王世聰

（片仔癀藥業(yè)股份有限公司，福建 漳州 363000）

心肌梗死（簡稱心梗）臨床定義為長期缺血導(dǎo)致的心肌細(xì)胞死亡，患者具有高病死亡率和高殘疾率的特點(diǎn)［1-4］。心梗導(dǎo)致心臟收縮功能受損、心肌肥大、纖維化和自噬活動改變，最終導(dǎo)致左心室功能的障礙［2］，臨床常使用抗血栓藥物、冠狀動脈介入或搭橋手術(shù)對其進(jìn)行治療［3-4］。中醫(yī)療法能多途徑降低心梗后的心肌損傷，調(diào)節(jié)情緒，減輕痛苦，提高生活質(zhì)量，同時對心梗有預(yù)防作用，降低急性心梗的發(fā)病率［5］。心舒寶片由丹參、白芍、刺五加、郁金、山楂組成，具有活血化瘀、益氣止痛的功效，臨床常用于治療冠心病、心絞痛、高血壓等心血管疾病［6］，但對心梗的治療報道較少。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是中藥治療機(jī)制研究的重要工具之一，能夠揭示藥物、疾病、靶點(diǎn)與通路之間的復(fù)雜關(guān)系［7-8］。為此，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選心舒寶片治療心梗的活性成分及有效作用靶點(diǎn)，對心舒寶片干預(yù)心梗的潛在機(jī)制進(jìn)行探討，并應(yīng)用動物模型來驗(yàn)證潛在靶點(diǎn)，為心舒寶片臨床新應(yīng)用提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 心舒寶片活性成分與作用靶點(diǎn)的獲取 基于中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺（TCMSP）［9］和本草組鑒平臺HERB平臺［10］，通過口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30% 和類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 篩選心舒寶的組成中藥（丹參、白芍、刺五加、郁金、山楂）的活性成分，構(gòu)建心舒寶片活性成分?jǐn)?shù)據(jù) 庫。通 過PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫對活性成分驗(yàn)證并轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)的Canonical SMILES 格式，隨后導(dǎo)入Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫預(yù)測藥物作用靶點(diǎn)。

1.2 疾病靶點(diǎn)和有效作用靶點(diǎn)的收集 利用Dis-GeNET、DrugBank 數(shù)據(jù)庫平臺，以“Myocardial infarction”為關(guān)鍵詞收集心梗的疾病靶點(diǎn)，構(gòu)建心梗疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫。利用Venny 2.0 數(shù)據(jù)庫（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）獲取藥物作用靶點(diǎn)與心梗疾病靶點(diǎn)的交集，作為心舒寶片治療心梗的有效作用靶點(diǎn)。

1.3 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 將心舒寶片治療心梗的有效作用靶點(diǎn)分別輸入STRING11.0 數(shù)據(jù)庫平臺，設(shè)置物種為“H.sapiens”，并導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0 軟件，運(yùn)用Network Analyzer 功能分析，篩選緊密度（closeness）和中介數(shù)（betweenness）大于中位數(shù)，度值（degree）大于各節(jié)點(diǎn)中位數(shù)3 倍的靶點(diǎn)為核心作用靶點(diǎn)。繪制心舒寶片與心梗有效作用靶點(diǎn)的相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，并對PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析。

1.4 KEGG 富集分析 將心舒寶片治療心梗的有效作用靶點(diǎn)放入Metascape 平臺（http：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1），提交后將輸入物種和分析物種選擇為“H.sapiens”，設(shè)置P＜0.01，對有效作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 富集分析，按照聚類結(jié)果進(jìn)行排序，篩選P值排名靠前的20 條通路，進(jìn)行結(jié)果可視化。

1.5 “中藥-活性成分-有效作用靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)可視化 將心舒寶的中藥、活性成分、有效作用靶點(diǎn)及通路4 個方面作為節(jié)點(diǎn)，建立彼此對應(yīng)關(guān)系，導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0 軟件，構(gòu)建“中藥-活性成分-有效作用靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行可視化展示。

1.6 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.6.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性C57BL/6J 小鼠60 只，6～8周齡，體質(zhì)量21～25 g，由斯貝福生物技術(shù)有限公司提供，動物合格證為SCXK（京）2019-0010，在溫度（25±2）℃、濕度（60±5）%、12/12 h 晝/夜循環(huán)的環(huán)境下，適應(yīng)性飼養(yǎng)3～5 d。

1.6.2 藥品及試劑 心舒寶片（漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司，產(chǎn)品批號：2011024）；TTC 試劑（北京西濃科技有限公司）。

1.6.3 儀器 Vevo770 高分辨率小動物超聲心動檢測系統(tǒng)（加拿大Visual Sonics 公司）。

1.6.4 心舒寶片的制備 實(shí)驗(yàn)所用的心舒寶片為黃棕色片劑，研缽研成粉末，使用蒸餾水進(jìn)行配置，以10、20、40 mL 蒸餾水分別溶解1 片心舒寶片，得到52、26、13 mg/mL 心舒寶片溶液。

1.6.5 小鼠心梗模型的制備 采用隨機(jī)數(shù)字表法將C57BL/6J 小鼠分為假手術(shù)組8 只和造模組52 只。使用1%戊巴比妥鈉按0.1 mL/20 g 體質(zhì)量麻醉小鼠，造模組采用行左前降支冠脈結(jié)扎方法制備心梗模型，假手術(shù)組則采用同法手術(shù)但不結(jié)扎冠狀動脈。

1.6.6 分組與給藥 造模成功后將造模組隨機(jī)分為模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組各13 只。各組均按0.1 mL/10 g 體質(zhì)量灌胃，低、中、高劑量組分別以13、26、52 mg/mL 心舒寶片溶液（相當(dāng)于臨床人日用量的1/2、1、2 倍），假手術(shù)組及模型組以蒸餾水，術(shù)后第2 天灌胃，每日1 次，連續(xù)干預(yù)4 周。

1.6.7 心臟超聲心動圖檢測 采用小動物超聲心動檢測系統(tǒng)檢測各組小鼠的心功能指標(biāo)，包括收縮末期左室內(nèi)徑（LVIDS）、舒張末期左室內(nèi)徑（LVIDD）、計(jì)算射血分?jǐn)?shù)（EF）和短軸縮短率（FS）。

1.6.8 心肌梗死面積的測定 干預(yù)4 周后，使用1%戊巴比妥鈉按0.1 mL/20 g 體質(zhì)量麻醉小鼠，取出心臟組織，置于生理鹽水中，沖洗除去多余的血液，用濾紙吸干液體后，置于冰箱-20℃冷凍約10～15 min 后，將心臟切成厚度為1 mm 左右的薄片若干，經(jīng)TTC 溶液染色后［11］，進(jìn)行掃描拍照。

1.6.9 qPCR 實(shí)驗(yàn) qPCR 檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子A（VEGFA）、腫瘤壞死因子（TNF1a）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）的表達(dá)，收集“1.6.8”項(xiàng)中小鼠心臟組織，Trizol 提取總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書制備cDNA 后，以SYBRGreen 熒光染料試劑盒和PCR 儀器進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR 擴(kuò)增。用2-△△ct法測定目的基因相對表達(dá)量［12］。

1.6.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析。方差齊時，兩兩比較采用LSD 法；方差不齊，則采用秩和檢驗(yàn)。使用GraphPad Prism 6.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的圖形繪制。

2 結(jié) 果

2.1 心舒寶活性成分和作用靶點(diǎn) 通過TCMSP 和HERB 數(shù)據(jù)庫收集，經(jīng)OB 和DL 值篩選，得到活性成分97 個，其中丹參65 個，白芍13 個，郁金15 個，山楂6 個，刺五加3 個。根據(jù)OB 值排序前5 的活性成分信息見表1。藥物的作用靶點(diǎn)共1 481 個，去重后剩747 個，平均每個活性成分對應(yīng)7.70（747/97）個靶點(diǎn)，說明心舒寶片是通過多成分、多靶點(diǎn)發(fā)揮整體治療作用的，心舒寶片的活性成分與作用靶點(diǎn)數(shù)量見表2。

表1 心舒寶片活性成分篩選列表（僅列每位藥材OB 值排名前5 的活性成分）

表2 心舒寶片的中藥活性成分與作用靶點(diǎn)數(shù)量

2.2 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析 心梗涉及1 837 個靶點(diǎn)，心舒寶片作用靶點(diǎn)與心梗疾病靶點(diǎn)的交集為307 個有效作用靶點(diǎn)。心舒寶片治療心梗的有效作用靶點(diǎn)涉及TNF、AKT1、VEGFA、IL1B、EGFR、MAPK3、STAT3、HIF1A、CASP3、HSP90AA1 等29 個核心作用靶點(diǎn)，見圖1 和圖2。圖中節(jié)點(diǎn)越大，靶點(diǎn)度值越大，說明該靶點(diǎn)在治療心梗的作用可能越重要。

圖1 心舒寶片治療心梗的有效作用靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)

2.3 KEGG 富集分析 有效作用靶點(diǎn)富集到131條KEGG 通路，其中包括花生四烯酸代謝、NF-κB信號通路、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、動脈粥樣硬化等。列出P值排名前20 條的信號通路作為KEGG 圖進(jìn)行展示，見圖2。

圖2 KEGG 富集分析結(jié)果（前20 名）

2.4 “中藥-活性成分-有效作用靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)可視化 構(gòu)建“中藥-活性成分-有效作用靶點(diǎn)-通路”的網(wǎng)絡(luò)模型，顯示該網(wǎng)絡(luò)涉及5 個中藥，67 個化學(xué)成分，109 個靶點(diǎn)，7 條通路，成分包括槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素等，靶點(diǎn)有AKT1、BCL2L1、EGFR、PIK3CA、MAPK1、MAPK3、CASP3、IL1B 等，涉及MAPK 信號通路、NF-κB 信號通路等，見圖3。圖3 顯示：同一活性成分對應(yīng)多個靶點(diǎn)，多個靶點(diǎn)對應(yīng)同一通路，體現(xiàn)了心舒寶片的多成分、多靶點(diǎn)、多通路的作用特點(diǎn)。

圖3 “中藥-活性成分-有效作用靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)可視化展示圖

2.5 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.5.1 模型小鼠心功能指標(biāo)與心肌梗死面積比較 與假手術(shù)組比較，模型組小鼠EF和FS下降（P＜0.01），LVIDS 和LVIDD 均增加（P＜0.01）；與模型組比較，高劑量組EF 和FS 升高（P＜0.05），低劑量組FS 升高（P＜0.05），各給藥組LVIDS 和LVIDD 均有下降趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖4。同時，與假手術(shù)組比較，模型組梗死面積明顯增大，表明心梗模型造模成功；與模型組比較，各給藥組心肌梗死面積縮小，表明心舒寶片能改善心肌損傷，減少心肌梗死面積。

圖4 心舒寶片對各組小鼠心功能指標(biāo)的影響

2.5.2 qPCR 驗(yàn)證 隨機(jī)選取心舒寶作用的核心作用靶點(diǎn)和通路中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)分子VEGFA、TNF1a、AKT1、MAPK3，分別對各組小鼠心臟組織進(jìn)行mRNA的提取qPCR 的表達(dá)趨勢的驗(yàn)證。引物設(shè)計(jì)和合成參見表3，表達(dá)趨勢的結(jié)果見圖5。通過qPCR 驗(yàn)證，心舒寶片給藥后VEGFA、TNF1a、AKT1、MAPK3經(jīng)One ANOVA 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均出現(xiàn)回調(diào)趨勢，證明了預(yù)測靶點(diǎn)的穩(wěn)定和可靠性。

圖5 qPCR 驗(yàn)證各組小鼠4 個靶點(diǎn)的表達(dá)趨勢圖

表3 篩選靶點(diǎn)qPCR 驗(yàn)證的引物設(shè)計(jì)與合成

3 討 論

心血管疾病是中老年的常見病和多發(fā)病，而心梗是最主要的疾病之一［13］。本研究主要探討心舒寶片的作用機(jī)制，心舒寶片中的丹參、山楂、郁金、刺五加、白芍均具有心肌保護(hù)作用［14］：丹參活血化瘀，擴(kuò)張冠狀動脈，抑制血栓形成，參與心肌修復(fù)，丹參酮ⅡA 可改善血瘀型大鼠急性心梗后的心功能［15-17］；山楂有機(jī)酸有抗心律失常、降血壓及調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等作用［18］；郁金能提高心肌組織的耐缺氧能力［19］；刺五加能抑制急性心梗大鼠的心室重構(gòu)，抑制心肌細(xì)胞凋亡［20］，刺五加葉皂苷可增強(qiáng)抗氧化酶活性，減少自由基對心肌的氧化損傷，對急性心肌缺血發(fā)揮保護(hù)作用［21］；白芍能改善心肌缺血大鼠組織中抗氧化酶的活性，抑制炎癥反應(yīng)［22］，白芍總苷能抑制Wnt3a 表達(dá)，影響Wnt/βcatenin信號通路，從而保護(hù)性抑制心肌細(xì)胞凋亡［23］。心舒寶治療心肌梗死的療效可能源于其成分的潛在作用。

本研究結(jié)果表明VEGFA、AKT1、TNF、MAPK3、STAT3、CASP3、IL1B、MMP9 等靶點(diǎn)可能在心舒寶片治療心梗的過程中發(fā)揮重要作用［24］。當(dāng)心肌缺血時，激活炎性細(xì)胞釋放TNF-α 及IL-6 等因子，增強(qiáng)炎癥細(xì)胞的聚集與浸潤［25］。CASP3 在細(xì)胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)中處于重要地位［26］。粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）能激活STAT3 來增加心肌梗死邊界區(qū)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量并誘導(dǎo)心肌中血管內(nèi)皮生成因子（VEGF）的表達(dá)，促進(jìn)血管生成，抑制心肌細(xì)胞凋亡，有利于心梗后心肌重塑［27-28］?；|(zhì)金屬蛋白酶家族（MMPs）在促進(jìn)動脈粥樣硬化斑塊與血栓形成中發(fā)揮重要作用［29］，MMP-9 加速形成不穩(wěn)定型斑塊，參與心臟基質(zhì)的降解，加快心室重塑［30］。血清中MMP-9 可作為評估急性心梗后心律失常的標(biāo)志物［31］。

心肌梗死的病理進(jìn)程中免疫失調(diào)及炎癥反應(yīng)增加是其關(guān)鍵特征之一［32］。NF-κB 是急性心梗期間心臟組織中的炎性因子［33］，NF-κBp65 是NF-κB的主要反式激活轉(zhuǎn)錄激活因子，可激活TNF-α、IL-1β 和IL-6 等促炎細(xì)胞因子［34］。TNF-α 能激活非鈣離子依賴PLA2（iPLA2）而引起花生四烯酸釋放并引起缺血后心動過速，在心肌纖維化的發(fā)病過程中，花生四烯酸代謝作為其潛在研究通路，發(fā)揮著重要的作用［35］。MAPKs 信號通路能介導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化、凋亡等，參與了多種心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展過程［36］。本研究結(jié)果顯示心舒寶片可能通過調(diào)控NF-κB 信號通路、MAPK 信號通路、花生四烯酸代謝、Ras 信號通路、cAMP 信號通路等發(fā)揮著多途徑治療心梗的作用。

綜上，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合的方式，對心舒寶片治療心梗的潛在靶點(diǎn)及通路進(jìn)行分析和驗(yàn)證，系統(tǒng)闡釋了心舒寶片治療心?？赡艿淖饔脵C(jī)制，為心舒寶片的臨床價值定位和應(yīng)用提供了新的依據(jù)和參考。