng)結(jié)束后以GAPDH 為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法 計 算ICAM-1、MCP-1 mRNA 相 對 表 達(dá)量。實驗所用引物序列見表1。

表1 引物序列

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行分析。計量資料屬正態(tài)分布的以（xˉ±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊者采用LSD 檢驗，方差不齊者采用Games-Howell 檢驗。

3 結(jié) 果

3.1 各組小鼠血清ALT、AST水平比較 見表2。

表2 各組小鼠血清ALT、AST 水平比較（xˉ±s） U/L

3.2 各組小鼠肝臟形態(tài)肉眼觀察比較 正常對照組肝臟呈暗紅色，表面光滑平整，質(zhì)地柔軟，未見明顯異常；模型組肝臟呈黃白色，表面有明顯的點狀壞死灶，質(zhì)地較脆；各劑量組和聯(lián)苯雙酯組小鼠肝臟顏色趨近正常，質(zhì)地較軟，點狀壞死灶明顯減少。見圖1。

圖1 各組小鼠肝臟形態(tài)肉眼觀察圖

3.3 各組小鼠肝組織病理形態(tài)變化比較 HE 結(jié)果顯示：正常對照組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰可見，肝小葉以及肝細(xì)胞完整；模型組小鼠肝組織中央靜脈周圍出現(xiàn)大量肝細(xì)胞壞死及炎性細(xì)胞浸潤，肝小葉結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞；與模型組比較，各劑量組和聯(lián)苯雙酯組肝組織病理損傷均有一定程度的改善。以上結(jié)果提示PMG 能顯著降低小鼠急性肝損傷程度。見圖2。

圖2 顯微鏡下各組小鼠肝組織病理形態(tài)變化圖（HE，×200）

3.4 各組小鼠肝組織中NF-κBp65、TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)比較 見表3 和圖3～圖5。

表3 各組小鼠肝組織中NF-κBp65、TNF-α、IL-6 蛋白表達(dá)比較（xˉ±s）

圖3 各組小鼠肝組織中NF-κBp65 免疫組化圖（×400）

圖4 各組小鼠肝組織中TNF-α 免疫組化圖（×400）

圖5 各組小鼠肝組織中IL-6 免疫組化圖（×400）

3.5 各組小鼠肝組織中ICAM-1、MCP-1 mRNA 相對表達(dá)量比較 見表4。

表4 各組小鼠肝組織中ICAM-1、MCP-1 mRNA 相對表達(dá)量比較（xˉ±s）

4 討 論

肝臟作為人體內(nèi)最大的實質(zhì)性器官，具有物質(zhì)合成分解代謝、生物的轉(zhuǎn)化和內(nèi)外分泌等多種功能，故肝臟疾病是臨床常見的危害人類健康的疾病，一直是臨床研究的重點，而急性肝損傷是幾乎所有肝臟疾病的始端［13］。CCl4是一種經(jīng)典的肝毒性物質(zhì)，一方面能夠破壞肝細(xì)胞，使細(xì)胞膜通透性改變，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ALT、AST 大量進(jìn)入血液；另一方面可導(dǎo)致肝臟組織結(jié)構(gòu)紊亂、肝細(xì)胞壞死和炎癥細(xì)胞浸潤等嚴(yán)重病理改變［14］：因此本實驗采用CCl4誘導(dǎo)建立穩(wěn)定的急性肝損傷動物模型。大黃具有清熱瀉火、涼血解毒、利濕退黃等功效，自古用作肝臟疾病的治療。本次實驗結(jié)果表明PMG 作為大黃的活性成分之一，對CCl4致小鼠急性肝損傷具有較好的保護(hù)作用。

TNF-α、IL-6 是炎癥反應(yīng)中主要的促炎因子，在急性肝損傷中發(fā)揮重要作用。TNF-α 表達(dá)過多可以直接刺激半胱氨酸蛋白酶（Caspase）家族激活，介導(dǎo)肝臟炎性反應(yīng)，導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死［15］；IL-6是由單核巨噬細(xì)胞分泌的一種多功能炎性因子，當(dāng)肝臟受損時，過量的IL-6 釋放導(dǎo)致肝細(xì)胞大量壞死，進(jìn)而發(fā)展為肝纖維化或肝硬化［16］。ICAM-1 是肝臟炎性疾病發(fā)展中重要的黏附分子，在多種細(xì)胞表面表達(dá)，參與白細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，造成肝細(xì)胞損傷，從而促進(jìn)肝臟炎性反應(yīng)［17］。MCP-1是一種具有誘導(dǎo)和趨化功能的細(xì)胞因子，在急性肝損傷發(fā)生發(fā)展中，MCP-1 能夠誘導(dǎo)單核細(xì)胞浸潤到肝臟受損部位，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)［18］。

NF-κB 是調(diào)控炎癥反應(yīng)重要的核心因子，通常與其抑制蛋白（Inhibitory-κB，I-κB）結(jié)合為三聚體形式。在肝損傷發(fā)生、發(fā)展中，I-κB 磷酸化并降解，使NF-κB 暴露出核定位信號，促使NF-κB 由胞漿移位至胞核內(nèi)。研究發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-6、MCP-1以及ICAM-1 等炎癥相關(guān)因子均含有κB 的結(jié)合位點，可結(jié)合移位至胞核的NF-κB，其亞基p65 含有轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域，能直接作用于轉(zhuǎn)錄元件從而激活一系列炎癥相關(guān)因子基因的轉(zhuǎn)錄過程，使其表達(dá)增多［19-20］。

本次實驗結(jié)果表明：CCl4致急性肝損傷模型小鼠肝組織中可觀察到NF-κB的激活，促進(jìn)了TNF-α、IL-6、ICAM-1、MCP-1 的表達(dá)，從而產(chǎn)生大量的炎性細(xì)胞，侵潤于損傷的肝組織處，導(dǎo)致急性肝損傷炎性反應(yīng)過程的發(fā)展和加重，從而誘發(fā)或加重肝損傷。PMG 保護(hù)性干預(yù)后，肝組織中TNF-α、IL-6 蛋白表達(dá)和ICAM-1、MCP-1 mRNA 相對表達(dá)量均明顯減少，且細(xì)胞核NF-κBp65 蛋白表達(dá)亦明顯少于模型組，提示PMG 可能通過抑制NF-κB 的活化與核移位，繼而減弱了TNF-α、IL-6、ICAM-1、MCP-1等的生物學(xué)效應(yīng)，從而達(dá)到保護(hù)肝組織的作用。低、高劑量組血清AST 水平雖明顯低于聯(lián)苯雙酯組，但各劑量組血清ALT 水平和肝組織中的NFκBp65、TNF-α、IL-6 蛋白表達(dá)及ICAM-1、MCP-1 mRNA 相對表達(dá)量與聯(lián)苯雙酯組比較均無統(tǒng)計學(xué)意義，提示PMG 的保肝作用與聯(lián)苯雙酯近似。